In diesem Beitrag stellen wir eine Methode, um Tumormikrogefäßen in vivo Analyse mit dynamischen Kontrastmittel-Fluoreszenz-Videomikroskopie. Zwei quantitative Parameter wurden erworben: funktionelle Kapillardichte was die Durchblutung des Tumors und Leckage Index spiegelt die Undichtigkeit der endothelialen Wand.
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Methodenartikel
In-vivo-Imaging der Tumorangiogenese mit Fluoreszenz-Videomikroskopie Konfokale
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Fibered konfokalen Fluoreszenz in-vivo-Bildgebung mit einem Faseroptikbündel verwendet das gleiche Prinzip wie Fluoreszenz konfokalen Mikroskopie. Es kann Fluoreszenz-in situ-Elemente durch die optischen Fasern zu erregen, und dann erfassen einige der emittierten Photonen, über den gleichen optischen Fasern. Die Lichtquelle ist ein Laser, der das Anregungslicht durch ein Element innerhalb des Faserbündels sendet und wie es über die Probe scannt, erstellt ein Bild Pixel für Pixel. Da diese Überprüfung ist sehr schnell, indem sie mit speziellen Bildverarbeitungssoftware können die Bilder in Echtzeit mit einer Frequenz von 12 Bildern / sec erhalten werden.
Wir entwickelten eine Technik, um quantitativ zu charakterisieren Kapillare Morphologie und Funktion mit einem konfokalen Fluoreszenz-Videomikroskopie Gerät. Der erste Schritt in unserem Experiment wurde auf 5 sec Filme aufnehmen in den vier Quadranten des Tumors, die kapillare Netzwerk visualisieren. Alle Filme wurden mit einer Software verarbeitet (ImageCell, Mauna Kea Technologie, Paris), die eine automatische Segmentierung von Schiffen zu einem gewählten Durchmesser (10 um in unserem Fall) führt. So konnten wir die funktionalen Kapillardichte ", die das Verhältnis zwischen der gesamten Gefäßfläche und der Gesamtfläche des Bildes zu quantifizieren. Dieser Parameter war ein Surrogatmarker für die mikrovaskuläre Dichte, mit der Pathologie Tools in der Regel gemessen.
Der zweite Schritt war, um Filme des Tumors aufnehmen über 20 Minuten, um ein Auslaufen der makromolekularen Kontrastmittel durch die Kapillarwand in das Interstitium zu quantifizieren. Durch Messung des Verhältnisses der Signalintensität im Interstitium gegenüber der in den Behältern wurde eine Index Leckage "erhalten wird, als Surrogatmarker für die Durchlässigkeit der Kapillaren wirkt.
Einleitung
Angiogenese ist ein komplexer Prozess 1, die die Bildung neuer Blutgefäße aus bereits vorhandenen Fahrzeugen beinhaltet. Pathologische Veränderungen im Gewebe Mikrozirkulation, von Arteriolen, Kapillaren und Venen besteht, sind in einer großen Palette von Krankheiten, wie Krebs, Entzündungen oder Diabetes in Verbindung gebracht. Es ist daher wichtig, Methoden zu quantitativ beurteilen Mikrogefäßstruktur und-funktion zu entwickeln. Bildgebung ermöglicht die Untersuchung von Mikrogefäßen in einem nicht-oder mikroinvasive Weise in Echtzeit und in vivo und wiederholten Messungen im Laufe der Zeit in dem gleichen Tier 2.
Derzeit wird die dynamische kontrastverstärkte (DCE) Bild 3 häufig verwendet, um Gewebe-Mikrozirkulation zu beurteilen. Dynamischen kontrastverstärkten Bildgebung ist eine Technik, die im Laufe der Zeit die Bioverteilung eines Tracers intravenös injiziert folgt. Von dieser Übernahme kann quantitative Parameter extrahiert reflektierende Gewebe Gefäß werden. DCE-Bildgebungwurde am häufigsten mit CT, MRT oder Ultraschall verwendet werden. Allerdings sind diese bildgebenden Verfahren nicht zulassen, dass die direkte Betrachtung der Mikrogefäße, da ihre Auflösung, anders als bei der Verwendung von bestimmten experimentelle Geräte bleibt meist makroskopische.
In diesem Papier, schlagen wir vor, das Gefäßsystem des Tumors auf der mikroskopischen Skala und in vivo-Studie mit dynamischen kontrastverstärkten optischen Bildgebung, mit fibered konfokalen Videomikroskopie. Wir verwendeten eine makromolekulare Kontrastmittel (FITC-Dextran), die ausschließlich in Behältern oder Lecks durch die endotheliale Schranke in das Interstitium bleibt, nach seinem Molekulargewicht und die Eigenschaften des Endothels der untersuchten Gewebe 4. Dies ermöglichte die Untersuchung der beiden Mikrogefäßstruktur, durch die korrekte Abgrenzung Gefäße und Durchlässigkeit der Kapillaren, durch auslaufende und der sich in das Interstitium.
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Protokoll
1. Herstellung des Kontrastmittels
- Für FITC-Dextran 70 kDa, die injizierten Dosis ist 500 mg / kg (10 mg FITC-Dextran in 0,1 ml Kochsalzlösung für eine Maus mit einem Gewicht von 20 g verdünnt).
- Das Mittel sollte nicht zu lange ausgesetzt werden, um Licht. Bleich zu vermeiden, empfiehlt es sich, das Röhrchen mit Aluminiumfolie abzudecken.
2. Anästhesie
- Mäuse wurden durch eine intraperitoneale Injektion einer Mischung von 1:4 von Xylazin (Rompun 2%, Bayer, Puteaux, Frankreich) und Ketamin (Ketamin 500, Virbac, Carros, Frankreich), die jeweils 66 mg / kg und 264 mg / kg für eine 20 g-Maus.
3. Vorbereitung der Orgel in der Nähe
- Wir rasierte Mäuse am Ort von Interesse (z. B. über einen subkutanen Tumor). Tier Haar ist oft, wenn Autofluoreszenz weiß. Wenn schwarz, absorbiert es Licht.
- Die Haut vor der Orgel, die abgebildet werden wurde eingeschnitten. Es ist wichtig, zu warten, bis die bleeding hat vor der Injektion des Kontrastmittels gestoppt, sonst wird es im Blut austreten und verunreinigen das Bild.
4. Erwerb
- Das Kontrastmittel wurde entweder durch die Halsschlagader oder die Schwanzvene injiziert. Es gibt keine oder nur eine geringe Hintergrundsignal in dem in Abwesenheit eines fluoreszierenden Kontrastmittels beobachtet Organ.
- Die Sonde wurde vor dem abzubildenden Organ platziert. In unserer Studie war der Tumor.
- Der Laser eingeschaltet, um den Tumor zu beleuchten und sehen die Fluoreszenz in den Kapillaren.
- Der Tumor wurde manuell durch Bewegen der Sonde in einem sehr langsamen Bewegung während der Aufnahme, um die Kapillare Netzwerk visualisieren erforscht. Es ist wichtig, eine ruhige Hand zu halten, und diese Technik erfordert ein wenig Erfahrung. In unserer Studie erlaubt dieser erste Schritt Quantifizierung der funktionellen Kapillardichte.
- Der zweite Schritt war die dynamische Erfassung über die Zeit. Für diese Studie verwendeten wir ein 70 kDa-Dextran-FITC. Es gibt keine interstitielle Leckage in den meisten normalen Organen, aber es ist in Tumoren. Um Bilder von der gleichen Stelle über die Zeit (wie in unserem Fall) zu erwerben, ist es wichtig, ein System einzurichten, um die Sonde auf dem Gebiet von Interesse aufrecht zu erhalten. Dies wurde durch eine handgefertigte Unterstützung, um die Sonde zu halten gemacht, und indem man ein bisschen Ultraschall-Gel auf der Spitze der Sonde. Vor der Aufnahme wurde Zeit für die Stabilisierung der Sonde in Kontakt mit dem Tumor platziert. Sobald die Position gesichert war, gab es nur minimale Bewegung aufgrund der Maus die Atmung. Der Laser eingeschaltet, um Bilder 3 alle 30 s für 20 min aufgezeichnet, um die Anwesenheit kapillares Leck zu erfassen. Es wurde zwischen jeder Aufnahme drehte sich um Kontrastmittel Bleich reduzieren.
- In unserem Experiment wurden die Mäuse am Ende des Verfahrens für die histologische Analyse von Tumoren geopfert.
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Ergebnisse
Verwendung der gesammelten Daten, könnten wir verschiedene Parameter quantitativ zu analysieren reflektierenden Mikrozirkulation.
Wir untersuchten in vivo die periphere Gefäßnetz eines Darmtumors in Balb-c-Mäuse mit einem konfokalen Fluoreszenzvideomikroskopie fibered System (Cellvizio, Maunakea Technologie, Paris, France 2), nach der Injektion eines makromolekularen fluoreszierenden Kontrastmittels Fluoresceinisothiocyanat-Dextran (implantiert FITC-Dextran) mit einem Mol...
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Diskussion
Die Untersuchung der Tumormikrozirkulation unverzichtbar geworden für das Verständnis der Pathophysiologie von Tumorwachstum, Verbreitung und Ansprechen auf die Therapie ein. Optisches Abbildungs ist eine der Techniken, die verwendet werden können, um die Kapillaren zu beobachten unter Verwendung eines fluoreszierenden Kontrastmittels und morphologischen (funktionelle Kapillardichte) und funktionellen (Index Leckage) Parameter zu quantifizieren.
Die Fluoreszenz Mikroskopie wir i...
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Offenlegungen
Wir haben nichts zu offenbaren.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Insulin serynge Myjector 1ml 29G | Terumo Europe | BS-05M2913 | |
| Fluorescein-Isothiocyanat-Dextran 70 kDa | Sigma-Aldrich | 01619HH | 100 mg/mL in Kochsalzlösung verdünnt |
| Konfokale Faser-Videomikroskopie | Cellvizio - MaunaKea Technologies | ||
| Kalibrier- und Reinigungskit für LEICAFCM1000 | Leica Microsystems | LSU-488 | Lagern bei 4 & Grad; C |
| Sonde ProFlexTM Z | MaunaKea Technologies | ||
| Mosaik-Software | MaunaKea Technologies | ||
| Software zur Schiffsdetektion | MaunaKea Technologies |
Referenzen
- Folkman, J. Fundamental concepts of the angiogenic process. Curr Mol Med. 3 (7), 643-651 (2003).
- Laemmel, E., Genet, M., Le Goualher, G., Perchant, A., Le Gargasson, J. F., Vicaut, E. Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy. J Vasc Res. 41 (5), 400-411 (2004).
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Nachdrucke und Genehmigungen
