Transkriptom-Analyse der menschlichen Retina chirurgischen Proben mit Journal

Summary

Wir verwendeten Retina Proben aus Retinektomie für eine Transkriptom-Analyse der Netzhautablösung. Wir entwickelten ein Verfahren, das RNA Konservierung zwischen den chirurgischen Blöcke und Labor ermöglicht. Wir standardisierten ein Protokoll zur RNA durch Caesiumchlorid Ultrazentrifugation, um sicherzustellen, dass die gereinigten RNAs geeignet für Microarray-Analyse sind zu reinigen.

Abstract

Netzhautablösung (RD) beschreibt eine Trennung der Neuroretina aus dem retinalen Pigmentepithel (RPE). Das RPE ist wichtig für die normale Funktion der lichtempfindlichen Nervenzellen, die Photorezeptoren. Ablösung der Netzhaut von der RPE schafft eine physische Lücke, die mit extrazellulären Flüssigkeit gefüllt ist. RD initiiert zellulären und molekularen unerwünschten Ereignisse, die sowohl die Neuroretina und die RPE da die physiologischen Austausch von Ionen und Metaboliten stark gestört wird beeinflussen. Die Folge für das Sehen ist auf die Dauer der Abteilung seit einer schnellen reapposition der beiden Geweben führt zur Wiederherstellung des Sehens ¹ verbunden. Die Behandlung von RD ist ausschließlich chirurgisch. Entfernen des Glaskörpers (Vitrektomie) wird durch die Entfernung nicht wesentlicher Teil der Netzhaut um die freistehende Fläche zu Netzhautablösung begünstigen gefolgt. Die entnommenen Proben sind retinale res nullius (nichts) und damit in der Regel verworfen.Um RNA aus diesen chirurgischen Proben zu erholen, haben wir das Verfahren Journal, dass RNA Erhaltung ermöglicht während der Übertragung aus dem OP-Block an das Labor. Wir haben auch ein Protokoll zur standardisierten RNA durch Caesiumchlorid Ultrazentrifugation zu reinigen, um sicherzustellen, dass die gereinigten RNAs geeignet für globale Genexpressionsanalyse sind. Die Qualität der RNA wurde sowohl durch RT-PCR und Microarray-Analyse bestätigt. Die Analyse der Daten zeigt eine gleichzeitige Einbeziehung der Entzündung und Photorezeptordegeneration während RD.

Introduction

Die wichtigste therapeutische Ziel in Netzhautablösung (RD) ist, einen Weg zu Photorezeptor Zellschäden und Netzhautentzündungen aus der Abtrennung von den Photorezeptoren der retinalen pigmentierten Epithelzellen begrenzen finden. Während RD, sind RPE-Zellen aktiviert, wandern, dedifferenzieren, und vermehren sich an der Oberfläche der abgelösten Netzhaut ausübt kontraktilen Kräfte führt zu Komplikationen. Transcriptomics Analyse der RD ist ein Weg, um Zielgene mit modifizierten Ausdruck identifizieren nach RD und damit zukünftige therapeutische Moleküle, die endgültige visuelle Ergebnis in Kombination mit Chirurgie verbessern könnte. Es ist bekannt, Ribonukleinsäur....

Protocol

1. JOURNAL: Verfahren, um die Proben aus der OP-Block Recover

Im Labor

1. Holen Sie sich einen Vertrag Einfuhr von Eilschiffahrtsgesellschaft.
2. Füllen 10 (oder 25) bildet mit dem Versand Postanschrift des Labors, die die Ansprechpartner im Labor (Telefonnummer und E-Mail-Adresse).
3. Planen 10 (oder 25) Proben Formen nummeriert von 1 bis 10 (oder 25). Diese Formen sind dedizierte Bereiche auf einer) anonyme Identifikation des Patienten informieren, b) das Datum der Operation und c) alle zusätzlichen Bemerkungen der Chirurg möchte hinzufügen. Bereiten 10 (oder 25) Versandtaschen (150 x 210 mm).
4. Hergestellt un....

Results

Das Verfahren Journal (Abbildung 1) ermöglicht es uns erholen Exemplare der Netzhaut von der chirurgischen Block gereinigte RNA, und das Transkriptom der Netzhautablösung zu analysieren. Netzhautablösung führt zur Hochregulation des Monozyten chemotaktische MCP1 Gen CCL2, und in der Abnahme der Expression der Stange Photorezeptor Transduzieren Gen GNAT1, die Kurzwelle Kegel Opsin OPN1SW und die homeogene CRX (Abbildung 2). Die Induktion von Entzündung.......

Discussion

Die Entwicklung eines Verfahrens zur Gewebe Erholung von der OP-Block ist wesentlich für die Transkriptom-Analyse der Netzhautablösung. Man sollte beachten, dass diese Art der Operation in Not und die Augenärzte Betriebssystem haben wenig Zeit, um in einer biologischen Forschungsprogramm teilnehmen, wenn sie tätig wird geübt. Diese Retinektomie auch stochastisch in jeden Dienst durchgeführt, so dass der einfachere Weg zu statistischen Zahlen erreichen, mit einem Netzwerk zu arbeiten. In einem solchen Netzwerk ist die St.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zentrifuge	Beckman Coulter	Aventi J-E
Rotor	Beckman Coulter	JS-5.3
Ultrazentrifuge	Beckman Coulter	LE 80K
Rotor	Beckman Coulter	SW41
Netzteil	Biorad	Pac 3000
PolytronTM	Kinematica	PT 2100	Geliefert mit PT-DA 2105:2
Agarose-Gelelektrophoresegerät	Biorad	MiniGel Cell GT
Imaging System	Biorad	GelDoc-It Imager
5 ml steriles Polyethylen-Röhrchen	Greiner	115261
Steriles Polyallomer-Zentrifugenröhrchen	Beckman Coulter	331372
Chemische Reagenzien	Sigma		Molekularbiologische Qualität (RNase- und DNase-freie Produkte)
Reinigungslösung	VWR	RBS
Microarray-Chip	Affymetrix	Human U133 plus 2 Arrays