Dreidimensionale Bildgebung Nozizeptive Intraepidermale Nervenfasern im menschlichen Hautproben

Zusammenfassung

Um die Änderungen des nozizeptiven intraepidermal Nervenfasern (IENFs) in schmerzhafte Neuropathie (PN) zu untersuchen, haben wir Protokolle, die direkt untersuchen könnte dreidimensionalen morphologischen Veränderungen in nozizeptiven IENFs beobachtet. Dreidimensionale Analyse IENFs hat das Potenzial, um die morphologischen Veränderungen in IENF PN bewerten.

Zusammenfassung

Ein Schlag Biopsie der Haut wird üblicherweise zur intraepidermal Nervenfaser Dichten (IENFD) für die Diagnose der periphere Polyneuropathie ^1,2 quantifizieren. Derzeit ist es üblich, 3 mm Hautproben von dem distalen Schenkel (DL) und dem proximalen Schenkel (PT) für die Bewertung der längenabhängigen Polyneuropathien ³ sammeln. Aufgrund der multidirektionalen Art IENFs, ist es schwierig zu prüfen überlappenden Nervenstrukturen durch die Analyse von zweidimensionalen (2D-) Bildgebung. Alternativ könnte dreidimensionale (3D)-Bildgebung eine bessere Lösung für dieses Dilemma.

Im vorliegenden Bericht stellen wir Methoden für die Anwendung 3D-Bildgebung zu schmerzhaften Neuropathie (PN) zu studieren. Um IENFs zu identifizieren, werden Hautproben für Immunfluoreszenz-Analyse von Protein-Genprodukt 9.5 (PGP), ein pan-neuronalen Marker verarbeitet. Derzeit ist es üblich, kleine Faser Neuropathie mit IENFD abschrecken diagnostizierenabgebaut durch PGP Immunhistochemie mit Hellfeldmikroskopie ^4. In der aktuellen Studie, angewendet wir doppelte Immunfluoreszenz Analyse insgesamt IENFD identifizieren, die mit PGP und nozizeptiven IENF, durch den Einsatz von Antikörpern, die Tropomyosin-Rezeptor-Kinase erkennen A (Trk A), die hohe Affinität Rezeptor für nerve growth factor ^5. Die Vorteile der Co-Färbung IENF mit PGP und Trk A-Antikörper profitiert die Studie von PN deutlich Färbung PGP-positive, nozizeptiven Fasern. Diese fluoreszierenden Signale quantifiziert nozizeptiven IENFD und morphologische Veränderungen von IENF mit PN assoziiert zu bestimmen. Die Fluoreszenzbilder werden durch konfokale Mikroskopie erfasst und verarbeitet, für die 3D-Analyse. 3D-Bildgebung liefert Dreh-Fähigkeiten weiter zu analysieren morphologische Veränderungen mit PN verbunden. Zusammengenommen fluoreszierenden Co-Färbung, konfokale Bildgebung und 3D-Analyse eindeutig profitieren die Studie von PN.

Einleitung

Derzeit ist es üblich, für Ärzte, intraepidermalen Nervenfaser Dichten (IENFD) von der Haut Stanzbiopsien, die verwendet werden, um kleine Faser Neuropathie ^{3, 6-8} diagnostizieren kann quantifizieren. Biopsien aus dem distalen Schenkel (DL), 10 cm über den Malleolus lateralis und den proximalen Schenkel (PT), 20 cm unterhalb der Spina iliaca anterior ^9. Alle IENF sind beschriftet mit Protein-Genprodukt 9.5 (PGP), ein pan-neuronalen Marker ^10-12. Derzeit ist es üblich, kleine Faser mit Neuropathien diagnostizieren IENFD bestimmt durch Färbung mit PGP Hellfeldmikroskopie ^6. Darüber hinaus haben mehrere Arbeitsgruppen Immunflu....

Protokoll

Teil A: Immunhistochemie

Herstellung von 96-Well-Platte und Prävention von Hintergrundfärbung Durchschlag Hautproben von menschlichen Probanden gesammelt und inkubiert für 12-24 Stunden in Fixierlösung (2% Paraformaldehyd mit 0,75 M L-Lysin-Lösung (pH 7,4) und 0,05 mM Natriumperiodat) bei 4 ° C wie zuvor ⁸ beschrieben. Die Proben werden dann in Phosphat kryogeschützt Kochsalzlösung (PBS) mit 20% Glycerin bei 4 ° C für bis zu 1 Woche, eingebettet in Eindeckmitteln optimale Schnittleistung Temperatur (OCT), dann im Schnitt in 50 um dicke Schnitte auf einem Kryostaten. Die unten beschriebenen Protokoll wird 8 Hautpartien, wird die ma....

Ergebnisse

Dabei haben wir das aktuelle Protokoll, um die Morphologie der IENF in PT und DL Hautbiopsien von Patienten mit PN studieren. Die Haut, aus drei Themen, wurde an der Universität von Utah gesammelt, um die Pathomorphologie mit PN zugeordnet demonstrieren. Die Themen umfassen: Fall 1: ein 51-jähriger Mann mit einer Geschichte von PN von Diabetes Typ 2 (Dauer: 14 Monate; Schmerz-Score: 51); Fall 2: ein 56-jähriger Mann mit einer Geschichte von PN von Diabetes Typ 2 (Dauer: 108 Monate; Schmerz-Score: 47) und Fall 3: ein 66-.......

Diskussion

Messung der IENFD wurde weithin verwendet, um den Grad von peripheren Neuropathien ^13,14 bestimmen. Derzeit ist die am häufigsten verwendete Protokoll misst nur die Dichten von Nervenfasern, die die Basalmembran der Epidermis eindringen, es nicht zu berücksichtigen axonale Verzweigung und / oder morphologische Veränderungen der Nerven. Darüber hinaus hat IENFD aktuellen Analyse nicht gezeigt worden, um mit dem Vorhandensein von Schmerzen in PN ¹⁵ IENFD korrelieren.

Wir .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10X PBS	Fisher Scientific	BP399-4	Zur Herstellung von 1X PBS
Image-IT FX Signal	Invitrogen	I36933	Image-IT
Protein Gene Product 9.5 (Polyklonales Kaninchen)	AbD Serotec	7863-0504	PGP
Tropomyosin Related-Kinase A (Polyklonale Ziege)	R& D Systems	AF1056	Trk A
Alexa Fluor 488 Esel α-Kaninchen	Invitrogen	A21206	AF488 Esel α-Ziege
Alexa Fluor 647 Esel α-Ziege	Invitrogen	A21447	AF647 Esel α-Ziege
Albumin, aus Rinderserum	Sigma-Aldrich	A7906-100	BSA
Triton X- 100	Sigma-Aldrich	T9284	TX-100
Nicht kalibrierte Loop	LeLoop	MP 199025	inokulierende Loop
96-Well-Assay-Platte	Corning Incorporated	3603	Well Plate
Prolong Gold Antifading-Reagenz mit DAPI	Invitrogen	P36931	DAPI
Mikroskop Deckglas 22x22 mm	Fisher Scientific	12-541-B	Deckgläser
Superfrost Plus Objektträger	Fisher Scientific	12-550-15	Objektträger
Olympus Fluoview Laser Scanning Konfokales Mikroskop	Olympus	FV500	Konfokales Mikroskop
Optimale Schnitttemperatur	Sakura	4583	OCT
Leica Kryostat	Leica	CM1850	Kryostat