Techniken für die Verarbeitung Augen mit einem Netzhautprothese für lokalisierte Histopathologische Analyse Implantierte

Retinal Prothesen könnten bald nützliche klinische Interventionen werden zur Behandlung von verschiedenen Formen der schweren Sehverlust. Bestimmte Bedingungen, wie Retinitis pigmentosa (RP), Ergebnis in der weitverbreiteten Degeneration der Photorezeptoren im Auge, das sind die Zellen, die zur Umwandlung von Licht in neuronale Signale. Jedoch bleiben einige Zellen in anderen Schichten der Netzhaut und sind potentielle Ziele für die elektrische Stimulation mit einem Netzhautprothese ^1. Erste Ergebnisse von klinischen Studien am Menschen haben für Elektroden-Arrays im epiretinalen ^{2,3, 4,5} subretinalen implantiert und intraskleralen ⁶ Standorten waren vielversprechend. Diese Geräte sind aus verschiedenen Materialien mit unterschiedlichen Formen, aber sie alle verwenden elektrische Impulse, um die restlichen lebensfähigen Neuronen der Netzhaut zu aktivieren, um visuelle Wahrnehmungen zu erstellen.

Unsere größeren Gruppe (Bionic Vision Australia) hat ein Retina-Implantat, das progres entwickelt hatsed zu einer klinischen Pilotstudie mit 3 RP-Patienten mit suprachoroidalen Elektroden-Arrays (Clinical Trial Number: NCT01603576) implantiert. 1A zeigt diese suprachoroidalen Prototyp Netzhautprothese.

Patientensicherheit ist von größter Bedeutung in klinischen Studien und damit vor Beginn der Studien am Menschen, wir umfangreiche akuten und chronischen Tests durchgeführt in präklinischen Modellen (Abbildung 1B). Histopathologische Einschätzungen waren unerlässlich, um die chirurgischen Verfahren zu verfeinern, durchlaufen Elektroden-Konstruktion und letztlich zu etablieren, die Sicherheit des Implantats. Um einen effizienten Workflow mit üblichen klinischen Pathologie Praktiken verzahnt halten, wurde eine Einbettung in Paraffin-Technik eingesetzt. Es war auch wünschenswert, Färbeprozeduren vergleichbar mit klinischen Standards wie Hämatoxylin und Eosin (H & E), die leicht von den Pathologen interpretiert nutzen. Wir wollten auch eine Technik, die für immunhistochemische Analysen angepasst werden könnte, inum weiter zu erleichtern zellulären Auswertung der Gewebe.

Die Biokompatibilität des Implantats Materialien und die Sicherheit der chronischen elektrischen Stimulation, müssen sorgfältig geprüft werden. Es ist wichtig, in der Lage, die Histopathologie von dem Augengewebe benachbart zu den einzelnen stimulierenden Elektroden in der Anordnung zu prüfen. Jedoch benötigt die Arrays vor der Bearbeitung der Proben, so dass sie getestet werden kann entfernt werden, und weil ihre Metallkomponenten nicht leicht geschnitten. Folglich hat unsere etablierten Gewebeaufbereitung nicht zulassen Lokalisierung und Abbildung von Gewebe in Bezug auf den implantierten Elektroden ^7. Neben dem Fehlen einer Gewebelokalisierung Verfahren führte die Standard-Formaldehyd-Basis Fixierung und Verarbeitungstechniken verbreitet Artefakte und Ablösung der Netzhaut durch die unterschiedliche Schrumpfung der verschiedenen Schichten des Auges (Abbildung 2). Aufgrund der Inhomogenität ter Netzhaut, war es schwierig, einen sinnvollen Vergleich mit Kontrollgewebe machen, besonders für quantitative Messungen. Diese kombinierten Einschränkungen erschwert eine genaue Beurteilung des potenziellen Schadens durch unsere implantiert Arrays verursacht.

Hier präsentieren wir neue Techniken zur Überwindung dieser Grenzen. Wir haben modifiziert spezialisierte Augenfixierung und Verarbeitungstechniken ^8-10, um die Kompatibilität mit Paraffin-Basis Histologie halten. Wir haben Standard-histologische und immunhistochemische Färbungen modifiziert werden, um vergleichbare Ergebnisse zu geben, basierend auf dem Feedback aus der klinischen Pathologen. Nach dem Rendern der Skleralgewebe transluzent wurde ein Farbstoff-Farben-Code verwendet, um das Augengewebe benachbart zu jeder einzelnen Elektrode zu markieren, bevor die Anordnung aus dem Suprachoroidalraum. Durch Markieren des Elektroden-Array und die einzelnen Elektrode Websites könnten Proben genau von der Elektrode angrenzenden Regionen gesammelt werden. Abgestimmte Proben konnten von th gesammelt werdene Kontrolle Auge um paarweisen Vergleiche zu erleichtern.

1. Enukleation und Post-Fixation

Dieses Protokoll setzt voraus, dass das Thema wurde einseitig mit einem suprachoroidalen Elektroden-Array implantiert.

1. Bereiten postfix Lösungen in Glas Schott Flaschen.
   1. Davidson Fixierlösung, 2x 100 ml
      • 2 ml Formalin (37% Formaldehyd)
      • 10 ml Eisessig (99,7%)
      • 35 ml Ethanol (98%)
      • 53 ml destilliertem Wasser
   2. 50%-igem Ethanol, 2 x 100 ml
   3. 70% Ethanol, 2 x 100 ml
2. Transkardial perfundieren Thema mit warm (37 ° C) heparinisierter Kochsalzlösung gefolgt von kaltem (4 ° C) neutral gepuffertem Formalin (10%).
3. Tie Nähte an der oberen Limbus (oder ein Ort, der fern von der suprachoroidalen Array) beider Augen - im Einklang mit einer Rektusmuskel, als Wahrzeichen dienen.
4. Enucleate Augen, etwaige Beibehaltung der externen Leitungen von der implantierten Auge.
5. Zeigen each Auge in 100 ml Fixierlösung Davidson und lassen bei Raumtemperatur Post-fix.
6. Nach 18 - 36 h in Davidsons Fixativ, zu 50% Ethanol (Raumtemperatur) übertragen für 6 - 8 Stunden, dann endlich zu 70% Ethanol (Raumtemperatur).
7. Kühlen Proben bei 4 ° C und Speicher bis Dissektion.

Intakte und Druck Auge Globen haben auf diese Weise gelagert bis zu 3 Monaten ohne Beeinträchtigung der resultierenden Histologie.

2. Identifizierung und Tissue Mapping

Die oben Fixierung Protokoll (Schritt 1) hat die Lederhaut durchscheinend gerendert und das Array ist jetzt sichtbar - inklusive der einzelnen Elektrode Websites (Abbildung 3).

1. Entfernen Sie die implantierten Globus aus Ethanol und sorgfältig wegschneiden überschüssiges Gewebe, einschließlich Bindehaut und Tenonkapsel. Trim Sehnerv zu einer 2 - 3 mm Länge (3A).
2. Mit einem histologischen Farbstoff marking Schema, beschriften Sie die Elektroden mit einem vordefinierten Farbcode, kümmert sich nicht um den Farbstoff zu verschmieren.

• Wir entschieden uns für einen handelsüblichen Suite von spezialisierten histologischen Farbstoff (siehe Anhang). Kleine Mengen des Farbstoffs wurden vorsichtig mit einer feinen Spitze Pinsel (Roymac Größe 00) auf das Gewebe aufgetragen und an der Luft für bis zu 5 min trocken.
• Für unsere Zwecke haben wir uns entschieden: grün für den aktiven Elektrode (n), die (waren) war angeregt maximal bei überschwellige Ebenen, für die Dauer der Studie; rot für andere aktive Elektroden, gelb für die größeren Durchmesser Rückkehr Elektroden und Blau für zusätzliche Führungen und / oder anatomischen Abstand Markierungen (3B und 3C).
• Einige trial and error erforderlich sein, um einen Farbstoff, der stabil ist in den nachfolgenden Schritten zu finden. Zum Beispiel in Figur 4 ist ersichtlich, dass der grüne Farbstoff elastischer als der roten Farbstoffs werden. Verdünnung der Farbstoff in 70% Ethanol verbessert Lipid penetration und Gewebe-Beschichtung.
• Es ist sinnvoll, skizzieren oder fotografieren das gefärbte Globus für die Zukunft.

3. Zurück zu 70% Ethanol, um den Farbstoff zu entwässern.
4. Wiederholen Sie Schritt 2.1 für die Steuerung unimplantierten Globus.
5. Mit den Fäden aus Schritt 1.3, richten Sie die Steuerung und das Auge implantiert Auge als gespiegelten Paar.
6. Platzieren eines Silikon-Vorlage (mit den gleichen Abmessungen wie die Elektrodenanordnung) in dem gespiegelten Position auf der Steuerung Auge als das Implantat implantiert Auge (NB die lichtdurchlässige Sklera und der Farbstoff Markierungen von Schritt 2.2 liegt damit bereit Visualisierung der implantierten Position im Array ).
7. Die Schritte 2.2 und 2.3 für die Steuerung Auge, so daß jede Elektrode implantiert ein Steuerelement Paar hat in einer anatomisch vergleichbar (dh spiegelgleichen Äquivalent) Lage.

3. Dissection und Einbettung

1. Entnehmen Sie das Implantat Array aus dem Auge und nehmen Sie die Vorderseite des Auges(Einschließlich der Hornhaut, Iris und Linse). Entfernen Sie die Glaskörper aus dem verbleibenden Auge cup (hintere Kammer).
2. Präparieren des implantierten Auge in mehrere Vertreter Streifen (~ 2 mm Dicke), die jeweils eine Teilmenge der Farbstoff markierte Bereiche (3D). Man beachte, dass die Orientierung der Streifen so zu wählen, bei der Beurteilung der verschiedenen Aspekte der Gewebereaktion auf das Implantat ⁷ zu unterstützen.

Es ist sinnvoll, für die Zukunft, um einen Datensatz von dem Farbstoff Regionen vorhanden sind, auf jedem Streifen und ihre relativen Positionen (und Farben) zu machen.

3. Sie den Streifen auf der Seite in einem flachen Becken von verflüssigtem Agar (4%, 80-90 ° C) mit der zu schneiden zuerst nach unten (Fig. 3E) wird.
4. Sobald das Agar gesetzt hat, um die Probe geschnitten und in einen Gewebekassette von Einlagen (3F) unterstützt.
5. Wiederholen Sie die Schritte für die Steuerung 3.1-3.3 Auge - taking Pflege zu sezieren Spiegel-Streifen abgestimmt.
6. Bearbeiten Sie alle Kassetten über Standard (automatisierte Übernachtung) Paraffin Verarbeitungstechnik.
7. Einbetten verarbeitet Gewebe in Paraffin mit der Seite zu schneiden zuerst nach unten werden.

4. Schneiden und Färben

1. Cut Paraffinblöcke in 5 um Abschnitte beziehen regelmäßig die Hinweise aus den Schritten 2 und 3.
2. Sammeln Abschnitte von jeder der gefärbten Regionen und Befestigung auf Objektträgern.

Der Bereich unmittelbar benachbart zu jeder gefärbten Fleck Sklera kann nun mit Sicherheit, dass sie in nächster Nähe zu der entsprechenden Elektrode in der Anordnung (4) wurde bewertet.

3. Stain oder führen Immunfluoreszenz nach Wunsch. Beispiel Flecken und Immunhistochemie in Abbildung 5 dargestellt sind: H &E; Luxol schnell blau (LFB); Kresylviolett; Masson Trichrom blau; Perjodsäure schiff (PAS); Perls 'Preußisch Blau stain, Anti-Glutamin-Synthetase (GS), Anti-Neurofilamentprotein (NF), Anti-saure Gliafaserprotein (GFAP) und 4 ',6-Diamino-2-phenylindol (DAPI).
4. Standard-und Spezial Flecken wurden so detailliert durchgeführt:
   1. H & E-Färbung wurde gemäß dem Protokoll, das von Leica Multistainer Bad Array ST5020 (Leica Biosystems) vorgesehen durchgeführt.
   2. LFB und Kresylviolett (modifiziert nach ^11):
      1. Entparaffinieren in 3 ändert Xylol (3x 2 min) und 2 Wechsel von Ethanol (100%, 100%) (2x 1 min) und Spülen in Leitungswasser (45 sec).
      2. Hydrate Abschnitte zu 95% Ethanol.
      3. Platz in der LFB-Lösung ¹¹ bei 37 - 42 ° C (über Nacht).
      4. Spülen Sie überschüssiges mit 70% Ethanol Fleck.
      5. Spülen in destilliertem Wasser.
      6. In verdünnter Lithiumcarbonat (8%) (einige Sekunden).
      7. Differenzieren in 70% Ethanol (einige Sekunden).
      8. Spülen in destilliertem Wasser.
      9. Wiederholen Sie die Schritte 4.4.2.6 bis 4.4.2.8, wenn nötig, bis background ist farblos.
      10. Platz in Kresylviolett Acetat funktionierende Lösung bei 37 ° C (10 min).
      11. Nicht mit Wasser waschen.
      12. Entwässern in 3 Änderungen absolutem Alkohol (1x 30 sec, 20 sec 2x) und 3 Änderungen Xylol (1x 1 min 30 sec, 2x 1 min).
      13. Berg und Deckglas mit DPX.
   3. Masson Trichrom blau (modifiziert nach ^11):
      1. Dewax gemäß 4.4.2.1.
      2. Bringen Abschnitte zu Wasser (2 min).
      3. Stain die Kerne mit Weigert Eisen-Hämatoxylin (2 min).
      4. Waschen in Leitungswasser, in destilliertem Wasser spülen.
      5. Färben in Biebrich Scharlach-Säurefuchsin Lösung (5 min).
      6. Spülen in destilliertem Wasser.
      7. Differenzieren in Phosphormolybdänsäure-Phosphowolframsäure bis Kollagen ist blassrosa (6 min).
      8. Spülen in destilliertem Wasser.
      9. Gegenfärbung in Anilin blau (1 min).
      10. Gut waschen in 1% Essigsäure (1 min).
      11. Entwässern, Halterung und Deckglas als p4.4.2.12 und 4.4.2.13 er.
   4. PAS (modifiziert nach ^11):
      1. Dewax gemäß 4.4.2.1.
      2. Oxidieren in 1% Perjodsäure (15 min).
      3. Waschen unter fließendem Wasser dann destilliertes Wasser.
      4. Färben in Schiff-Reagenz (15 min).
      5. Waschen in Wasser (5 min).
      6. Gegenfärbung mit Harris Hämatoxylin (1 min).
      7. Waschen Sie kurz in Leitungswasser.
      8. Differenzieren in 0,5% Säure Alkohol (1 dip).
      9. Waschen gut in Leitungswasser.
      10. Blau in Scotts Leitungswasser (1 min).
      11. Waschen gut in Wasser.
      12. Entwässern, Halterung und Deckglas nach 4.4.2.12 und 4.4.2.13.
   5. Perls 'Preußisch Blau Fleck wie in ¹¹ beschrieben.
5. Immunfluoreszenzfärbung wurde so detailliert durchgeführt:
   1. Dewax gemäß 4.4.2.1.
   2. Spülen in destilliertem Wasser (2x 5 min).
   3. Führen Antigen-Retrieval unter Verwendung von 0,01% Citrat-Puffer, pH 6 bei 75 - 80 ° C (20 min) eind zu ermöglichen, in 0,01% Citratpuffer (20 min) abgekühlt.
   4. Waschen Abschnitte in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) (2x 5 min).
   5. Permeabilisieren die Zellmembran in Waschpuffer-Lösung (10 min).
   6. Inkubation in Serum-Block-Lösung (2 h).
   7. Inkubieren Abschnitte in einer einzigen primären Antikörper in Antikörper verdünnt (10% normal goat serum/0.1% Triton X-100/PBS) (über Nacht im Kühlschrank). Der Titer der einzelnen primären Antikörper ist in Tabelle 1 gezeigt.
   8. Nach Inkubation über Nacht, waschen Abschnitte in Waschpuffer (5x 3 min). Von diesem Punkt an, halten Abschnitte in der Dunkelheit.
   9. Inkubieren Abschnitte in der entsprechenden sekundären Antikörper bei einem Titer von 1:500 für eine bestimmte Dauer (siehe Tabelle 1 für weitere Details).
   10. Wash Abschnitte in Waschpuffer (3x 5 min).
   11. Inkubieren Abschnitte in DAPI (1:25.000 / PBS) (30 min).
   12. Wash Abschnitte in Waschpuffer (3x 5 min).
   13. Berg und Deckglas mit fluoreszierennt Montage Medien.

Testproben und Kontrollproben sind bereit für paarweisen Vergleich.

Abbildung 4 zeigt einen repräsentativen Ausschnitt aus Schneiden der Probe in Abbildung 3 dargestellt erhalten. Der Abschnitt bei 5 um Dicke und gefärbt mit H & E, nach den Protokollen beschrieben geschnitten. Die Brutto-Form der Teststreifen wird mit minimalem Differential Gewebe Artefakte (4A) erhalten. Beide Farbstoff Markierungen sichtbar waren auf der Lederhaut, obwohl die grüne Farbstoff war widerstandsfähiger als der rote (4B). Die retinalen Schichten wurden nicht artifactually abgelöst und die Netzhautmorphologie wird beibehalten (4C). Das retinale Gewebe benachbart zu dem Farbstoff Markierungen, die die Position der Elektroden in der Anordnung entspricht, können leicht identifiziert werden.

Abbildung 5 zeigt repräsentative spezielle Färbung und Immunhistochemie von Gewebeschnitten, die gemäß dem aktuellen Protokoll. Siehe Abbildung 5 caption und ergänzende Materialien für weitere Einzelheiten über die spezifischen Flecken und den Änderungen an ihrer Nutzung. Post-Modifikation, diese Flecken und Immunhistochemie waren äquivalent zu etablierten Standards - wie von Pathologen überprüft.

Art der primären Antikörper und Titer (in Klammern)	GFAP (1:1500)	NF200 (1:100)	GS (1:100)
Art des sekundären Antikörper-Titer und (in Klammern)	Alexa Fluor 594	Alexa Fluor 488	Alexa Fluor 488
Dauer der Inkubation von sekundärem Antikörper	1 Stunde	2 Stunden	45 min

Tabelle 1. Antibody Typ, Titre und Dauer der Kennzeichnung.

Abbildung 1. Suprachoroidal Prototype Electrode Array. A) Makroaufnahme einer klinischen Grad geformten Array. B) Mikroskopische Aufnahme einer handgefertigten präklinischen Array.

Abbildung 2. Ehemalige Retinal Histologie. Norm histologischen Methoden wurden verwendet, um diese vorzubereiten, H & E-gefärbten, Abschnitte eines Auges mit einem suprachoroidalen Elektroden-Array implantiert. A) Eine orthogonale Schnitt durch das Elektroden-Array Hohlraum (dargestellt durch einen Stern). Die Retina ist von der äußeren Augengewebe getrennt. Dies wird besonders deutlich unterhalb des implantierten Bereichs (Pfeil). Es ist unmöglich zu bestimmen, welcher Teil der Retina benachbart zu jeder einzelnen Elektrode des Arrays. Scalebar = 1 mm. B) Eine höhere Vergrößerung des boxed Region in Panel A. Es gibt mehrere, regelmäßig angeordneten, Artefakte in der Netzhaut layers (Pfeile), sowie die wichtigsten Loslösung von der Tapetenzellen Schicht (die reflektierende Schicht in Katzenaugen). Scalebar = 100 um. C) Ein höherer Vergrößerung des boxed Region in Panel B. Pfeil angedeutet den äußeren Segmenten der Photorezeptoren sowie die pigmental Epithel, die intakt bleiben, was darauf hindeutet, dass die Ablösung ein Artefakt Nebeneffekt der Verarbeitung, um die durch eine in vivo Trauma oder Pathologie verursacht entgegengesetzt war. Scalebar = 20 um.

Abbildung 3. Lokalisierung und Präparation der Elektroden-benachbartes Gewebe. AD) Hoher Dynamikbereich Makroaufnahmen einer entkernten Auge, mit einem suprachoroidalen Elektroden-Array in situ. A) Beitrag mit Davidsons Fixativ fixiert und vor dem Array entfernt, ermöglicht die transluzente Lederhaut Visualisierungdie einzelnen Elektroden in der Anordnung (einziges Beispiel angegeben mit Pfeil). B) Die Elektroden sind mit einem vorgegebenen Farbstoff markiert. C) Dye Markierungen in regelmäßigen Abstand von anatomischen Landmarken verwendet werden, um Konsistenz zu erhalten über Experimente. D) Nach dem Entfernen der Array wird das Auge von Hand in Teststreifen seziert. Farbige Pfeile zeigen zwei der Elektrode benachbarten Stellen auf der Lederhaut. Gelb gestrichelte Linie zeigt Schnittebene. E) Makro-Fotografie von Teststreifen in einem Agar-Block. F eingebettet) Makro-Fotografie von der Agar-Embed-Teststreifen von Panel E, ausgeschnitten und in einem Einbettungskassette unterstützt durch Schaum Biopsie-Pads um eine Bewegung des Abschnitts während der Verarbeitung zu minimieren.

Abbildung 4. New Retinal Histologie. trong> Das oben Probestreifen (von 3D), die die Elektrode Tasche wurde in Paraffin eingebettet, geschnitten bei 5 um und gefärbt mit H & E A) grün und rot gefärbten Bereiche (angedeutet durch die Pfeile, wie Fig. 3D) sind in ein Schnitt auf der Ebene der gelben gestrichelte Linie in 3D gemacht. Maßstab bar = 1000 um. Die Netzhaut ist nicht gelöst, weder unter dem Array Tasche noch fern. B) Der boxed Region von Panel A mit sichtbaren roten und grünen Farbstoff durch Pfeile angedeutet, und intakte Netzhaut ganz. Maßstab bar = 500 um. C) Der boxed Region von Panel B, zeigt die intakte, befestigt, Netzhaut neben dem grünen Farbstoff. Maßstab bar = 50 um. Wissen, dass die Lage des Farbstoffes zeigt die Anordnung einer Elektrode können wir sicher beurteilen benachbarten Netzhautgewebes für Schäden, falls vorhanden, die durch elektrische Stimulation.

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Abbildung 5. Beispiele für modifizierte retinalen cytohistochemistry mit speziellen Flecken und Immunfluoreszenz. Die Verwendung von Davidson Fixiermittel zu Standard Formalinfixierung Techniken erforderlich, Änderungen an den üblichen Färbemethoden, wie es im Hauptanspruch dargelegt Protokolltext entgegengesetzt. Pathologen haben bestätigt, dass diese Änderungen in gleicher Färbung geführt. A) H &E; Hämatoxylin Flecken Zellkerne violett, wohingegen Eosin Flecken Zytoplasma, Kollagen und Stützgewebe verschiedenen Schattierungen von Rosa. B) LFB Flecken Myelin blau, während die Kresylviolett Gegenfärbung verwendet werden kann, werden . identifizieren Ganglienzellen durch Färbung Nissl Stellen im Perikaryon blau und Hervorhebung der Satelliten-Zellen die Zellen umgebende C) Masson Trichrom blau; die Biebrich-Scharlach Säurefuchsin Lösung Flecken Muskel figlieder rot, während die blauen Flecken Anilin das Kollagen, in diesem Fall Lederhaut, blau D) PAS;. Glykoprotein Komponenten Basalmembran und Bindegewebe Komponenten sind gefärbt lila, während die Hämatoxylin Gegenfärbungen Zellkerne violett E) Perls 'Preußisch Blau. am Ort der Blutung, produziert die Bildung von Hämosiderin abgebaut roten Blutkörperchen und die Freisetzung von Eisen-Komplexe eine violette Farbe, während die Zugabe von Neutralrot Beizfarben Lysosomen rot F) GS;. diese Neurotransmitter abbauende Enzym in Müller-Zellen 13 gefunden (grün ), zu sehen, die sich in beide Richtungen bei Müller Zellkörper in der inneren Körnerschicht und Müller Zelle Endfüßen Bilden der inneren Grenzmembran G) NF-200 werden;. diese schweren Kette Zytoskelett-Protein (grün) in Zellsoma und Verfahren gefunden Vernetzungen mit anderen neurofilaments, um die Struktur von Neuronen 14,15 aufrechtzuerhalten. GanglionZellen und ihrer Axone in den Ganglienzellen und Nervenfaserschicht zu sehen, während Axone horizontalen Zellen an der äußeren Grenze des inneren Körnerschicht in der Katze Netzhaut ebenfalls hervorgehoben. Gegenfärbung mit DAPI (blau) ermöglicht die Visualisierung von Netzhautschichten H) GFAP;. Diese Zytoskelettprotein (rot) in Müller-Zellen und Astrozyten während Gliose 16 vermehrt, zu sehen entlang der Nervenfaser Schicht mit Müller-Zellen bilden dünne Erweiterungen durch den inneren zu äußeren Schichten der Netzhaut. Gegenfärbung mit DAPI (blau) die Visualisierung der retinalen Schichten. Maßstab bar = 50 um in allen Panels. Die innere Retina an der Spitze eines jeden Bildes, die äußere Netzhaut an der Unterseite eines jeden Bildes, ohne Tafel E, die subscleral Reaktion zeigt.

Autoren haben nichts zu offenbaren.