Mess-intrazellulären Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Änderungen in menschlichen Spermien mit vier Techniken: Konventionelle Fluorometrie, Stopped Flußfluorometrie, Durchflusszytometrie und Single Cell Imaging

Zusammenfassung

Intrazelluläre Ca ^{2 +} Dynamik sind sehr wichtig in Spermien Physiologie und Ca ^{2 +} Fluoreszenzfarbstoffe bilden ein vielseitiges Werkzeug, um sie zu studieren. Bevölkerung Experimente (Fluorometrie und gestoppt Flußfluorometrie) und einzelne Zelle Experimente (Durchflusszytometrie und Single-Cell-Imaging) verwendet werden, um räumlich-zeitliche [Ca verfolgen ^{2 +}] Veränderungen im menschlichen Spermien.

Zusammenfassung

Spermien sind männliche Keimzellen speziell entwickelt, um zu erreichen, zu erkennen und verschmelzen mit dem Ei. Um diese Aufgaben zu erfüllen, müssen Spermien bereit, eine sich ständig wandelnden Umfeld zu stellen und mehrere physische Barrieren überwunden werden. Sein Wesen in transkriptionell und translational still, verlassen sich diese bewegliche Zellen zutiefst auf verschiedenen Signal-Mechanismen, sich zu orientieren und schwimmen in einer gerichteten Weise und mit schwierigen Umgebungsbedingungen während ihrer Reise, um das Ei zu finden kämpfen. Insbesondere ist Ca ^{2 +-vermittelten} Signale entscheidend für mehrere Spermien Funktionen: Aktivierung der Motilität, capacitation (ein komplexer Prozess, die Spermien für die Akrosomreaktion bereitet) und der Akrosomreaktion (ein Ereignis, das exozytotische Spermien-Ei-Fusion ermöglicht). Der Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen, um intrazelluläre Schwankungen dieses Ions zu verfolgen ist von bemerkenswerter Bedeutung aufgrund ihrer einfachen Anwendung, Empfindlichkeit und Vielseitigkeit detection. Mit einem einzigen Farbstoff-loading-Protokoll nutzen wir vier verschiedene Techniken, um Spermien fluorometrische Ca ^{2 +} Dynamik überwachen. Jede Technik liefert verschiedene Informationen, die räumliche und / oder zeitliche Auflösung ermöglicht, die Erzeugung von Daten sowohl auf einzelne Zelle und Zellpopulation Ebenen.

Einleitung

Ca ^{2 +} ist ein universelles second messenger von Signaltransduktionswegen in eukaryotischen Zellen. Intrazelluläre Ca ^{2 +} (Ca ^{2 +} _i) ist an der Regulation vieler grundlegenden physiologischen Prozesse in beide erregbaren und nicht erregbaren Zellen. Die Bedeutung und die Universalität der Ca ^{2 +} als second messenger während Signaltransduktion von seiner räumlich-zeitlichen Vielseitigkeit bei der Übertragung von Informationen in der Zelle ab. Während Ca ^{2 +} nicht de novo oder abgebaut innerhalb der Zelle, dessen intrazelluläre Konzentration ^{([Ca2 +]} _i) synthetisiert werden....

Protokoll

In diesem Beitrag berichten wir über die Verwendung der vier oben genannten Techniken zu messen [Ca ^{2 +]} _i Veränderungen im menschlichen Spermien. Wir verwendeten Progesteron einen Ca ^{2 +-Antwort} auslösen, wie es üblich ist, dass dieses Steroid einen transienten [Ca ^{2 +]} _i in Spermien erhöhen produziert. Insbesondere in menschlichen Spermien, Progesteron direkt aktiviert einen Ca ^{2 +-Kanals} (nämlich CatSper) ausgedrückt ausschließlich in der Plasmamembran von Samenzellen ^10,11. Wir haben auch gemessen Ruhestätte [Ca ^{2 +]} _i vor und nach capacitation gegeben, dass es auch....

Ergebnisse

Abbildung 1. Schematische Darstellung des experimentellen Protokolls für die Spermien Probenvorbereitung von der Swim-up-Methode. Die wichtigsten Schritte für die Trennung der beweglichen Spermien und zur Anpassung ihrer Konzentration dargestellt. Der letzte Schritt der Inkubation wird nur durchgeführt, wenn capacita.......

Diskussion

Intrazelluläre Signalwege ist von entscheidender Bedeutung für die meisten zellulären Aktivitäten; Ca ^{2 +} ist ein allgegenwärtiges Bote, Säugerzellen begleitet während ihrer gesamten Lebensdauer, von ihrem Ursprung bei der Befruchtung, bis zum Ende ihres Lebenszyklus. In Reaktion auf verschiedene Stimuli, [Ca ^{2 +]} i zunimmt, schwingt und nimmt mit raumzeitliche Codierung, dementsprechend, diverse Prozesse aktiviert, moduliert oder terminiert durch Ca ^{2 +-codierten} Nachrichten. Intrazellu.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ham's F-10	Sigma-Aldrich	N-6013
Rinderserumalbumin	Sigma-Aldrich	A-7906
Calciumchlorid-Dihydrat ca. 99%	Sigma-Aldrich	C-3881
Makler Zählkammer	SEFI Medical Insruments LTD	SEF-MAKL
Fluo-3 AM	Invitrogen	F-1242	20 Fläschchen/50 μ g je
Ionomycin	Alomon	I-700
Progesteron	Sigma-Aldrich	P0130
Natriumchlorid	Sigma-Aldrich	S-9888	Reagenzien für menschliches Spermienmedium (HSM)
Kaliumchlorid	Sigma-Aldrich	P-3911	Reagenzien für menschliches Spermienmedium (HSM)
Natriumbicarbonat	JT Baker	3506	Reagenzien für humanes Spermienmedium (HSM)
Magnesiumchlorid	Sigma-Aldrich	M-2670	Reagenzien für menschliches Spermienmedium (HSM)
Calciumchlorid wasserfrei	Sigma-Aldrich	C-1016	Reagenzien für menschliches Spermienmedium (HSM)
HEPES	Sigma-Aldrich	H-3125	Reagenzien für menschliches Spermienmedium (HSM)
D-Glucose	JT Baker	1906-01	Reagenzien für menschliches Sperma Medium (HSM)
Natriumpyruvat	Sigma-Aldrich	P-2256	Reagenzien für humanes Spermienmedium (HSM)
Natrium-L-lactat (ca. 99%)	Sigma-Aldrich	L-7022	Reagenzien für humanes Spermienmedium (HSM)
Propidiumiodid	Invitrogen	L-7011	Komponente B
Triton X-100 (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol)	Sigma-Aldrich	X-100	2,4 mM Lösung in Wasser
Rundes Deckglas	VWR	48380 080	25 mm Durchmesser
Poly-L-Lysin-Lösung	Sigma-Aldrich	P8920
Manganchlorid	Sigma-Aldrich	M-3634
Attofluor; Zellkammer, für Mikroskopie	Life technologies	A-7816
Dimethylsulfoxid	Sigma-Aldrich	D2650	5x5 ml