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Methodenartikel

In vivo Neuronale Calcium Imaging in C. elegans

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⸱

DOI:

10.3791/50357

⸱

10. April 2013

 ,  , 
1Department of Physiology and Biophysics, Boston University School of Medicine, 2Boston University Photonics Center

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Mit seinem kleinen transparenten Körper, gut dokumentierte Neuroanatomie und einer Vielzahl von zugänglicher genetischen Techniken und Reagenzien C. elegans Ist ein idealer Modellorganismus für In vivo Neuronalen Bildgebung mit relativ einfachen, kostengünstigen Verfahren. Hier beschreiben wir einzelnes Neuron Bildgebung in intakten erwachsenen Tieren mit genetisch kodierten fluoreszierenden Kalzium-Indikatoren.

Zusammenfassung

Der Fadenwurm C. elegans ist ein idealer Modellorganismus für relativ einfache, kostengünstige neuronalen Bildgebung in vivo. Seine kleinen transparenten Körper und einfache, ermöglicht gut charakterisierten Nervensystems Identifikation und Fluoreszenz-Imaging von jedem Neuron im intakten Tier. Einfache Immobilisierungstechniken mit minimalen Auswirkungen auf die Tier-Physiologie ermöglichen erweiterte Zeitraffer-Aufnahmen. Die Entwicklung von genetisch-kodierten Kalzium Fluorophore wie cameleon 1 und GCaMP 2 ermöglichen in-vivo-Bildgebung neuronaler Calcium Zusammenhang sowohl Zellphysiologie und neuronaler Aktivität. Zahlreiche transgenen Stämme exprimieren diese Fluorophore in spezifischen Neuronen sind leicht erhältlich oder können unter Verwendung gut etablierter Techniken hergestellt werden. Hier beschreiben wir detaillierte Verfahren zur Messung Kalzium Dynamik innerhalb eines einzelnen Neurons in vivo sowohl mit GCaMP und cameleon. Wir diskutieren Vor-und disadvantAlter beider sowie verschiedene Verfahren zur Probenvorbereitung (tierische Immobilisierung) und Bildanalyse. Schließlich stellen wir die Ergebnisse von zwei Experimenten: 1) Verwenden GCaMP die sensorische Reaktion eines bestimmten Neurons mit einer externen elektrischen Feldes und 2) Verwenden cameleon die physiologische Calciumreaktion eines Neurons auf traumatische Laserschaden zu messen. Calcium bildgebenden Verfahren wie diese werden ausführlich in C eingesetzt elegans und sind Messungen in sich frei bewegenden Tieren, mehrere Neuronen gleichzeitig und Vergleich erstreckte sich über genetischen Hintergründen. C. elegans stellt eine robuste und flexible Anlage zur in vivo Bildgebung mit neuronalen Vorteile gegenüber anderen Modellsystemen in technische Einfachheit und Wirtschaftlichkeit.

Einleitung

Hier präsentieren wir Ihnen praktische Methoden zur in vivo Calcium Imaging in C. elegans Neuronen. Die Entwicklung von genetisch kodierte Calcium-sensitiven Fluorophore mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis macht C. elegans eine vergleichsweise einfache und kostengünstige System zur Messung von neurophysiologischen und Aktivität. Unsere Bildgebung ist mit einem Standardsubstanzsampler Mikroskop unter Verwendung Weitfeld-Fluoreszenzabbildung allgemein verfügbarer Fluorophore getan. Wir präsentieren verschiedene Techniken unter Verwendung verschiedener Fluorophore und verschiedenen Probenvorbereitung, diskutieren die Stärken und Schwächen der einzelnen. Daten werden dann aus zwei Experimenten Beispiel vorgestellt. Eine ausgezeichnete zusätzliche Ressource auf den hier beschriebenen Techniken können in WormBook, "Imaging die Aktivität der Nervenzellen und Muskeln" von R. Kerr, (gefunden werden http://www.wormbook.org ) 3.

Zwei Hauptklassen von gentechnischtisch kodierte fluoreszierende Kalzium-Reporter sind häufig in C eingesetzt elegans: Einkanal GCaMP und FRET-basierten cameleon. Wir beschreiben Methoden und zeigen Beispiele für Daten, die von jedem erzeugt.

GCaMP basiert auf einer modifizierten Green Fluorescent Protein (GFP), die empfindlich auf die umgebende Calciumkonzentration basiert. Dies wird durch Fusion von GFP und dem hohen Calcium-Calmodulin Protein Affinität, so dass die Bindung von Calcium durch Calmodulin das GFP-Molekül bringt in einen effizienten fluoreszierenden Bestätigung 2 bewerkstelligt. Die jüngsten Fortschritte in dieser Fluorophore erzeugen außergewöhnlich gutes Signal Größe mit bis zu 500% Anstieg der Fluoreszenzintensität über einen physiologischen Bereich von Kalzium und einigermaßen schnell Kinetik ~ 95 ms Anstiegszeit und ~ 650 ms Abklingzeit 4. Über relativ kurze Zeiträume (Minuten), können diese großen Signale für niedrigere Auflösung Bildgebung ermöglichen (untere Vergrößerung) und bei einem wohlerzogenen initial Baseline-Messung, negieren die Notwendigkeit ständiger Grundlinie oder Vergleichsmessungen.

Cameleon hat den Vorteil, eine FRET-Fluorophor, das eine Quotientenmeßschaltung Vergleichens zwei unabhängige Kanäle oder Wellenlängen 1 erzeugt. Es besteht aus zwei separaten Fluorophore (Cyan-und Gelb-emittierende fluoreszierende Proteine, CFP und YFP) durch eine Calmodulin Protein verknüpft ist. Der Komplex wird mit blauem Licht (440 nm), die die GFP regt beleuchtet. Bindung von Calcium bringt die Fluorophore näher zusammen, wodurch Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) von dem GFP (Donor) zum YFP (Akzeptor) und Veranlassen des GFP-Emission (480 nm) zu verringern und das YFP-Emission (535 nm) bis zu erhöhen . Relative Kalziumspiegel werden als das Verhältnis des YFP / GFP Intensität gemessen. Cameleon Kinetik langsamer als die GCaMP, in vivo gemessen werden, um eine Anstiegszeit von ~ 1 sec und eine Abfallzeit von ~ 3 sec 5 haben. Jedochdas Verhältnis der gegenläufigen Signale erhöht die Signalgröße und kompensiert einer Anzahl möglicher Artefakte aufgrund veränderter Fluorophorkonzentration, Bewegung oder Fokusdrift und Bleichen.

Genetisch codierte fluoreszierende Reporter zu negieren viel von der Probenvorbereitung mit exogen verabreichtem Sonden und C geforderten elegans kleinen transparenten Körper ermöglicht die Abbildung innerhalb des intakten Tier mit einfachen weites Feld Fluoreszenz. Die wichtigste technische Herausforderung in der Probenvorbereitung ist daher sicher fixieren die Tiere. Es gibt eine Anzahl von unterschiedlichen häufigsten verwendeten Techniken mit jeweils Vorteile und Nachteile. Verwendung eines pharmakologischen Agens, um die Tiere zu lähmen ist einfach zu implementieren und ermöglicht die Montage mehrerer Tiere an einer Zubereitung (Levamisol, ein cholinerger Agonist, Muskelgewebe führt zu ergreifen ist typischerweise 6 verwendet). C. elegans kann auch physisch durch die Montage ihnen immobilisiert werdenauf steifen 10% igen 7, 8. Dies minimiert Auswirkungen auf die Physiologie von Tieren, ermöglicht langfristige Bildgebung (Stunden) und Rückgewinnung von mehreren Tieren ist aber technisch schwierig. Beide Techniken den physischen Zugriff auf die Tiere (die unter einem Deckglas) und kann daher nur mit bestimmten experimentellen Stimuli (wie Licht, Temperatur, elektrisches Feld oder Laser-Schaden) verwendet werden. Für Impulse in der physischer Zugriff erforderlich ist, wie Touch-oder die Verabreichung von Chemikalien, haben viele Studien erfolgreich C. geklebt elegans in Ort (mit Veterinär-Grade-Kleber) 9. Dies ist technisch anspruchsvoller, ist nur ein einziges Tier Vorbereitung und erlaubt keine tierischen Erholung. Schließlich haben zahlreiche mikrofluidischen Bauteilen eingesetzt, dass körperlich zurückzuhalten C. elegans, kann die Erhaltung Tierphysiologie, so dass die Exposition gegenüber den meisten Arten von Stimuli (je nach Geräteausführung) und ermöglichen einen schnellen Austausch und Erholung der Tiere 10, 11. Allerdings Mikrofluidik erfordern zusätzliche technische Kenntnisse und Fähigkeiten in Design, Herstellung und Implementierung. In immobilisierten Tieren Aktivität und Stimulus-Antwort kann in der Regel in den sensorischen und Interneuronen gemessen werden. Aktivität von Motoneuronen erfordert ausgefeiltere Techniken zur Bildgebung in bewegenden Tieren. Hier präsentieren wir Ihnen detaillierte Methoden unter Verwendung der beiden am einfachsten Techniken der pharmakologischen Lähmung und Immobilisierung mit steifen Agarose.

Die hier vorgestellten Methoden können verwendet werden, um neuronale Aktivität und Zellphysiologie in C messen elegans. Wir geben jeweils ein Beispiel: Verwendung GCaMP die sensorische Reaktion des ASJ Neuron zu einem äußeren elektrischen Feld zu messen, und Verwenden cameleon die physiologische Reaktion auf Calcium Laserschaden eines Neurons zu messen. Diese Beispiele zeigen die Vorteile und Nachteile der beiden Arten von Fluorophoren und zeigen, was möglich ist mit dem System.

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Protokoll

Ein. Optischer Aufbau

  1. Verwenden Sie eine Standard-Verbindung Mikroskop mit Epifluoreszenz Imaging-Funktionen. Wir verwenden eine Nikon Eclipse Ti-U inverse Mikroskop mit einem Intensilight HG Illuminator.
  2. Für optimale Bild-und Signal-Qualität mit einem hohen Vergrößerung, mit hoher numerischer Apertur Ziel. Wir verwenden in der Regel eine Nikon X60 1,4 NA Ölimmersionsobjektiv. In einigen Fällen ist es möglich, geringere Vergrößerung verwenden (X40, X20), je nach Expressionsniveau des Fluorophors und Signalstärke.
  3. Verwenden eine hohe Empfindlichkeit gekühlte CCD-Kamera, wie beispielsweise eine Kamera, um Andor Clara Bildempfindlichkeit maximieren und Hintergrundrauschen.
  4. Für einfarbige Fluorophore die Standard-Mikroskop-Fluoreszenz-Filter gesetzt konzipiert für die jeweilige Wellenlänge des Fluorophors. Für GCaMP verwenden eine Standard-GFP Filter gesetzt optimiert für Anregung bei 488 nm und Emission bei 525 nm. Keine weiteren optischen Modifikationen erforderlich sind.
  5. Für ratiometrisch Fluorophore, wie cameleon, verwenden Sie ein Dual Imaging System, so dass identische Bilder können gleichzeitig an zwei verschiedenen Wellenlängen erfasst werden. Dies wird durch Projizieren der dualen Bildern Seite an Seite auf die Kamera erreicht. Ein einfaches Setup, dies zu erreichen, mit einfachen optischen Komponenten auf einer optischen Qualität Steckbrett, ist in Abbildung 1 dargestellt. Es besteht aus:
    1. Ein Mikroskop Filter mit 440 ± 20 nm Anregungsfilter und 455 nm eingestellt langen Pass dichroitischen Spiegel.
    2. Ein Bild Maske an der ersten Bildebene unmittelbar außerhalb des Mikroskopabbildanordnung Hafens (wo die Kamera CCD-Sensor würde in der Regel sitzen) platziert. Dies schränkt das Sichtfeld derart, dass sie nur die Hälfte des Kamerasensors füllen. Anordnen diese Maske an der ersten Bildebene führt scharfes Bild Grenzen und ohne Überlappung, wenn die zwei Bildern Seite an Seite projiziert werden.
    3. Das erste Relais Objektiv eingestellt einer Brennweite von ter erste Bildebene derart, daß sie das Licht kollimiert.
    4. Ein dichroitischer Spiegel, der das Licht teilt sich in die beiden separaten bildgebenden Wellenlängen oder Kanälen Reflektieren einer Farbe (> 515 nm, gelb) während der Übertragung des anderen (<515 nm, cyan).
    5. Emissionsfilter (Bandpassfilter) weiteren Einschränkung des übertragenen Lichts auf die spezifischen Wellenlängen Bildgebung (Cyan bei 485 ± 40 nm und gelb bei 535 ± 30 nm),
    6. Die zweiten Relaislinsen (eine für jeden Kanal) in den Strahlengängen, daß sie das Licht refokussiert einer zweiten Bildebene an der CCD-Kamera angeordnet.
    7. Ein Paar von Spiegeln und einen zweiten dichroitischen Spiegel lenkt die Strahlengänge derart, dass die zwei Bilder projiziert werden rekombiniert und Seite-an-Seite auf die Kamera CCD-Sensor. 4A zeigt ein Beispiel des resultierenden Bildes.
  6. Initial Optische Ausrichtung: Initiieren Setup und Ausrichtung der Optik mit einem hohen Kontrast image mit einem niedrigen Vergrößerungslinse und übertragen Weitfeld-Licht-Beleuchtungssystem (ein schwarzer sharpie auf einem Objektträger gezogen gut funktioniert). Bringen des Bildes, um durch die Okulare Mikroskop konzentrieren und dann an das Mikroskop zu verwendenden Port geschaltet. Mit hoher Beleuchtung sehen Sie das Bild auf eine Karteikarte in der Anfangsphase Brennebene (wenige cm außerhalb des Mikroskops Port). Platzieren des ersten Relais-Linse (C) im Strahlengang, so daß es zu einem fokalen Abstand von dem ersten Brennebene liegt und kollimiert das Licht zwar nicht Ablenken des Strahlengangs (dh direkt im Strahlengang zentriert). Legen der Maske auf der ersten Brennebene, eingestellt auf die Hälfte des Sichtfeldes zu beschränken und erzeugen eine scharfe Grenze in dem Bild. Positionieren der Spiegel und Filter (D, E, G) derart, daß der Strahlengang parallel zur Tischoberfläche bleibt und läuft in zwei parallelen Bahnen Seite an Seite, wie in 1B gezeigt. Zentrieren der zweiten Relais-Linsen (F) in ihrer jeweiligen Strahlengänge undbewegt sie hin und her entlang der Wege, um die Bilder zu einem Fokus auf eine Karteikarte platziert waren die Kamera CCD-Sensor wird zu bringen. Wenn es richtig gemacht die beiden Bilder sollten parfokal mit dem Mikroskop Okulare und andere Kamera-Ports. Schließlich stellen Sie die Kamera in Position und Feinabstimmung der Ausrichtung.
  7. Fine Tuning Optische Ausrichtung: Verwenden Sie den Dual-Bild durch die CCD-Kamera betrachtet die Feineinstellung der optischen Ausrichtung. Verwenden eines Bild mit hohem Kontrast und beginnen mit geringer Vergrößerung, die Umstellung auf eine stärkere Vergrößerung zur endgültigen Ausrichtung. Positionieren Sie die übertragene Bild (cyan Kanal in Abbildung 1B) auf die Hälfte der Kamera Sichtfeld durch Bewegen der Kamera in X und Y. Position das reflektierte Bild (gelber Kanal in Abbildung 1B), die andere Hälfte des Feldes cover cover anzuzeigen, indem die beiden letzten Spiegel (G) in seinem Strahlengang. Optimieren, indem das zweite Relais-Linse für jeden Kanal vor und zurück entlang dem Strahlengang zu konzentrieren. Bleibtunverändert der optische Aufbau sollte stabil und erfordern nur selten eine Feinabstimmung Einstellung.

2. Probenvorbereitung und Datenkommunikation.

  1. Erwerben Tieren Ausdruck einer Kalzium-sensitives Fluorophor im Neuron von Zinsen aus dem Caenorhabditis Genetics Center (CGC) oder anderen Quellen. Alternativ können transgene Tiere hergestellt werden unter Verwendung von Standard C. elegans Techniken. Einzelzelle Expression ist nicht erforderlich (und manchmal auch nicht wünschenswert, wenn mehrere Neuronen untersucht werden sollen, siehe 12), solange Bilder und Messungen von mehreren Zellen können leicht abgetrennt werden. Wenn das Fluorophor Transgen nicht in das Genom integriert ist, können erhebliche Unterschiede in der Expression von Tier zu Tier auftreten. In diesem Fall Vorauswählen Tiere mit höheren Expressionsniveaus unter Verwendung eines fluoreszierenden Präpariermikroskop erhöht das Signal-Rausch-Verhältnis verbessert und die Messungen. Fluorophor Expression need ausreichend sein, um ohne weiteres mit der Kamera unter den Erfassungsparameter durch das Experiment erforderlich abgebildet.
  2. Nehmen Sie die Agarose-Pads für die gewünschte Immobilisierung Technik (siehe Abschnitt 2.3), indem Sie einen kleinen Tropfen geschmolzenen Agarose zwischen zwei Glasplatten durch zwei Stücke von Labor-Band Abstand erforderlich. Falls erforderlich, kann Agarose Pads einem Deckglas vor der Montage die Tiere übertragen werden. Siehe Abbildung 2.
  3. Immobilisieren C. elegans zur Bildgebung unter Verwendung einer der folgenden Techniken:
    1. Pharmakologische Erstarrung: In 0,05% Levamisole bis 2% Agarose-Pads (Mischen in das geschmolzene Agarose, bevor Sie die Pads in 2,2). Wählen 5-10 Tiere auf dem Pad und decken mit einem Deckglas. Anwenden geringe Mengen von heißem Wachs-Gemisch (50% Paraffinwachs und 50% Vaseline) zu den Ecken des Deckglases zu in Position halten. Lassen 5-10 min für die Levamisol zur Wirkung und die Tiere b nehmenecome komplett still.
    2. Stiff Agarose Immobilisierung: C. elegans kann physikalisch immobilisiert werden mit steifen 10% igen Pads und 0,05 Mikrometer Durchmesser Polystyrol-Nanopartikeln. Machen Sie 10% igen Pads (10% Agarose in NGM-Puffer nach Gewicht) wie in 2.2. Hinzufügen ~ 3 ul Bead-Lösung (1:10 Polystyrol Mikrokügelchen in NGM Vol.) an die Oberseite des Pads. Schnell, holen 5-10 C. elegans in den Pool der Bead-Lösung auf dem Pad und vorsichtig mit einem Deckglas abdecken. Verwenden geschmolzenes Wachs aufgebracht zu den Ecken des Deckglases um in Position halten. (Für weitere Details zu dieser Technik finden Sie 7 sowie einer früheren JoVE Artikel 8)
    3. Kleben: C. elegans kann anstelle mit geringen Mengen an veterinärmedizinischen Gradkleber die auf eine Seite des Tieres verklebt werden.
    4. Mikrofluidiksysteme: Zahlreiche Mikrofluidik-Geräte wurden entwickelt, um physisch zu halten C. elegans an Ort und Stelle für die Bildgebung.
  4. Legen Sie die vorbereitete Folie auf dem Mikroskop und konzentrieren sich auf die gewünschte Neurons. Es ist oft am einfachsten, die C. finden elegans mit Hellfeldbeleuchtung und geringe Vergrößerung. Dann Wechsel zu hoher Vergrößerung und Fluoreszenz-Imaging zu finden und sich auf die spezifischen Neurons.
  5. Stimulus: Wenn eine neuronale Antwort auf einen bestimmten Stimulus erwünscht ist (Licht, elektrischem Feld, Geschmacks-und Geruchssinn, Temperatur etc.), muß die Vorrichtung in den Stimulus Mikroskopaufbau, so daß es den Tieren kann die verabreichte ausgebildet sein Probenvorbereitung, während Bildgebung.
  6. Erwerben Sie Bilder mit dem Mikroskop CCD-Kamera. Belichtungszeiten und Anregungslicht Ebene auf der Grundlinie Signal und Expressionsniveau des Fluorophors ab, wobei schwächere Signale erfordern längere Belichtungszeiten mit konkordant weniger Zeitauflösung. Wir verwenden in der Regel ~ 300 msec Belichtungszeiten.
  7. Bilder aufzunehmen, entweder einzeln oder als time-Videovorlauf. Weil C. elegans Neuronen in der Regel angezeigt langsame Aktivierung Dynamik (dh es fehlt Natrium-basierte Aktionspotentiale), sind relativ langsam Bildraten von ~ 1 sec reicht oft zu Neuron Dynamik zu messen. Abtastraten bis zu ~ 90 Frames pro Sekunde verwendet wurden, obwohl diese durch die Integration notwendige Zeit für schwache Fluoreszenz begrenzt werden kann. Einzelne Filme eines einzelnen Neurons kann leicht für mehrere Minuten (~ 5-10 min) oder mehr erstrecken, wenn die Immobilisierung Zubereitung ist stabil und die Bildrate relativ langsam.

3. Data Analysis

  1. Es gibt eine Reihe von verschiedenen Fluoreszenz-Imaging-Software-Pakete mit dynamischen und ratiometrische Analyse-Funktionen einschließlich ImageJ und NIS-Elements. Wir verwenden ein einfaches Programm, das individuelle MATLAB die durchschnittliche Fluoreszenzsignal über einen ausgewählten Bereich von Interesse misst.
  2. Für einzelne Bilder (oder Zeitraffer-Filme, die bleibenabsolut still) Auswählen einer interessierenden Region (ROI) innerhalb des abgebildeten Neuron und einem separaten Nähe Region für die Hintergrundmessung. Für ratiometrisch Bilder auszuwählen ähnlichen ROI und Hintergrund Regionen für jedes der zwei Bilder.
  3. Leichte Bewegung des abgebildeten Neuronen innerhalb einer Zeitraffer-Film erfordert eine zusätzliche Analyse, um automatisch die ROI in jedem Frame, die unter Verwendung von zahlreichen Objektverfolgung Systeme werden können. Unser Programm zeigt ein komprimiertes Bild aller Bilder in dem Film, von dem eine grobe Grenze (umfasst das Objekt des Interesses in allen Frames) manuell ausgewählt wird und eine unabhängige Hintergrund Region ausgewählt. Für den ersten Rahmen, wird ein ROI manuell aus dem Grenzbereich ausgewählt. Für jeden nachfolgenden Rahmen, wählt das Programm den hellsten Pixel innerhalb des Randbereiches einen ROI von der richtigen Größe (dh die gleiche Anzahl von Pixeln wie die manuelle ersten Rahmen ROI) zu erzeugen. Bei Bildern, wo die Zielet der Interessen ausreichend heller als die umgebenden Hintergrund im Randbereich dieses Protokoll wählt einen vernünftigen ROI für jeden Frame.
  4. Das Fluoreszenzsignal, F, für jeden Rahmen wird als die durchschnittliche Pixelintensität in dem ROI minus der mittleren Intensität in dem Hintergrundbereich berechnet. Ratiometrische Werte als das Verhältnis der beiden Signale (YFP-YFP Hintergrund) / (GFP GFP-Hintergrund) -0,65 berechnet. Der Faktor von 0,65 kompensiert Durchscheinen des GFP YFP Kanal in den Kanal, die abhängig von den Fluorophoren sowie insbesondere Filtersatz verwendet werden (dieser Wert typischerweise ~ 0,6 für cameleon Setups) sein wird.
  5. Die relative Calciumspiegel für jeden Rahmen wird als die prozentuale Änderung in der Intensität zu einer anfänglichen normalisierten Ausgangswert von dem ersten Rahmen (oder eine Serie von Frames) gemessen wird, berechnet: &Dgr; F / F = (F (t)-F o) / F o, wobei F (t) ist die Fluoreszenz zum Zeitpunkt t und F oist die erste Ausgangswert.
  6. Ein Auswählen des ROI Zellkörper erzeugt die stärksten Signale robustesten aber es ist auch möglich, auszuwählen und zu messen Signale von einem ROI entlang der Nervenprozesse.

4. Problemlösung

  1. Bleaching: Exposition gegenüber Anregungslicht kann Bleichen des Fluorophors und wird von einer stetigen Abnahme des Signals, die abhängig von Exposition ist markiert. Ratiometrische Messungen helfen, dies zu kompensieren. Allerdings selektive Bleichen von einer Wellenlänge können immer noch auftreten (typischerweise CFP Bleichmittel schneller als YFP). Wenn Bleichmittel reduzieren Lichtexpositions-Niveau durch Reduzieren Belichtungszeiten und / oder Anregungsintensität (mit Neutralfilter im Beleuchtungs-Weg) auftritt. Falls erforderlich, kann ein zum Bleichen indem Schauprozesse (mit der gleichen Anregung Exposition aber keine neuronalen Reiz) und Quantifizierung der Zeitkonstante Signalabfall kompensieren.
  2. Immobilisierung: Für die einfache Bildanalyse hier beschriebenen ist es wichtig, das Tier bleibt relativ ruhig in der gesamten Aufzeichnungsdauer C.. elegans der Belichtung und experimentelle Reize reagieren, so dass sie am wahrscheinlichsten zum Zeitpunkt der Aufnahme zu bewegen. Leichte Bewegung kann erhebliche Rauschen in der Messung führen vor allem bei der Messung von Axon Prozesse. Ratiometrische Analyse hilft, diese Folgen zu einem gewissen Grad und Messungen vom Zellkörper sind robuster zu mildern. Sorgfältige Ausführung und Verfeinerung der Immobilisierung Verfahren werden in ganz still Tieren führen.
  3. Hintergrundauswahl: Eine sorgfältige Auswahl eines Hintergrundes Region ist für erfolgreiche Bildanalyse. Hintergrund Regionen sollten einigermaßen einheitliche und dunkler als das abgebildete Neuron. Es muss ausreichend entfernt werden, um Streulicht (und somit ein Signal Pickup) aus dem abgebildeten Neuron vermeiden. Wir finden eine einheitliche Region 20-50 um aus dem ROI funktioniert in den meisten Fällen.
  4. Ratiometric Optik: Die korrekte Ausrichtung der Abbildungsoptik ist entscheidend für die Erzeugung eine klare duale Bild. Kommerzielle Mikroskop Anhänge für ratiometrische Bildgebung zur Verfügung. Eine alternative Technik ist es, eine schnelle sequentielle Bildgebung unter Verwendung einer schnellen Filterrad rasch zwischen Emissionswellenlängen zu schalten, während der Aufnahme getrennten Bildern für jeden einzusetzen.
  5. Ratiometrische Analyse: Die hier beschriebene Analyse ist eine relativ einfache Technik, robuste Signale generiert durch Mittelung über eine ROI. Es erfordert eine erkennbar helles Objekt, um den ROI zu wählen. Weitere anspruchsvolle ratiometrische Analyse ist durch präzise Ausrichten und Kartierung der dualen Bildern, so dass das fluoreszierende Verhältnis Pixel kann durch Pixel berechnet werden kann.

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Ergebnisse

Hier präsentieren wir die Ergebnisse von zwei getrennten Experimenten. Der erste beschäftigt GCaMP um die Reaktion eines bestimmten sensorischen Neurons zu einer definierten äußeren Reiz zu messen, die einen guten Beispiel, wie fluoreszierenden Calcium Reporter verwendet werden, um optisch zu überwachen neuronale Aktivität in intakten C werden elegans. Die zweite setzt cameleon zur Messung der intrazellulären Calcium transienten ausgelöst innerhalb eines Neurons in Reaktion auf spezifische Laserschaden...

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Diskussion

Genetisch kodierte Kalzium-Indikatoren wurden weitgehend in C genutzt elegans Neurobiologie. Zahlreiche Gruppen haben diese Techniken verwendet werden, um Reaktion der primären sensorischen Neuronen auf äußere Reize zu studieren, wie hier mit dem ASJ Reaktion auf ein elektrisches Feld demonstriert. Prominente Beispiele umfassen Empfindung mechanische Berührung, bestimmte Chemikalien, die Temperatur und ein elektrisches Feld 12, 16-19. Aktivität von Interneuronen und Muskelzellen haben auch b...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Mehrere Personen trugen zu der Arbeit in diesem Papier beschrieben. CVG baute den Versuchsaufbau und LS, SHC und CVG führten die Experimente. CVG und SHC schrieb das Manuskript. Alle Autoren anschließend nahmen an der Überarbeitung und genehmigt die endgültige Kopie des Manuskripts. Wir danken Paul Sternberg für die GCaMP Belastung. Einige Nematoden Stämme in dieser Arbeit verwendet wurden vom Caenorhabditis Genetics Center (CGC), die durch die NIH National Center for Research Resources (NCRR) finanziert ist. Die MATLAB Bildanalyse-Programm wurde von dem in 18 abgestimmt sind. Die Autoren wurden von der Boston University und dem Massachusetts Life Sciences Center unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Eclipse Ti-U invers
Mikroskop		Nikon
Intensilight HG IlluminatorNikonC-HGFILeuchtstoffröhre
CFI Plan Apo VC 60X ÖlNikon
Optischer Tisch oder 3'X3" optisches
Breadboard		Thor LabsWenn kein optischer Tisch verwendet wird, sollte ein
optisches Steckbrett auf einem
soliden Labortisch ausreichen
.
Clara Interline KameraAndor
Technologie		Hochempfindliche CCD-Kamera
wtGFP Longpass EmissionChroma Technology
Corp.		41015GFP Filterset für die Bildgebung GCaMP
Filter 440 +/- 10 nmChromaD440/20x EXAnregungsfilter für Kameleon
Dichroitischer Spiegel > 455 nm
Langpass		Chroma455DCLP BSMikroskop dichroitisch für Cameleon
Bildgebung
Dichroitischer Spiegel > 515 nm
Langpass		Chroma515DCLP BSdichroitischer Spiegel für Kameleon
Imaging Filter 535 +/- 15 nmChromaD535/30m EMYFP Emissionsfilter
Filter 480 +/- 20 nmChromaD485/40m EMCFP Emissionsfilter
Objektiv, 200 mm, AchromatThor LabsAC508-200-A1Relaislinse für FRET-Optiken (3)
Silberner BreitbandspiegelThor LabsME2S-P01FRET-Optik (2)
NGM-Puffer
LevamisolSigma
Polybead MikrosphärenPolysciences, Inc.08691-10, 2,5 Vol.<% μmbr/>, Polystyrol-Nanopartikel mit einem Durchmesser von 50 nm
für C.
elegans Immobilisierung
Transgener Stamm, Strain
gpa-9::GCaMP3(in pha-1;
him-5 bkg) 		Sternberg LabStamm PS6388
Transgener Stamm, mec-
4::YC3.60Gabel		LabStamm CG1B

Referenzen

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