In vivo Neuronale Calcium Imaging in C. elegans

Zusammenfassung

Mit seinem kleinen transparenten Körper, gut dokumentierte Neuroanatomie und einer Vielzahl von zugänglicher genetischen Techniken und Reagenzien C. elegans Ist ein idealer Modellorganismus für In vivo Neuronalen Bildgebung mit relativ einfachen, kostengünstigen Verfahren. Hier beschreiben wir einzelnes Neuron Bildgebung in intakten erwachsenen Tieren mit genetisch kodierten fluoreszierenden Kalzium-Indikatoren.

Zusammenfassung

Der Fadenwurm C. elegans ist ein idealer Modellorganismus für relativ einfache, kostengünstige neuronalen Bildgebung in vivo. Seine kleinen transparenten Körper und einfache, ermöglicht gut charakterisierten Nervensystems Identifikation und Fluoreszenz-Imaging von jedem Neuron im intakten Tier. Einfache Immobilisierungstechniken mit minimalen Auswirkungen auf die Tier-Physiologie ermöglichen erweiterte Zeitraffer-Aufnahmen. Die Entwicklung von genetisch-kodierten Kalzium Fluorophore wie cameleon ¹ und GCaMP ² ermöglichen in-vivo-Bildgebung neuronaler Calcium Zusammenhang sowohl Zellphysiologie und neuronaler Aktivität. Zahlreiche transgenen Stämme exprimieren diese Fluorophore in spezifischen Neuronen sind leicht erhältlich oder können unter Verwendung gut etablierter Techniken hergestellt werden. Hier beschreiben wir detaillierte Verfahren zur Messung Kalzium Dynamik innerhalb eines einzelnen Neurons in vivo sowohl mit GCaMP und cameleon. Wir diskutieren Vor-und disadvantAlter beider sowie verschiedene Verfahren zur Probenvorbereitung (tierische Immobilisierung) und Bildanalyse. Schließlich stellen wir die Ergebnisse von zwei Experimenten: 1) Verwenden GCaMP die sensorische Reaktion eines bestimmten Neurons mit einer externen elektrischen Feldes und 2) Verwenden cameleon die physiologische Calciumreaktion eines Neurons auf traumatische Laserschaden zu messen. Calcium bildgebenden Verfahren wie diese werden ausführlich in C eingesetzt elegans und sind Messungen in sich frei bewegenden Tieren, mehrere Neuronen gleichzeitig und Vergleich erstreckte sich über genetischen Hintergründen. C. elegans stellt eine robuste und flexible Anlage zur in vivo Bildgebung mit neuronalen Vorteile gegenüber anderen Modellsystemen in technische Einfachheit und Wirtschaftlichkeit.

Einleitung

Hier präsentieren wir Ihnen praktische Methoden zur in vivo Calcium Imaging in C. elegans Neuronen. Die Entwicklung von genetisch kodierte Calcium-sensitiven Fluorophore mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis macht C. elegans eine vergleichsweise einfache und kostengünstige System zur Messung von neurophysiologischen und Aktivität. Unsere Bildgebung ist mit einem Standardsubstanzsampler Mikroskop unter Verwendung Weitfeld-Fluoreszenzabbildung allgemein verfügbarer Fluorophore getan. Wir präsentieren verschiedene Techniken unter Verwendung verschiedener Fluorophore und verschiedenen Probenvorbereitung, diskutieren die Stärken und Schwächen der e....

Protokoll

Ein. Optischer Aufbau

1. Verwenden Sie eine Standard-Verbindung Mikroskop mit Epifluoreszenz Imaging-Funktionen. Wir verwenden eine Nikon Eclipse Ti-U inverse Mikroskop mit einem Intensilight HG Illuminator.
2. Für optimale Bild-und Signal-Qualität mit einem hohen Vergrößerung, mit hoher numerischer Apertur Ziel. Wir verwenden in der Regel eine Nikon X60 1,4 NA Ölimmersionsobjektiv. In einigen Fällen ist es möglich, geringere Vergrößerung verwenden (X40, X20), je nach Expressionsniveau des Fluorophors und Signalstärke.
3. Verwenden eine hohe Empfindlichkeit gekühlte CCD-Kamera, wie beispielsweise eine Kamera, um Andor Clara Bildempfindlichkeit m....

Ergebnisse

Hier präsentieren wir die Ergebnisse von zwei getrennten Experimenten. Der erste beschäftigt GCaMP um die Reaktion eines bestimmten sensorischen Neurons zu einer definierten äußeren Reiz zu messen, die einen guten Beispiel, wie fluoreszierenden Calcium Reporter verwendet werden, um optisch zu überwachen neuronale Aktivität in intakten C werden elegans. Die zweite setzt cameleon zur Messung der intrazellulären Calcium transienten ausgelöst innerhalb eines Neurons in Reaktion auf spezifische Laserschaden.......

Diskussion

Genetisch kodierte Kalzium-Indikatoren wurden weitgehend in C genutzt elegans Neurobiologie. Zahlreiche Gruppen haben diese Techniken verwendet werden, um Reaktion der primären sensorischen Neuronen auf äußere Reize zu studieren, wie hier mit dem ASJ Reaktion auf ein elektrisches Feld demonstriert. Prominente Beispiele umfassen Empfindung mechanische Berührung, bestimmte Chemikalien, die Temperatur und ein elektrisches Feld ^{12, 16-19.} Aktivität von Interneuronen und Muskelzellen haben auch b.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Eclipse Ti-U invers Mikroskop	Nikon
Intensilight HG Illuminator	Nikon	C-HGFI	Leuchtstoffröhre
CFI Plan Apo VC 60X Öl	Nikon
Optischer Tisch oder 3'X3" optisches Breadboard	Thor Labs		Wenn kein optischer Tisch verwendet wird, sollte ein optisches Steckbrett auf einem soliden Labortisch ausreichen .
Clara Interline Kamera	Andor Technologie		Hochempfindliche CCD-Kamera
wtGFP Longpass Emission	Chroma Technology Corp.	41015	GFP Filterset für die Bildgebung GCaMP
Filter 440 +/- 10 nm	Chroma	D440/20x EX	Anregungsfilter für Kameleon
Dichroitischer Spiegel > 455 nm Langpass	Chroma	455DCLP BS	Mikroskop dichroitisch für Cameleon Bildgebung
Dichroitischer Spiegel > 515 nm Langpass	Chroma	515DCLP BS	dichroitischer Spiegel für Kameleon
Imaging Filter 535 +/- 15 nm	Chroma	D535/30m EM	YFP Emissionsfilter
Filter 480 +/- 20 nm	Chroma	D485/40m EM	CFP Emissionsfilter
Objektiv, 200 mm, Achromat	Thor Labs	AC508-200-A1	Relaislinse für FRET-Optiken (3)
Silberner Breitbandspiegel	Thor Labs	ME2S-P01	FRET-Optik (2)
NGM-Puffer
Levamisol	Sigma
Polybead Mikrosphären	Polysciences, Inc.	08691-10, 2,5 Vol.<% μmbr/>, Polystyrol-Nanopartikel mit einem Durchmesser von 50 nm	für C. elegans Immobilisierung
Transgener Stamm, Strain gpa-9::GCaMP3(in pha-1; him-5 bkg)	Sternberg Lab	Stamm PS6388
Transgener Stamm, mec- 4::YC3.60Gabel	Lab	Stamm CG1B