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Methodenartikel

Transkriptom-Analyse der menschlichen Retina chirurgischen Proben mit Journal

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DOI:

10.3791/50375

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14. August 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1U968, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, 2UMR S 968, Université Pierre et Marie Curie, 3UMR 7210, Centre National de la Recherche Scientifique, 4Départment d'Ophtalmologie, Centre Hospitalier Universitaire de Bordeaux

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir verwendeten Retina Proben aus Retinektomie für eine Transkriptom-Analyse der Netzhautablösung. Wir entwickelten ein Verfahren, das RNA Konservierung zwischen den chirurgischen Blöcke und Labor ermöglicht. Wir standardisierten ein Protokoll zur RNA durch Caesiumchlorid Ultrazentrifugation, um sicherzustellen, dass die gereinigten RNAs geeignet für Microarray-Analyse sind zu reinigen.

Zusammenfassung

Netzhautablösung (RD) beschreibt eine Trennung der Neuroretina aus dem retinalen Pigmentepithel (RPE). Das RPE ist wichtig für die normale Funktion der lichtempfindlichen Nervenzellen, die Photorezeptoren. Ablösung der Netzhaut von der RPE schafft eine physische Lücke, die mit extrazellulären Flüssigkeit gefüllt ist. RD initiiert zellulären und molekularen unerwünschten Ereignisse, die sowohl die Neuroretina und die RPE da die physiologischen Austausch von Ionen und Metaboliten stark gestört wird beeinflussen. Die Folge für das Sehen ist auf die Dauer der Abteilung seit einer schnellen reapposition der beiden Geweben führt zur Wiederherstellung des Sehens 1 verbunden. Die Behandlung von RD ist ausschließlich chirurgisch. Entfernen des Glaskörpers (Vitrektomie) wird durch die Entfernung nicht wesentlicher Teil der Netzhaut um die freistehende Fläche zu Netzhautablösung begünstigen gefolgt. Die entnommenen Proben sind retinale res nullius (nichts) und damit in der Regel verworfen.Um RNA aus diesen chirurgischen Proben zu erholen, haben wir das Verfahren Journal, dass RNA Erhaltung ermöglicht während der Übertragung aus dem OP-Block an das Labor. Wir haben auch ein Protokoll zur standardisierten RNA durch Caesiumchlorid Ultrazentrifugation zu reinigen, um sicherzustellen, dass die gereinigten RNAs geeignet für globale Genexpressionsanalyse sind. Die Qualität der RNA wurde sowohl durch RT-PCR und Microarray-Analyse bestätigt. Die Analyse der Daten zeigt eine gleichzeitige Einbeziehung der Entzündung und Photorezeptordegeneration während RD.

Einleitung

Die wichtigste therapeutische Ziel in Netzhautablösung (RD) ist, einen Weg zu Photorezeptor Zellschäden und Netzhautentzündungen aus der Abtrennung von den Photorezeptoren der retinalen pigmentierten Epithelzellen begrenzen finden. Während RD, sind RPE-Zellen aktiviert, wandern, dedifferenzieren, und vermehren sich an der Oberfläche der abgelösten Netzhaut ausübt kontraktilen Kräfte führt zu Komplikationen. Transcriptomics Analyse der RD ist ein Weg, um Zielgene mit modifizierten Ausdruck identifizieren nach RD und damit zukünftige therapeutische Moleküle, die endgültige visuelle Ergebnis in Kombination mit Chirurgie verbessern könnte. Es ist bekannt, Ribonukleinsäure (RNA) ist nicht stabil wie Desoxyribonukleinsäure (DNA), wobei letztere ausgiebig für genetische Studien verwendet wird, hatte seine Stabilität die Sequenzierung des Neandertaler-Genoms von paläontologischen Proben von mehr als 30.000 Jahre alt 2 zulässig. Die Transkription der DNA der Gene aus dem Genom in Boten-RNA istHauptprozess in der Genexpression und der mRNA ist, um ein Signal zu bilden labil. RNAs sind sehr schnell durch RNAse Enzyme, die das Signal zu beenden. Wenn Gewebe aus einem Organismus isoliert werden, sind die RNAs sehr oft abgebaut, bevor der Ausdruck in einem Forschungslabor untersucht wird. Gestörter RNA ist nicht für die Analyse der Genexpression geeignet. Da das Laborpersonal nicht in der Chirurgie zu beteiligen, wurde ein Verfahren entwickelt, das einfach und erfordert lediglich, dass der Chirurg das Gewebe in eine geeignete RNAse-freie Lösung zu erholen. Die RNA aus den Geweben ist stabil und kann ohne Anzeichen von Abbau nach 72 Stunden bei Raumtemperatur in dieser Lösung analysiert werden. Die RNAs von Proben werden durch ein standardisiertes Verfahren, das eine Ultrazentrifugation auf einem Cäsiumchloridgradienten nachdem das Labor 3 übertragen wurden gereinigt. Dann werden die Qualität der RNA durch Agarose-Gelelektrophorese und mittels RT-PCR untersucht. Die RNA Aufreinigung Protokoll hat dieVorteil der Trennung der Moleküle nach ihrer Dichte, die sich für die DNA und RNA ist und gewährleistet, dass die RNA nicht durch eine DNA-Moleküle, die Artefakt-Signale in Genexpressionsstudien erzeugen verunreinigt. Darüber hinaus werden die Transfer-RNAs (tRNAs), die quantitativ sind die häufigsten RNA in einer Zelle gemäß der gleichen physikalischen Eigenschaft aus der ribosomalen RNA (rRNA) und die Messenger-RNA (mRNA), die beiden zuletzt die das abgetrennte Endprodukt des Reinigungsprozesses. Die Entfernung der tRNA aus der Herstellung ist nützlich, da die meisten der Mikroarray Analyseprotokollen bei dem durch Verwendung von Reverse Transkriptase und RNA-Polymerasen, die von tRNA 4-6 gehemmt werden. Die gereinigte RNA von chirurgischen Proben markiert sind unter Verwendung des Standardprotokolls und hybridisiert mit einem Microarray-Chip und die Ergebnisse wurden mit zwei komplementären Verfahren der False Discovery-Verfahren und unter Verwendung eines neuartigen Verfahrens zur gegenseitigen Information und Visualisierung basierendzed auf der web-basierten Server Retinobase 7,8.

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Protokoll

1. JOURNAL: Verfahren, um die Proben aus der OP-Block Recover

Im Labor

  1. Holen Sie sich einen Vertrag Einfuhr von Eilschiffahrtsgesellschaft.
  2. Füllen 10 (oder 25) bildet mit dem Versand Postanschrift des Labors, die die Ansprechpartner im Labor (Telefonnummer und E-Mail-Adresse).
  3. Planen 10 (oder 25) Proben Formen nummeriert von 1 bis 10 (oder 25). Diese Formen sind dedizierte Bereiche auf einer) anonyme Identifikation des Patienten informieren, b) das Datum der Operation und c) alle zusätzlichen Bemerkungen der Chirurg möchte hinzufügen. Bereiten 10 (oder 25) Versandtaschen (150 x 210 mm).
  4. Hergestellt unter Verwendung von RNAse-freie Reagenzien 25 (oder 65) ml 6 M Guanidinchlorid in Diethylpyrocarbonat (DEPC) H 2 O (GHCl) behandelten.
  5. Füllen Sie 10 oder 25 nummerierte 5 ml sterile Polyethylen Rundbodengefäße mit 2,4 ml Lösung GHCl.
  6. Gebrauchte Argongas, um den oberen Teil dieser Rohre zu füllen, dann drücken tightly auf der Kappe, um die Oxidation des GHCl Lösung über mehrere Jahre der Lagerung in der chirurgischen Kabinett zu verhindern.
  7. Führen Sie alle 5-ml-Röhrchen in einem 50 ml sterile Polypropylen Spitzboden Rohr mit Schraubverschluss. Verwenden Sie ein sauberes Papiertuch, um die 5-ml-Tube in der 50 ml Tube halten, schließen Sie das Rohr.
  8. Legen Sie die 50 ml Röhrchen auf einer Polystyrol-Rack und die Zahnstange in einem Karton mit den gepolsterten Umschläge, die Versandkosten Formen, die Proben Formen.
  9. Fügen Sie den Anweisungen (siehe: 1,12-1,19) Innenseite des Deckels der Karton zu ihrer Lektüre zu erleichtern.
  10. Senden Sie den Karton per Post an die Ansprechpartner in der Klinik.

Im Krankenhaus

  1. Bringen Sie den Karton aus dem Schrank zu chirurgischen Operationssaal. Warnhinweis: Wenn das Verfahren beinhaltet einen immungeschwächten Patienten, der Karton sollte nicht auf den Operationssaal gebracht werden.
  2. Während der Operation, platzieren Sie den retinalen Specimen in nummerierten 5 ml sterile Polypropylen mit GHCl Lösung gefüllt. Schließen Sie den Schlauch fest.
  3. Bringen Sie den Schlauch kurz.
  4. Das Röhrchen wird auf das Blut Rohr Wippe für 10 min.
  5. Füllen Sie das beigefügte Formular Probe nummeriert.
  6. Melden die Identifikationsnummer auf den entsprechenden Nummern 50 ml Tube.
  7. Führen Sie die 5-ml-Tube mit dem chirurgischen Probe in die 50-ml-Tube, ersetzen Papiertaschentuch und schrauben Sie den Schlauch.
  8. Führen Sie das Rohr und die gefüllte Probe Form hinein in eine der begleitenden gepolsterten Umschlägen. Schließen Sie es.
  9. Rufen Sie den Eilschiffahrtsgesellschaft für die Abholung.

2. RNA Purification

Im Labor

  1. Homogenisieren der Probe in seiner 5-ml-Tube mit Polypropylen GHCl Lösung mit einem Homogenisator für 1 min, während sie sich das Rohr nach oben und unten.
  2. In 270 ul 2 M Kaliumacetat pH 5,0. Durch kräftiges Schütteln für 10 min, indem das Röhrchen auf einem Schüttler in seinerhorizontale Position (420 min -1).
  3. Zentrifuge 10 min bei 5.000 rpm (6.500 xg) bei 20 ° C.
  4. Saugen Sie sanft die lösliche Fraktion, ohne das Pellet.
  5. Übertragen in eine 14 ml sterilen Röhrchen.
  6. In 5,3 ml 100 mM Tris pH 8,0, N-Lauroylsarcosin 1%.
  7. In 3,2 g Cäsium-Chlorid (CsCl) und mischen Sie den Schlauch durch Vortexen.
  8. In 1,8 ml CsCl / Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in einem sterilen 11 ml Polyallomer-Zentrifugenröhrchen.
  9. Mit 10 ml sterile Pasteur-Pipette, übertragen die RNA-Lösung auf 1,8 ml CsCl / EDTA, indem langsam auf dem Rand der Röhre zu verhindern, daß die Dichte Kissen.
  10. Die Röhrchen (eine zweite Röhre enthält, die Puffer ohne Netzhaut falls erforderlich) in den Rotor.
  11. Zentrifuge 24 h bei 32.000 rpm (225.000 xg) bei 20 ° C.
  12. Entfernen Sie den oberen Teil der Lösung mit einer sterilen Pasteurpipette und entsorgen.
  13. Entfernen allmählich während der Überprüfung derMoment, wenn die DNA (viskose) mit einer zweiten sterilen Pasteurpipette abgesaugt, und entsorgen.
  14. Entfernen Sie die verbleibende Lösung kümmert sich nicht um die RNA-Pellet mit einem dritten sterilen Pasteurpipette freizugeben.
  15. Abschnitt der Boden des Röhrchens mit einem Skalpell Flamme sterilisiert, dann die restlichen Teil des Rohres es kopfüber auf einem sterilen Blick.
  16. Kehren Sie den Schlauch und spülen zart mit 160 ul GHCl.
  17. Lassen Sie das Pellet trocken für 10 min.
  18. Das Pellet in 150 ul (10 mM Tris pH 7,5 bis 1 mM EDTA - 0,1% SDS).
  19. Übertragen Sie die Lösung in eine 2 ml sterile Mikrozentrifugenröhrchens, dann ernten die restliche Pellet mit 30 ul (10 mM Tris pH 7,5 bis 1 mM EDTA - 0,1% SDS).
  20. In 150 ul (10 mM Tris pH 7,5 bis 1 mM EDTA).
  21. In 30 ul 3 M Natriumacetat pH 5,0, Vortex die Röhre.
  22. In 900 ul Ethanol 100% (-20 ° C), Vortex die Röhre.
  23. Das Röhrchen 30 min in schmelzendem Eis.
  24. Cenfuge das Rohr 30 min bei 15.000 rpm bei 4 ° C.
  25. Saugen Sie vorsichtig die lösliche Fraktion, und entsorgen Sie sie.
  26. In 500 ul 70% Ethanol (RT), Vortex die Röhre.
  27. Das Röhrchen 20 min bei 15.000 rpm (18.000 × g) bei 4 ° C.
  28. Wiederholen Sie den Spülvorgang (70% Ethanol).
  29. Kurz zentrifugieren und beseitigen das restliche Ethanol mit einer Pipette P200.
  30. Lassen Sie das Pellet Luft trocknen für 10 min.
  31. Das Pellet in 50 ul DEPC-behandeltem H 2 O.
  32. Mischen Sie kräftig durch Vortexen.
  33. Inkubieren 15 min bei 45 ° C in einem Wasserbad inkubiert.

3. RNA-Analyse durch Gelelektrophorese

  1. Gießen Sie ein Agarosegel in einem chemischen Kapuze.
  2. In einem sterilen 1,5-ml-Röhrchen, fügen Sie 2 ul RNA analysiert werden und 6,4 ul Probenvorbereitung Puffer.
  3. In einem zweiten 1,5-ml-Röhrchen, fügen Sie 3 ul RNA-Standards und 9,6 ul Probenvorbereitung Puffer.
  4. Erhitzen Sie die Röhrchen 15 min bei 65 ° C, Legte sie auf Eis.
  5. 1 ul Ethidiumbromid (EB) Ladepuffer ohne Farbstoff in der RNA-Probe Rohr und 1 ul EB Ladepuffer mit Farbstoff in der RNA-Standards Rohr.
  6. Die Elektrophorese unter 80 - 100 V Innerhalb einer chemischen Haube in Laufpuffer, bis einer der Farbstoffe (Bromphenolblau) erreicht 2/3 von der Unterseite des Gels.
  7. Spülen Sie das Gel zweimal 15 min mit 250 ml de DEPC-behandeltem 2x SSC.
  8. Nehmen Sie ein digitalisiertes Bild unter UV-Beleuchtung.
  9. Berechnen des Verhältnisses zwischen dem oberen Band (23S rRNA) und das untere Band (16S rRNA).

4. Die endgültige Reinigung der RNA

  1. Stellen Sie die Lautstärke der RNA-Probe auf 100 ul mit DEPC-behandeltem H 2 O (falls erforderlich).
  2. 100 l von Acid Phenol (1 ml Phenol gesättigt in DEPC-behandeltem H 2 O + 130 ul 50 mM Natriumacetat, pH 5,2) zugeben und kräftig vortexen.
  3. Zentrifugieren 10 min bei 13.000 rpm (15.000 × g) bei Raumtemperatur.
  4. Recover sorgfältig und übertragen Sie die wässrige Phase (obere Phase) in einem Roman eine sterile 1,5-ml-Röhrchen.
  5. In 10 ul 3 M Natriumacetat, pH 5,2 und 250 ul Ethanol 100% (-20 ° C).
  6. Das Röhrchen 30 min in schmelzendem Eis.
  7. Das Röhrchen 30 min bei 14.000 rpm (18.000 xg) bei 4 ° C.
  8. Saugen Sie sorgfältig die lösliche Fraktion, und entsorgen Sie sie.
  9. In 500 ul 70% Ethanol (Raumtemperatur), und das Röhrchen vortexen.
  10. Das Röhrchen 20 min bei 14.000 rpm (18.000 xg) bei 4 ° C.
  11. Wiederholen Sie den Spülvorgang (70% Ethanol).
  12. Kurz zentrifugieren und beseitigen das restliche Ethanol mit einer Pipette P200.
  13. Luft trocknen lassen das Pellet für 10 min.
  14. Das Pellet in 50 ul DEPC-behandeltem H 2 O.
  15. Inkubieren dann Röhrchen 15 min bei 45 ° C.
  16. Messen Sie die Absorption (Abs) bei 260 nm und 280 nm auf 2 ul der RNA-Probe. Berechnet das Verhältnis Abs260/Abs280.
  17. Store die RNA-Probe bei -80 ° C (stabil für mehrere Jahre).

5. Lösungen und Reinigungsverfahren

  1. Kaliumacetat 2 M, pH 5.0: Lösen 19,6 g Kaliumacetat in 70 ml DEPC-H 2 O. behandelt Reinigen Sie das pH-Meter Sonde durch Einweichen in mit 1 M NaOH für 15 min, gefolgt von 5 Spülungen mit DEPC-behandeltem H 2 O. Auf pH 5,0 mit Essigsäure dann die Lautstärke auf 100 ml mit DEPC-H 2 O. behandelt
  2. Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, N-Lauroylsarcosine 1%: Man löst 2 g N-Lauroylsarcosine (unter einer Haube) in 40 ml 0,5 M Tris-Base pH 8,0. Stellen Sie die Lautstärke auf 200 ml mit DEPC-H 2 O. behandelt) CsCl / EDTA: 96 g CsCl in 50 ml 10 mM EDTA pH 7,5 mit DEPC-H 2 O. behandelt vorbereitet Autoklav und die Lautstärke auf 100 ml mit DEPC-behandeltem H 2 O. Überprüfen Sie für pH <7,5.
  3. Agarosegel 1%: Setzen Sie 1 g Agarose in 62 ml DEPC-H 2 O. behandelt Kochen in der Mikrowelle. In 18 ml von 12,3 MFormaldehyd, 20 ml 5x MOPS. Gießen Sie in einem chemischen Kapuze.
  4. Probenvorbereitung Buffer: Um vorbereitet extemporary sein. Mischen Sie in einer chemischen Haube 8 ul 5x MOPS, 16 ul 12,3 M Formaldehyd und 40 ul Formamid.
  5. EB Ladepuffer (ohne Farbstoff): Um vorbereitet extemporary sein. In 4 ul 10 mg / ml Ethidiumbromid in 20 ul 80% Glycerin mit DEPC-behandeltem H 2 O. vorbereitet
  6. EB Ladepuffer (mit Farbstoff): Um vorbereitet extemporary sein. In 2 ul 10 mg / ml Ethidiumbromid in 10 ul 80% Glycerin enthält 0,25% Xylem cyanol, 0,25% Bromphenolblau mit DEPC-H 2 O. behandelt
  7. Laufpuffer: Zu 60 ml 5x MOPS, fügen Sie 54 ml 12,3 M Formaldehyd und 186 ml DEPC-behandeltem H 2 O.
  8. Inkubieren destilliertem Wasser mit 0,1% v / v Diethylpyrocarbonat für 2 Stunden bei 37 ° C unter Rühren: H 2 O DEPC-behandelt. Sterilisieren im Autoklaven.
  9. Reinigung der Homogenisator: 25 ml Reinigungslösung (RBS) zu 1 l DEPC-behandelt H 2 O, und tauchen die Achse 1 min unter Rühren. Inkubieren 2 Std bei 60 ° C. Gründlich mit DEPC-behandeltem H 2 O Wickeln Sie das Gerät in Aluminium und in das Gerät ein. Wickeln Sie die Box. Sterilisieren im Autoklaven.
  10. Reinigung des Elektrophoresevorrichtung: Waschen Sie das Gerät, das Fach und die 15-Brunnen komb. Inkubieren 15 min in 3% Wasserstoffperoxid. Spülen einmal mit 100% Ethanol. Air trocken.
  11. Reinigung der Glasschalen: Reinigen Sie das Glas Gerichte RBS 2% die ganze Nacht, dann mit destilliertem Wasser vor der Sterilisation gründlich bei 200 ° C.

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Ergebnisse

Das Verfahren Journal (Abbildung 1) ermöglicht es uns erholen Exemplare der Netzhaut von der chirurgischen Block gereinigte RNA, und das Transkriptom der Netzhautablösung zu analysieren. Netzhautablösung führt zur Hochregulation des Monozyten chemotaktische MCP1 Gen CCL2, und in der Abnahme der Expression der Stange Photorezeptor Transduzieren Gen GNAT1, die Kurzwelle Kegel Opsin OPN1SW und die homeogene CRX (Abbildung 2). Die Induktion von Entzündung...

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Diskussion

Die Entwicklung eines Verfahrens zur Gewebe Erholung von der OP-Block ist wesentlich für die Transkriptom-Analyse der Netzhautablösung. Man sollte beachten, dass diese Art der Operation in Not und die Augenärzte Betriebssystem haben wenig Zeit, um in einer biologischen Forschungsprogramm teilnehmen, wenn sie tätig wird geübt. Diese Retinektomie auch stochastisch in jeden Dienst durchgeführt, so dass der einfachere Weg zu statistischen Zahlen erreichen, mit einem Netzwerk zu arbeiten. In einem solchen Netzwerk ist die St...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Wir danken Sacha Reichmann und Dominique Santiard-Baron für ihre Hilfe bei der Bearbeitung der RNA Aufreinigung Protokoll.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
ZentrifugeBeckman CoulterAventi J-E
RotorBeckman CoulterJS-5.3
UltrazentrifugeBeckman CoulterLE 80K
RotorBeckman CoulterSW41
NetzteilBioradPac 3000
PolytronTMKinematicaPT 2100Geliefert mit PT-DA 2105:2
Agarose-GelelektrophoresegerätBioradMiniGel Cell GT
Imaging System BioradGelDoc-It Imager
5 ml steriles Polyethylen-RöhrchenGreiner115261
Steriles Polyallomer-Zentrifugenröhrchen Beckman Coulter331372
Chemische ReagenzienSigmaMolekularbiologische Qualität (RNase- und DNase-freie Produkte)
Reinigungslösung VWRRBS
Microarray-ChipAffymetrixHuman U133 plus 2 Arrays

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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