Eine einfache und effiziente Methode, um Nuclear Factor Aktivierung in menschlichen Neutrophilen Erkennen von Durchflusszytometrie

Summary

Neutrophile sind die häufigsten Leukozyten im Blut. Neutrophile besitzen transkriptionell reguliert Funktionen wie Produktion von entzündungsfördernden Zytokinen und Hemmung der Apoptose. Diese Funktionen können mit dem hier vorgestellten Verfahren, die Detektion und Quantifizierung von nuklearen Faktoren können mittels Durchflusszytometrie in isolierten Zellkernen untersucht werden

Abstract

Neutrophile sind die häufigsten Leukozyten im peripheren Blut. Diese Zellen sind die ersten, an den Standorten der Entzündung und Infektion auftreten und somit als erste Verteidigungslinie gegen eindringende Mikroorganismen. Neutrophile besitzen wichtige Funktionen wie antimikrobielle Phagozytose, Freisetzung von lytische Enzyme, und die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies. Zusätzlich zu diesen wichtigen Abwehrmechanismus funktioniert, führen Neutrophilen andere Aufgaben in Reaktion auf eine Infektion wie die Produktion von entzündungsfördernden Zytokinen und Hemmung der Apoptose. Zytokine rekrutieren andere Leukozyten, die klar die Infektion zu helfen, und die Hemmung der Apoptose ermöglicht die Neutrophilen, länger zu leben am Ort der Infektion. Diese Funktionen werden auf der Ebene der Transkription reguliert. Da jedoch Neutrophilen kurzlebigen Zellen sind, kann die Untersuchung von transkriptionell reguliert Reaktionen in diesen Zellen nicht mit herkömmlichen Reportergen Verfahren durchgeführt werden, da es keine effiziente sindziente Techniken für neutrophilen Transfektion. Hier stellen wir eine einfache und effiziente Methode, die Detektion und Quantifizierung von nuklearen Faktoren isoliert und immunmarkierten Kerne mittels Durchflusszytometrie erlaubt. Wir beschreiben Methoden zur reinen Neutrophilen aus humanen peripheren Blut zu isolieren, diese Zellen zu stimulieren mit anti-Rezeptor-Antikörpern, zu isolieren und immunolabel Kerne und analysieren Kerne durch Durchflusszytometrie. Die Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um NF-kappaB und Elk-1 Kernfaktoren in Kernen von Neutrophilen und anderen Zelltypen erkennen. Somit stellt diese Methode eine Option zum Analysieren Aktivierung von Transkriptionsfaktoren an isolierten Kernen aus einer Vielzahl von Zelltypen.

Introduction

Neutrophile sind die häufigsten Leukozyten im peripheren Blut ^ein. Während Entzündungen und Infektionen Neutrophile sind die ersten Zellen, die an der betroffenen Stelle erscheinen, wo sie als erste Verteidigungslinie ² handeln. Neutrophile besitzen mehrere antimikrobielle Mechanismen ³ einschließlich Phagozytose, die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies, die Freisetzung von lytischen Enzymen durch Degranulation und Produktion von entzündungsfördernden Zytokinen ^4,5. Neutrophile sind kurzlebige Zellen, die sich schnell durch Signalisierung von verschiedenen Rezeptoren auf der Zelloberfläche werden aktiviert. Obwohl Ne....

Protocol

Ein. Isolation von Neutrophilen (PMN) aus menschlichem Blut

1. Verwenden etwa 20 ml Humanblut mit Heparin (10 U / ml) als Antikoagulans. Blut wurde von gesunden erwachsenen Freiwilligen durch intravenösen gesammelt. UNAM - Alle Experimente wurden unter Zustimmung des Bioethik-Ausschusses am Instituto de Investigaciones Biomédicas getan.
2. Geben Sie 2 ml 6% Dextran T500 in PBS in einem 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen und 10 ml Blut. Mix durch Invertieren des Röhrchens zwei oder drei Mal und lassen Sie es für 45 Minuten sitzen, um für Blutsenkungsgeschwindigkeit ermöglichen.
3. In einem frischen 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen legte 5 ml ....

Results

Die Reinigung hier beschriebene Methode der Regel bietet unstimulierten Neutrophilen (PMN) mit einer Reinheit von mehr als 95% (Abbildung 1A). Isoliert PMN kann dann durch Vernetzung insbesondere Rezeptoren mit spezifischen monoklonalen Antikörpern stimuliert werden. Wir haben PMN durch Fc-Rezeptoren und Integrine (1B) stimuliert. Einmal stimuliert, PMN lysiert und Kerne mit hohen Ausbeuten isoliert. Kerne werden dann für eine bestimmte nuclear factor, wie die Kernfaktor kappaB (NF-kB),.......

Discussion

Die Reinigung hier beschriebene Methode ermöglicht die Isolierung von unstimulierten Neutrophilen (PMN) mit einer Reinheit größer als 95% (bestimmt durch mikroskopische Beobachtung), in einer kurzen Zeit. Manchmal kann durch Neutrophile Erythrozyten kontaminiert werden, wenn letztere nicht vollständig lysiert werden. Dies bedeutet in der Regel nicht auf die Technik, da Erythrozyten und PMN kann leicht als deutliche Zellpopulationen mittels Durchflusszytometrie unterschieden werden. Isoliert PMN kann dann durch Vernetzun.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Heparin	PiSA (Mexiko)
Dextran T500	Pharmacosmos A/S (Holbaek, Dänemark)	T1-Dextran T500
Ficoll-Paque	Pharmacia	17-0320-01
Natriumchlorid	Sigma	S7653
Natriumphosphat monobasisch	Sigma	S9638
Natriumphosphat zweibasisch	Sigma	S9390
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma	A2153	Cohn-Fraktion V
HEPES	Sigma	H3375
Kaliumchlorid	Sigma	P9541
wasserfreies Magnesiumchlorid	Sigma	M8266
DL- Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D9163
Trypanblau (0,4 % ige Lösung)	Sigma	T8154
Paraformaldehyd		Sigma P6148
Triton X-100	Sigma	X100
Fötales Rinderserum (FBS)	GIBCO	10437-028
Monoklonaler Antikörper IV.3	Medarex (Annandale, NJ)	025-1	Humanspezifischer monoklonaler anti-FcRII (CD32)
Antikörper 3G8	Medarex (Annandale, NJ)	028-2	humanspezifischer anti-FcRIII (CD16)
monoklonaler Antikörper TS2/16	Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA)	Gespendet von Dr. Martin Hemler	Humanspezifischer Anti-β 1 Integrin (CD29)
Monoklonaler Antikörper IB4	University of California, San Francisco	Gespendet von Dr. Eric J. Brown	Humanspezifisches Anti-β 2 Integrin (CD18)
F(ab')2 Ziegen Anti-Maus IgG	Cappel (Aurora, OH)	55468
FITC-konjugiert F(ab')2 Ziegen Anti-Maus IgG	Cappel (Aurora, OH)	55522
FITC-konjugiert F(ab')2 Ziegen Anti-Kaninchen IgG	Cappel (Aurora, OH)	55665
Anti-NF-κ B p50	Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)	sc-114	Polyklonaler Kaninchen-Antikörper
Anti-NF-κ B p65	Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)	sc-109	Kaninchen polyklonaler Antikörper
EQUIPMENT
15-ml-Zentrifugenröhrchen	Corning	430791
50-ml-Zentrifugenröhrchen	Corning	430291
Zentrifuge, Sorvall Tischgerät	Dupont Instruments	RT 6000D
pH-Meter	Corning	340
Pipetman Pipette P-20	Gilson	F123600
Pipetman Pipette P-200	Gilson	F123601
Pipetman Pipette P-1000	Gilson	F123602
Hämozytometer	Fisher Scientific	0267110
Mikroskop	Nikon	Eclipse E600
Inverses Mikroskop	Nikon	TMS
Wasserbad-Inkubator	Fisher Scientific	2IS-M
Mikrozentrifuge	Eppendorf	5414C
Mikrozentrifuge	Eppendorf	5418
Durchflusszytometer	Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ)	FACScalibur