Accelerated Typ 1 Diabetes Induktion in Mäusen durch adoptiven Transfer von CD4 + T diabetogene Cells

Zusammenfassung

Wir bieten eine reproduzierbare Methode, um Typ-1-Diabetes (T1D) bei Mäusen innerhalb von zwei Wochen zu induzieren durch den adoptiven Transfer von Insel-Antigen-spezifischen, primären CD4 + T-Zellen.

Zusammenfassung

Die nonobese diabetischen (NOD) Maus spontan entwickelt Autoimmun-Diabetes nach 12 Wochen alt und ist der am intensivsten untersuchten Tiermodell der menschlichen Typ-1-Diabetes (T1D). Zelltransfer Studien in bestrahlte Mäuse Empfänger haben festgestellt, dass T-Zellen sind entscheidende in T1D Pathogenese in diesem Modell. Wir beschreiben hier ein einfaches Verfahren, um schnell durch adoptiven Transfer von gereinigtem T1D induzieren primäre CD4 + T-Zellen von Pre-diabetischen NOD-Mäusen transgen für die Insel-spezifischen T-Zell-Rezeptor (TCR) BDC2.5 in NOD.SCID Empfängermäuse. Die wesentlichen Vorteile dieser Technik sind, dass Isolation und adoptiven Transfer von T-Zellen diabetogene abgeschlossen werden kann innerhalb des gleichen Tages, Bestrahlung der Empfänger nicht erforderlich ist, und eine hohe Inzidenz von T1D ist innerhalb von 2 Wochen nach entlockte T-Zell-Transfer werden. So können Untersuchungen der Pathogenese und therapeutische Interventionen in T1D mit einer schnelleren Rate als bei Methoden, die auf heterogenen T-Zell-Populationen oder Klonen verlassen gehenabgeleitet von diabetischen NOD-Mäusen.

Einleitung

Die NOD-Maus entwickelt Autoimmundiabetes spontan und wurde vielfach als Tiermodell für die menschliche T1D ^1,2 verwendet. Pathogenese der T1D in NOD-Mäusen durch Infiltration, beginnend bei 3-4 Wochen alt, der pankreatischen Langerhans-Inseln von dendritischen Zellen und Makrophagen durch T und B-Zellen folgte. Diese Phase der zerstörungsfreien peri-Insulitis führt zu einem langsamen, fortschreitenden Zerstörung der Insulin-produzierenden β-Zellen der Bauchspeicheldrüse, was zu manifester Diabetes von 4-6 Monaten ³ Jahren. Übertragen von Splenozyten ^4,5, CD4 + oder CD8 + ^{6,7 8,9} T-Zellen von diabetischen NOD-Mäusen haben gezeigt, dass Diabetes bei immungeschwächten Mäusen NOD vermitteln, was anzeigt, dass Insel-reaktiven T-Zellen eine zentrale Rolle in T1D Pathogenese spielen. Abhängig von den experimentellen Bedingungen, entwickelt Diabetes in Empfängermäuse langsam, über mehrere Wochen in diesen Studien. Ebenso verschiedenen T-Zell-Klone, von Zeit-und kostenintensive abgeleitetKultivieren von diabetogenen T-Zellen wurde berichtet, Diabetes mehrere Wochen nach der Überführung in Empfängermäuse ^7,10 vermitteln. Mit der Verfügbarkeit von transgenen Mäusen, die TCRs von CD4-oder CD8-restringierte T-Zell-Klone diabetogen, mehreren Laboratorien abgeleitet wurden später gezeigt, dass Milz-T-Zellen aus diesen Mäusen in der Lage, Diabetes Empfänger ^11-13 übertragen wurden. Insbesondere sind BDC2.5 NOD-Mäuse transgen für das BDC2.5 TCR, die spezifisch für Chromogranin A, ein Protein in pankreatischen beta-Zellen ^14-16 ist. Übertragen von in vitro-aktivierten oder un-aktivierte ganz oder fraktionierte Milzzellen offen Diabetiker oder prediabetic BDC2.5 Mäuse übertragen Diabetes bei Neugeborenen oder immungeschwächten NOD-Mäuse in unterschiedlichen Wirkungsgrade ^11,17-19.

Wir beschreiben eine einfache Methode, die gereinigt transgenen CD4 + T-Zellen nutzt von Pre-diabetischen Mäusen BDC2.5 in Empfängermäuse bei hohem Wirkungsgrad und consiste T1D induzierenncy. Eine große Anzahl von naiven Insel Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen aus diesen Mäusen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) für CD4 + CD62L + T Zellen, die das transgene TCR Vβ4 Kette isoliert. Gereinigtes transgenen T-Zellen werden dann ohne Aktivierung in NOD.SCID Mäusen, die Funktions-T-und B-Zellen fehlt und Insulitis-und Diabetes-freie ²⁰ übertragen. Die Empfänger-Mäuse werden für erhöhte Konzentrationen von Urin Glucose T1D anzeigt, die sich schnell entwickelt sich innerhalb von zwei Wochen nach der T-Zell-Transfer überwacht.

Im Gegensatz zu anderen Methoden, die übertragen diabetogene T-Zellen mit heterogenen Besonderheiten, unser Protokoll FACS-sortierten CD4 + T-Zellen, die fast ausschließlich Ausdruck der diabetogene BDC2.5 TCR verwendet. Aufgrund ihrer Homogenität, sind nur eine kleine Anzahl von T-Zellen übertragen (~ 1x10 ⁶ Zellen / Maus) für die schnelle Entwicklung T1D innerhalb von 2 Wochen bei 100% Inzidenz erforderlich. Ein weiterer Vorteil ist, dass unser Protokoll irradiation des Empfängers Mäusen ist nicht notwendig, da es für einige andere Methoden. Ein möglicher Nachteil dieser Methode ist, dass es nicht zulassen, die Untersuchung der Beteiligung von CD4 und CD8 T-Zell-Untergruppen oder insbesondere CD8-T-Zellen bei Diabetes.

Die beschriebene Protokoll wird nützlich für die Untersuchung schneller T1D Entwicklung von naiven monospezifischen CD4 + T-Zellen, sowie therapeutische Strategien vermittelt, um in Homing von Inselzellen-Antigen-spezifische Th-Zellen in das Zielorgan eingreifen.

Protokoll

1. Isolierung von T-Zellen aus Milz und Lymphknoten von Mäusen BDC2.5

1. Verwenden Sie 6 Wochen alten Pre-diabetischen weiblichen Mäuse BDC2.5 als Spender von diabetogene CD4 + T-Zellen. Mäuse sollten Diabetes-frei durch Uringlucose Messung (siehe unten) bestimmt.
2. Euthanize jede Maus mit CO _2-Erstickung und entfernen Sie die Milz, Achsel-und brachial Lymphknoten unter sterilen Bedingungen. Um die Milz zu entfernen, tränken Sie das Fell mit 70% Ethanol, dann geschnitten und einfahren Haut. Die Milz wird sichtbar als dunkelrotes Organ auf der linken Seite der Maus. Machen Sie eine 1-Zoll-Schnitt im Bauchfell mit den kleinen Schere und sanft greifen die Milz in der Mitte mit einem Paar kleine Pinzette. Sorgfältig schneiden das Bindegewebe und die angeschlossenen Fett so weit wie möglich zu entfernen und die Milz.
3. Sammeln Sie die Milz und die Lymphknoten in 10 ml Dulbecco's-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) in einem 15 ml konischen Röhrchen auf Eis.
4. Bereiten Sie eine einzelne Zelle Suspension mit the Ende einer sterilen 10 ml Spritze Kolben vorsichtig auf die lymphatischen Organen durch 70 um Zelle Siebe (eine pro Milz Sieb und 4-6 Lymphknoten pro Sieb) in den gleichen 50 ml konischen Röhrchen.

Während des Prozesses, spülen jedes Sieb mit 1 ml DMEM mehrmals, um die Gewinnung von Zellen aus dem Sieb zu maximieren.

5. Übertragen der gesammelten Zellen von dem 50 ml konischen Röhrchen in ein 15 ml konischen Röhrchen und zentrifugieren bei 300-400 xg für 7 min bei RT.
6. Um rote Blutzellen lysieren, den Überstand verwerfen, wieder die Zellen in 5 ml Ammonium-Chlorid-Kalium (ACK)-Puffer (pH 7,2) und inkubieren Sie die ACK-Zell-Suspension bei RT für 5 min.
7. 10 ml DMEM dem ACK-Zell-Suspension und zentrifugieren wie oben. Waschen Sie das Zellpellet einmal in 10 ml DMEM.

2. Fluorescence-Activated Cell Sorting von diabetogene CD4 + T-Zellen von Mäusen BDC2.5

1. Re-suspend Zellen in 5 ml FACS sTaining Puffer und zählen die Anzahl der lebensfähigen Zellen (mit einem Phasenkontrast-Mikroskop und einer Zählkammer) durch Trypanblau Ausgrenzung.
2. Mit FACS-Puffer, passen die Zellsuspension Volumen bis 5 x 10 ⁷ Zellen / ml. Entfernen ~ 1 x 10 ⁶ Zellen pro Färbung Kontrolle (1 keine Flecken, 3 Einzelzimmer Flecken). Färben der Probe auf nicht-aktivierten transgenen CD4 + T-Zellen mit anti-CD4 (APC), anti-TCR Vβ4 (FITC) und Anti-CD62L (PE) monoklonaler Antikörper (mAb) in einem 15 ml-Röhrchen. Führen Zellfärbung mit den mAb Konzentrationen vom Hersteller für 20-30 min schlug bei 4 ° C im Dunkeln.
3. Waschen Sie die Probe und einzigen Fleck Kontrollen mit FACS-Puffer bei> 3X der Färbereaktion Volumen. Zentrifugieren bei 300-400 xg, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren die Zellen in FACS-Puffer (1-2 x 10 ⁷ Zellen / ml für die Sortierung von Probe und 300 ul für einzelne Fleck Kontrollen) und auf Eis lagern bis zum nächsten Schritt.
4. Übergeben Sie die Zelle Probe durch eine 35 um ZelleSieb Haubenrohr zu entfernen Zellklumpen. Ordnen Sie die Proben für CD4 + TCR Vβ4 + CD62L + Zellen auf einem Cell Sorter mit einem geschulten Bediener. Sammeln Sie die sortierten Zellen in 3 ml DMEM in einer 15 ml Tube. Erlauben 2,5-3 Std., einschließlich Setup, bis 1,5 x 10 ⁸ Zellen (die ungefähre Anzahl von Zellen aus 3 Donormäusen erhalten) an einer Art von 2 x 10 ⁴ insgesamt events / sec sortieren. Erwarten ~ 2,5 x 10 ⁶ nicht aktivierten transgenen CD4 + T-Zellen pro Maus nach cell sorting.
5. Notieren Sie sich die absolute Zahl der sortierten Zellen am Ende der Sortierung und zentrifugieren für 7 min bei 300-400 g x. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren die Zellen (2 x 10 ⁶ Zellen / ml) in steriler Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) (Mg ^{2 +} / Ca ^{2 +-frei)} für die T-Zell-Transfer Adoptiveltern.

3. Adoptiven Transfer von CD4 + T diabetogene Zellen aus BDC2.5 Mäuse

1. Mit einer 1-ml-Spritze und ein 18-1 ½-Gauge-Nadel, sanft resuspendieren die FACS-gereinigten CD4 +T-Zellen und laden Sie die 1 ml Spritze. In Vorbereitung zur Injektion, ersetzen Sie den 18-1 ½-Gauge-Nadel mit einer 27-Gauge-Nadel ½.
2. Expose 6-8 Wochen alte weibliche NOD.SCID Empfängermäuse einer Wärmelampe, bis sie Pflege Verhalten zeigen.
3. Zurückhalten Empfängermäuse in einem Verzögerer und wischen dem Schwanz mit 70% (v / v) Ethanol, um die Injektionsstelle zu desinfizieren.
4. Spritzen 1-2 x 10 ⁶ FACS sortierten Zellen / Maus (in bis zu 500 ul PBS) entweder in der seitlichen Schwanzvenen.

Nicht mit Gewalt den Kolben. Wenn die Nadel richtig in der Vene liegt, wird die Einspritzung fast ohne Widerstand zu nehmen.

4. Überwachung Empfänger Mäuse für Hyperglykämie und T1D

1. Beginnend fünf Tage nach der T-Zell-Übertragung werden NOD.SCID Empfängermäuse täglich erhöhten Urin Glucose unter Verwendung von Teststreifen (Bayer Diastix) gemäß den Anweisungen des Herstellers überwacht. Mäuse, die mit zwei aufeinanderfolgenden urine Blutzuckerwerte> 250 mg / dl gelten als Diabetiker.

Ergebnisse

Unsere Ergebnisse zeigen, die Isolierung von transgenen BDC2.5 exprimieren CD62L, die kritisch für die T-Zellen, nach Hause zu sekundären lymphatischen Organe wie Lymphknoten an ist. Unsere Ergebnisse zeigen weiterhin die starke Fähigkeit dieses monospezifische T-Zell-Population, um schnell und effizient zu übertragen NOD.SCID Empfängermäuse T1D.

Isolierung von diabetogenen CD4 + T-Zellen von Mäusen BDC2.5 ist in Abbildung 2 dargestellt. Ungefähr 5 x 10 ⁷ Zellen a...

Diskussion

T1D in Empfängermäuse bei unterschiedlichen Wirkungsgrade durch adoptiven Transfer von ganzen Milzzellen oder T-Zell-Untergruppen von diabetischen NOD-Mäusen oder Mäusen transgenen TCR von diabetogene T-Zell-Klone abgeleitet induziert werden. Wir berichten hier über ein reproduzierbares Verfahren zur Induktion in Empfängermäuse innerhalb von zwei Wochen T1D bei 100% Inzidenz durch Übertragung FACS-gereinigten CD62L + BDC2.5 transgenen CD4 + T-Zellen in Mäusen NOD.SCID.

Besondere Vorteile der...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
BDC 2.5 TCR-transgene NOD-Mäuse (NOD. Cg-Tg(Tcrα BDC 2.5, Tcrβ BDC 2.5)	JAX	004460
NOD. SCID-Mäuse (NOD. CB17-Prkdcscid/J)	JAX	001303
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Themo Scientific	SH30022.01
Bayer Diastix	Fisher Scientific	AM2803
15 ml konische Röhrchen	Falcon	352095
50 ml konische Röhrchen	Falcon	352070
Sterile chirurgische Pinzette
Sterile kleine Schere
Sterile große Schere
70 μ m-Zell-Siebe	Fisher Scientific	22363548
35 μ m cell Sieb Kappe Röhrchen	BD Biosciences	352235
Ammonium-Chlorid-Kalium (ACK) Puffer			0,15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA, pH 7,2 in dH2O
BD FACSFlowTM Mantelflüssigkeit	BD Biosciences	342003
FACSFärbepuffer			PBS, 0,2 mM EDTA, 0,5 % BSA/FCS, Filter sterilisiert
Phasenkontrastmikroskop
Trypanblau
Hämozytometer
Anti-CD4 (APC) mAb	Biolegend	1005616	Klon RM4-5
Anti-TCR Vβ 4 (FITC) mAb	BD Biosciences	553365	Klon KT4
Anti-CD62L (PE)	mAb BD Biosciences	553151	Klon MEL-14
Zellsortierer	BD Biosciences		z.B. BD FACSAria III
Wärmelampe
Maus-Rückhalteapparat
1 ml Spritzen	Becton Dickinson	309602
18-1½ Messnadeln (steril)	Becton Dickinson	305196
27½ Messnadeln (steril)	Becton Dickinson	305109