Methodenartikel

Dreidimensionale Bildgebung Nozizeptive Intraepidermale Nervenfasern im menschlichen Hautproben

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DOI:

10.3791/50331

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29. April 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, University of Michigan , 2Department of Internal Medicine, University of Michigan

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Um die Änderungen des nozizeptiven intraepidermal Nervenfasern (IENFs) in schmerzhafte Neuropathie (PN) zu untersuchen, haben wir Protokolle, die direkt untersuchen könnte dreidimensionalen morphologischen Veränderungen in nozizeptiven IENFs beobachtet. Dreidimensionale Analyse IENFs hat das Potenzial, um die morphologischen Veränderungen in IENF PN bewerten.

Zusammenfassung

Ein Schlag Biopsie der Haut wird üblicherweise zur intraepidermal Nervenfaser Dichten (IENFD) für die Diagnose der periphere Polyneuropathie 1,2 quantifizieren. Derzeit ist es üblich, 3 mm Hautproben von dem distalen Schenkel (DL) und dem proximalen Schenkel (PT) für die Bewertung der längenabhängigen Polyneuropathien 3 sammeln. Aufgrund der multidirektionalen Art IENFs, ist es schwierig zu prüfen überlappenden Nervenstrukturen durch die Analyse von zweidimensionalen (2D-) Bildgebung. Alternativ könnte dreidimensionale (3D)-Bildgebung eine bessere Lösung für dieses Dilemma.

Im vorliegenden Bericht stellen wir Methoden für die Anwendung 3D-Bildgebung zu schmerzhaften Neuropathie (PN) zu studieren. Um IENFs zu identifizieren, werden Hautproben für Immunfluoreszenz-Analyse von Protein-Genprodukt 9.5 (PGP), ein pan-neuronalen Marker verarbeitet. Derzeit ist es üblich, kleine Faser Neuropathie mit IENFD abschrecken diagnostizierenabgebaut durch PGP Immunhistochemie mit Hellfeldmikroskopie 4. In der aktuellen Studie, angewendet wir doppelte Immunfluoreszenz Analyse insgesamt IENFD identifizieren, die mit PGP und nozizeptiven IENF, durch den Einsatz von Antikörpern, die Tropomyosin-Rezeptor-Kinase erkennen A (Trk A), die hohe Affinität Rezeptor für nerve growth factor 5. Die Vorteile der Co-Färbung IENF mit PGP und Trk A-Antikörper profitiert die Studie von PN deutlich Färbung PGP-positive, nozizeptiven Fasern. Diese fluoreszierenden Signale quantifiziert nozizeptiven IENFD und morphologische Veränderungen von IENF mit PN assoziiert zu bestimmen. Die Fluoreszenzbilder werden durch konfokale Mikroskopie erfasst und verarbeitet, für die 3D-Analyse. 3D-Bildgebung liefert Dreh-Fähigkeiten weiter zu analysieren morphologische Veränderungen mit PN verbunden. Zusammengenommen fluoreszierenden Co-Färbung, konfokale Bildgebung und 3D-Analyse eindeutig profitieren die Studie von PN.

Einleitung

Derzeit ist es üblich, für Ärzte, intraepidermalen Nervenfaser Dichten (IENFD) von der Haut Stanzbiopsien, die verwendet werden, um kleine Faser Neuropathie 3, 6-8 diagnostizieren kann quantifizieren. Biopsien aus dem distalen Schenkel (DL), 10 cm über den Malleolus lateralis und den proximalen Schenkel (PT), 20 cm unterhalb der Spina iliaca anterior 9. Alle IENF sind beschriftet mit Protein-Genprodukt 9.5 (PGP), ein pan-neuronalen Marker 10-12. Derzeit ist es üblich, kleine Faser mit Neuropathien diagnostizieren IENFD bestimmt durch Färbung mit PGP Hellfeldmikroskopie 6. Darüber hinaus haben mehrere Arbeitsgruppen Immunfluoreszenz Protokolle für PGP Immunhistochemie 7-9 verwendet. Kleine Faser Neuropathie ist häufig mit neuropathischen Schmerzen verbunden. Zur weiteren Verständnis der Rolle von IENF wichtig für Schmerzen Verarbeitung, entwickelten wir eine Technik, um Co-Label insgesamt IENF mit Fasern, die Schmerzen zu erzeugen. Nozizeptorentive IENF, speziell A &dgr; und C-Fasern, durch die Co-Kennzeichnung IENF mit PGP und des nozizeptiven Marker, Tropomyosin-Rezeptor-Kinase A (Trk A) 5 untersucht werden. Trk A ist der Rezeptor mit hoher Affinität für NGF, die für die Entwicklung der Nozizeption ist. Die Trk A-positive nozizeptiven Nervenfasern sind peptiderge Fasern, express Substanz P (SP) und Calcitonin Gene Related Peptide (CGRP). Zuvor angewendet Lauria und Kollegen der doppelten Kennzeichnung Technik PN, Co-Kennzeichnung PGP-positive IENF mit einer nozizeptiven Markierung 10 zu studieren. In unserer früheren Studie haben wir gezeigt, dass Trk A-positive IENF, aber nicht Trk A-negative IENF, in einem Tiermodell der schmerzhaften diabetischen Neuropathie 5 wurden hochreguliert. Diese Co-Kennzeichnung Technik bietet die Möglichkeit, die Quantifizierung von nozizeptiven IENFD vergleichen, um IENFD und die Fähigkeit zur morphologischen Veränderungen mit PN zugeordnet studieren insgesamt. Die Fähigkeit, nozizeptiven IENF und Unternehmen visualisierenre Quantifizierung der gesamten IENFD zu nozizeptiven IENFD könnte Ziel Beweis für das Vorhandensein von Schmerz und möglicherweise Einblick in die Schwere der Schmerzen mit PN assoziiert ist. Diese Technik ist auch auf die Haut von Tiermodellen. Im Vergleich zu früheren Studien, beschreibt das aktuelle Protokoll Methoden zur 3D-Bildanalyse, die Schaffung der Möglichkeit, Fehler, die in 2D Bildanalyse auftreten könnten, zu vermeiden.

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Protokoll

Teil A: Immunhistochemie

Herstellung von 96-Well-Platte und Prävention von Hintergrundfärbung Durchschlag Hautproben von menschlichen Probanden gesammelt und inkubiert für 12-24 Stunden in Fixierlösung (2% Paraformaldehyd mit 0,75 M L-Lysin-Lösung (pH 7,4) und 0,05 mM Natriumperiodat) bei 4 ° C wie zuvor 8 beschrieben. Die Proben werden dann in Phosphat kryogeschützt Kochsalzlösung (PBS) mit 20% Glycerin bei 4 ° C für bis zu 1 Woche, eingebettet in Eindeckmitteln optimale Schnittleistung Temperatur (OCT), dann im Schnitt in 50 um dicke Schnitte auf einem Kryostaten. Die unten beschriebenen Protokoll wird 8 Hautpartien, wird die maximale Anzahl von Hautpartien möglich, frei schwebenden Immunhistochemie in eine 96-Well-Platte zu unterziehen.

TAG 1:

1. Prävention von nicht-spezifische Immunreaktivität in der Hornschicht

  1. Label-96-Well-Platte, wie in 1 gezeigt.
  2. In 150 ul Bild-IT FX Signal (Bild-IT), wirksam zu blockieren Hintergrundfärbung 11,12, in jede Vertiefung in Reihe 1 der 96-Well-Platte.
  3. In 150 ul 1X PBS in jedes Well in Reihe 2 und 3 der 96-Well-Platte.
  4. Erwerben Sie zwei 50 um Abschnitte pro Patient: ein Abschnitt aus der Biopsie bei DL genommen, einen Abschnitt aus der Biopsie bei PT gemacht. Eine Impföse (LeLoop) wird verwendet, um Abschnitte von einem übertragen spülen, um die nächste zu morphologischen Schäden zu vermeiden. Sanft übertragen jede 50 um Abschnitt, mittels Impföse, zu einem individuellen und von Reihe 1, mit Bild-IT. Inkubieren Abschnitte in Bild-IT für 30 min bei RT auf einem flachen Rocker.
  5. Spülen Abschnitte zweimal mit 1 × PBS (Zeilen 2 und 3) für 10 min bei RT. Zeigen Well-Platte auf einer flachen Rocker zwischen Spülungen.

2. Herstellung von 5% BSA Blocking Solution und 1% Spüllösung

  1. Während Biopsie Abschnitte in Bild-IT sind Inkubation, bereiten 5% Blocking Lösungtion (5% BSA, 0,3% TX-100, 0,1 M PBS-Vortex-Lösung bis BSA vollständig auflöst).
  2. In 150 ul 5% BSA Blocking-Lösung in jedes Well der Reihe 4.
  3. Mit einer Impföse übertragen Abschnitte in einzelnen Vertiefungen von 5% BSA-Lösung blockiert. Inkubieren Abschnitte in 5% BSA Blocking-Lösung für 1-2 h bei RT auf einem flachen Rocker.

3. Herstellung von 1% BSA Spüllösung und Verdünnung des primären Antikörper

  1. Während Teile in 5% BSA Blockierungslösung inkubiert werden, bereiten 1% Spüllösung (1% BSA, 0,3% TX-100, 0,1 M PBS-Lösung bis Vortex BSA vollständig auflöst).
  2. Während Teile in 5% BSA-Lösung blockiert Inkubation, verdünnte Primärantikörper in 1% Spüllösung.
    1. Für acht Abschnitte (8 x 150 = 1.200 ul ul) insgesamt 1.200 ul benötigt wird. Die primären Antikörper werden in 1.500 ul (etwa 20% mehr Volumen) gemacht.
    2. Verdünnungen der Primärantikörper: PGP, 1:500; Trk A,1:500 in 1% BSA Spüllösung.

4. Inkubation von Sectioned Biopsien in primärer Antikörper

  1. In 150 ul verdünnten Primärantikörper in die dafür vorgesehenen Vertiefungen der 96-Well-Platte (Zeile 5).
  2. Übertragen von Abschnitten 5% Blockierungslösung (Zeile 4) in die dafür vorgesehenen Vertiefungen primären Antikörper (Reihe 5).
  3. Verschließen Sie die 96-Well-Platte mit Parafilm und Alufolie ein Austrocknen zu verhindern und Belichtung.
  4. Inkubieren Sie die 96-Well-Platte O / N bei 4 ° C auf einem flachen Rocker.

TAG 2:

5. Spülen Biopsien in 1% BSA Spüllösung

  1. In 150 ul 1% BSA Spüllösung in jede Vertiefung in Reihe 6, 7 und 8.
  2. Spülen Abschnitte dreimal mit 1% BSA Spüllösung (Zeilen 6, 7 und 8) für 1 Stunde jedesmal bei RT gerührt. Titelbild Well-Platte mit Aluminiumfolie und auf flachen Rocker zwischen Spülungen.

6. Verdünnung der Sekundärantikörper

  1. Während Teile in der letzten von 1% BSA Spüllösung spülen (Zeile 8) inkubiert, verdünnt Sekundärantikörper in 1% BSA Spüllösung:
    1. Für acht Abschnitte (8 x 150 = 1.200 ul ul) insgesamt 1.200 ul benötigt wird. Die sekundären Antikörper sind bis in 1.500 ul (etwa 20% mehr Volumen) gemacht.
    2. Verdünnungen der sekundären Antikörper: für PGP (Alexa Fluor 488 Esel-anti-Kaninchen, 1:250), für Trk A (Alexa Fluor 647 Esel-anti-Ziege, 1:250) in 1% BSA Spüllösung.

7. Inkubation von Sectioned Biopsien in sekundären Antikörper

  1. In 150 ul verdünnten Sekundärantikörper in ihr bezeichneten Vertiefungen der 96-Well-Platte (Zeile 9).
  2. Übertragen Abschnitte von 1% BSA Blocking-Lösung (Reihe 8) in sekundären Antikörper gut (Zeile 9).
  3. Verschließen Sie die 96-Well-Platte mit Parafilm und Alufolie ein Austrocknen zu verhindern und Belichtung.
  4. Inkubieren Abschnitte in dem bezeichneten Sekundärantikörper O/ N bei 4 ° C auf einem flachen Rocker.

8. Spülen Biopsien in 1% BSA Spüllösung

  1. In 150 ul 1% BSA Spüllösung in jede Vertiefung in Reihe 10, 11 und 12.
  2. Spülen Abschnitte dreimal mit 1% BSA Spüllösung (Reihen 10, 11 und 12) für 1 Stunde jedesmal bei RT gerührt. Titelbild Well-Platte mit Aluminiumfolie und auf einem flachen Rocker zwischen Spülungen.

9. Vorbereitung von Objektträgern und Montage Sectioned Biopsien

  1. Während Biopsie Abschnitte in der letzten von 1% BSA Spüllösung (Zeile 12) spülen sind Inkubieren, bereiten Objektträger.
  2. Zeigen 50 ul 1% BSA Spüllösung auf einer Folie zu einer Zeit.
  3. Entfernen Abschnitte von 1% BSA Spüllösung (Reihe 12), und legen Sie es in den 50 ul Tropfen 1% BSA Spüllösung auf dem designierten Objektträger. Nach der Optimierung der Position des Abschnitts, überschüssige 1% BSA Spüllösung mit einem wulstförmigen Glaspipette, wobei Vorkehrungenzu vermeiden, berühren Sie die Probe.

HINWEIS: Vergewissern Sie Abschnitt nicht umgeklappt; die Probe sollte gegen die Oberfläche des Objektträgers flach.

  1. Platz 1 Tropfen verlängern Gold-antifade Montage Reagenz mit DAPI in der Nähe der Biopsie auf dem Objektträger. Werfen Sie einen 22x22 mm Mikroskop Deckglas und legen Sie sie vorsichtig über Biopsie und ein Tropfen verlängern Gold-antifade Reagenz mit DAPI Drop. Wiederholen Sie für jeden Abschnitt.
  2. Lassen Objektträger trocken O / N bei RT im Dunkeln.

HINWEIS: Entfernen Sie alle Luftblasen mit einer Pipettenspitze. Überschüssiges verlängern Gold-antifade Reagenz.

Teil B: konfokale Bildgebung

10. Konfokalen Imaging

  1. Bild Fluoreszenz-Signale mit einer Olympus FluoView 500 konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop mit einem 40x Öl-Immersions-(1.3 NA) Ziel-und Zoom zweimal mit FluoView Version 5.0 Software.
  2. Verwenden Alexa Fluor 488 und Alexa Fluor 647, die 543-nm HeNe grünen Laser und 633-nm HeNe Red Laser bzw. anzuregen. Die Alexa Fluor 488 Signal wird durch einen grünen Nachschlagetabelle (LUT) und dem Alexa Fluor 647 von einem roten LUT dargestellt.
  3. Stellen Sie die konfokale Öffnungen für jeden Detektor bei 400 um, um Signale zu verstärken. Sequential Scans sollten bei einer Auflösung von 1.024 x 1.024, um das Signal zu maximieren Trennung getroffen werden.
  4. Erfassen dreidimensionaler z-Serie mit 1,2 um z-Schrittweiten (bezogen auf die optimale Scan-Einheit durch die Software berechnet FluoView) mit Kalman Mittelung (zwei Rahmen).

Teil C: Dreidimensionale Visualisierung und Animation

11. Dreidimensionale (3D) Visualisierung und Animation

  1. Offene FluoView Dateien in Imaris x64-Software (Version 7.3, Bitplane AG) zur Visualisierung der 3D-Bild-Sets.
  2. Passen Sie bei Bedarf angezeigt werden, um den Kontrast des Nervs spezifisches Signal zu verbessern.
  3. Erstellen Sie einen surface die dermo-epidermalen Grenze zu visualisieren. Verwenden Sie das Tool in Contour Auslosung Modus, um die Grenze zu ziehen.
  4. Zuweisen einer halbtransparenten Oberfläche zu der Grenze, um die zugrunde liegenden Fluoreszenzsignale anzusehen.
  5. Standbilder der 3D-Fluoreszenz-Signale an Snapshot Bilder der 3D-Film zu erstellen.
  6. Verwenden Sie die Animation, Funktion, um einen 3D-Film zu erstellen. Die Bilder können gedreht werden 360 Grad mehrmals, jedes Signal getrennt und fusionierte zeigen (Abbildungen 2, 3 und 4). Set Animation, Filme, bestehend aus 200 Bildern bei 15 Bildern pro Sekunde animiert erstellen. Speichern Sie jeden Film als AVI-Datei roh.
  7. Komprimieren Sie die endgültige AVI-Film mit VirtualDub-Software (Version 1.9.4).

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Ergebnisse

Dabei haben wir das aktuelle Protokoll, um die Morphologie der IENF in PT und DL Hautbiopsien von Patienten mit PN studieren. Die Haut, aus drei Themen, wurde an der Universität von Utah gesammelt, um die Pathomorphologie mit PN zugeordnet demonstrieren. Die Themen umfassen: Fall 1: ein 51-jähriger Mann mit einer Geschichte von PN von Diabetes Typ 2 (Dauer: 14 Monate; Schmerz-Score: 51); Fall 2: ein 56-jähriger Mann mit einer Geschichte von PN von Diabetes Typ 2 (Dauer: 108 Monate; Schmerz-Score: 47) und Fall 3: ein 66-...

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Diskussion

Messung der IENFD wurde weithin verwendet, um den Grad von peripheren Neuropathien 13,14 bestimmen. Derzeit ist die am häufigsten verwendete Protokoll misst nur die Dichten von Nervenfasern, die die Basalmembran der Epidermis eindringen, es nicht zu berücksichtigen axonale Verzweigung und / oder morphologische Veränderungen der Nerven. Darüber hinaus hat IENFD aktuellen Analyse nicht gezeigt worden, um mit dem Vorhandensein von Schmerzen in PN 15 IENFD korrelieren.

Wir ...

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Offenlegungen

Interessenkonflikte zu erklären.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health unterstützt Grants K08 NS061039-01A2, das Programm für Neurologie Research & Discovery, and The A. Alfred Taubman Medical Research Institute an der University of Michigan. Diese Arbeit verwendet die Morphologie und Bildanalyse Kern der Michigan Diabetes Research and Training Center, National Institutes of Health Grants 5P90 DK-20572 aus dem National Institute of Diabetes and Digestive und Nierenkrankheiten finanziert. Die Autoren bedanken sich bei Robinson Singleton und Gordon Smith (University of Utah) für die großzügige Spende von menschlichen Hautproben, die anfängliche Entwicklung des nozizeptiven Biomarker Immunhistochemie Technik unterstützt danken.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10X PBSFisher ScientificBP399-4Zur Herstellung von 1X PBS
Image-IT FX SignalInvitrogenI36933Image-IT
Protein Gene Product 9.5 (Polyklonales Kaninchen)AbD Serotec7863-0504PGP
Tropomyosin Related-Kinase A (Polyklonale Ziege)R& D SystemsAF1056Trk A
Alexa Fluor 488 Esel α-KaninchenInvitrogenA21206AF488 Esel α-Ziege
Alexa Fluor 647 Esel α-ZiegeInvitrogenA21447AF647 Esel α-Ziege
Albumin, aus RinderserumSigma-AldrichA7906-100BSA
Triton X- 100Sigma-AldrichT9284TX-100
Nicht kalibrierte LoopLeLoopMP 199025inokulierende Loop
96-Well-Assay-PlatteCorning Incorporated3603Well Plate
Prolong Gold Antifading-Reagenz mit DAPIInvitrogenP36931DAPI
Mikroskop Deckglas 22x22 mmFisher Scientific12-541-BDeckgläser
Superfrost Plus ObjektträgerFisher Scientific12-550-15Objektträger
Olympus Fluoview Laser Scanning Konfokales MikroskopOlympusFV500Konfokales Mikroskop
Optimale SchnitttemperaturSakura4583OCT
Leica KryostatLeicaCM1850Kryostat

Referenzen

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Schlagwörter

Konfokale MikroskopieImmunfluoreszenzanalyseProtein Gene Product 9 5Tropomyosin Rezeptor Kinase Anozizeptiver BiomarkerHautbiopsie Schnittemorphologische Ver nderungenschmerzhafte Neuropathie

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