Techniken für die Verarbeitung Augen mit einem Netzhautprothese für lokalisierte Histopathologische Analyse Implantierte

Summary

Techniken zur Visualisierung von retinalen Zytoarchitektur direkt an einzelnen Elektroden innerhalb eines Retina-Stimulator.

Abstract

Mit der jüngsten Entwicklung von Retina-Prothesen, ist es wichtig, zuverlässige Techniken für die Beurteilung der Sicherheit dieser Geräte in präklinischen Studien zu entwickeln. Allerdings sind die Standard-Fixierung, Vorbereitung und automatisierte Histologie Verfahren nicht ideal. Hier beschreiben wir neue Verfahren für die Bewertung der Gesundheit der Retina direkt benachbart zu einem Implantat. Retinal Prothesen verfügen Elektroden-Arrays in Kontakt mit Auge Gewebe. Bisherige Verfahren waren nicht in der Lage, räumlich zu lokalisieren Augengewebe benachbarten einzelnen Elektroden in der Anordnung. Darüber hinaus Standard histologischen Verarbeitung oft zu grob artifactual Ablösung der Netzhaut Schichten bei der Beurteilung implantierten Augen. Folglich ist es schwierig gewesen, um lokalisierte Schadens, falls vorhanden, die durch Implantation und Stimulierung einer implantierten Elektrodenanordnung. Daher entwickelten wir ein Verfahren zur Identifizierung und Lokalisierung der Okulargewebe neben implantiert electrodes mit einem (farblich gekennzeichnet) Farbstoff Benotungsschema und modifizierten wir ein Auge Fixationstechnik zu artifactual Netzhautablösung minimieren. Auch dieses Verfahren machte die Sklera durchscheinend, so dass Lokalisierung von einzelnen Elektroden und bestimmte Teile eines Implantats. Schließlich haben wir eine angepasste Steuerung, um die Macht der histopathologischen Bewertungen zu erhöhen. Zusammenfassend ermöglicht dieses Verfahren eine zuverlässige und effiziente Diskriminierung und Auswertung der retinalen Cytoarchitektur in einem implantierten Auge.

Introduction

Retinal Prothesen könnten bald nützliche klinische Interventionen werden zur Behandlung von verschiedenen Formen der schweren Sehverlust. Bestimmte Bedingungen, wie Retinitis pigmentosa (RP), Ergebnis in der weitverbreiteten Degeneration der Photorezeptoren im Auge, das sind die Zellen, die zur Umwandlung von Licht in neuronale Signale. Jedoch bleiben einige Zellen in anderen Schichten der Netzhaut und sind potentielle Ziele für die elektrische Stimulation mit einem Netzhautprothese ^1. Erste Ergebnisse von klinischen Studien am Menschen haben für Elektroden-Arrays im epiretinalen ^{2,3, 4,5} subretinalen implantiert und intraskleralen ⁶ Standorten waren vielversprechend. Diese Geräte sind aus verschiedenen Materialien mit unterschiedlichen Formen, aber sie alle verwenden elektrische Impulse, um die restlichen lebensfähigen Neuronen der Netzhaut zu aktivieren, um visuelle Wahrnehmungen zu erstellen.

Unsere größeren Gruppe (Bionic Vision Australia) hat ein Retina-Implantat, das progres entwickelt hatsed zu einer klinischen Pilotstudie mit 3 RP-Patienten mit suprachoroidalen Elektroden-Arrays (Clinical Trial Number: NCT01603576) implantiert. 1A zeigt diese suprachoroidalen Prototyp Netzhautprothese.

Patientensicherheit ist von größter Bedeutung in klinischen Studien und damit vor Beginn der Studien am Menschen, wir umfangreiche akuten und chronischen Tests durchgeführt in präklinischen Modellen (Abbildung 1B). Histopathologische Einschätzungen waren unerlässlich, um die chirurgischen Verfahren zu verfeinern, durchlaufen Elektroden-Konstruktion und letztlich zu etablieren, die Sicherheit des Implantats. Um einen effizienten Workflow mit üblichen klinischen Pathologie Praktiken verzahnt halten, wurde eine Einbettung in Paraffin-Technik eingesetzt. Es war auch wünschenswert, Färbeprozeduren vergleichbar mit klinischen Standards wie Hämatoxylin und Eosin (H & E), die leicht von den Pathologen interpretiert nutzen. Wir wollten auch eine Technik, die für immunhistochemische Analysen angepasst werden könnte, inum weiter zu erleichtern zellulären Auswertung der Gewebe.

Die Biokompatibilität des Implantats Materialien und die Sicherheit der chronischen elektrischen Stimulation, müssen sorgfältig geprüft werden. Es ist wichtig, in der Lage, die Histopathologie von dem Augengewebe benachbart zu den einzelnen stimulierenden Elektroden in der Anordnung zu prüfen. Jedoch benötigt die Arrays vor der Bearbeitung der Proben, so dass sie getestet werden kann entfernt werden, und weil ihre Metallkomponenten nicht leicht geschnitten. Folglich hat unsere etablierten Gewebeaufbereitung nicht zulassen Lokalisierung und Abbildung von Gewebe in Bezug auf den implantierten Elektroden ^7. Neben dem Fehlen einer Gewebelokalisierung Verfahren führte die Standard-Formaldehyd-Basis Fixierung und Verarbeitungstechniken verbreitet Artefakte und Ablösung der Netzhaut durch die unterschiedliche Schrumpfung der verschiedenen Schichten des Auges (Abbildung 2). Aufgrund der Inhomogenität ter Netzhaut, war es schwierig, einen sinnvollen Vergleich mit Kontrollgewebe machen, besonders für quantitative Messungen. Diese kombinierten Einschränkungen erschwert eine genaue Beurteilung des potenziellen Schadens durch unsere implantiert Arrays verursacht.

Hier präsentieren wir neue Techniken zur Überwindung dieser Grenzen. Wir haben modifiziert spezialisierte Augenfixierung und Verarbeitungstechniken ^8-10, um die Kompatibilität mit Paraffin-Basis Histologie halten. Wir haben Standard-histologische und immunhistochemische Färbungen modifiziert werden, um vergleichbare Ergebnisse zu geben, basierend auf dem Feedback aus der klinischen Pathologen. Nach dem Rendern der Skleralgewebe transluzent wurde ein Farbstoff-Farben-Code verwendet, um das Augengewebe benachbart zu jeder einzelnen Elektrode zu markieren, bevor die Anordnung aus dem Suprachoroidalraum. Durch Markieren des Elektroden-Array und die einzelnen Elektrode Websites könnten Proben genau von der Elektrode angrenzenden Regionen gesammelt werden. Abgestimmte Proben konnten von th gesammelt werdene Kontrolle Auge um paarweisen Vergleiche zu erleichtern.

Protocol

1. Enukleation und Post-Fixation

Dieses Protokoll setzt voraus, dass das Thema wurde einseitig mit einem suprachoroidalen Elektroden-Array implantiert.

1. Bereiten postfix Lösungen in Glas Schott Flaschen.
   1. Davidson Fixierlösung, 2x 100 ml
      • 2 ml Formalin (37% Formaldehyd)
      • 10 ml Eisessig (99,7%)
      • 35 ml Ethanol (98%)
      • 53 ml destilliertem Wasser
   2. 50%-igem Ethanol, 2 x 100 ml
   3. 70% Ethanol, 2 x 100 ml
2. Transkardial perfundieren Thema mit warm (37 ° C) heparinisierter Kochsalzlösung gefolgt von kaltem (4 ° C) neutral gepuffertem Formalin (10%).
3. Tie Nähte an der oberen Limbus (oder ein Ort, der fern von der suprachoroidalen Array) beider Augen - im Einklang mit einer Rektusmuskel, als Wahrzeichen dienen.
4. Enucleate Augen, etwaige Beibehaltung der externen Leitungen von der implantierten Auge.
5. Zeigen each Auge in 100 ml Fixierlösung Davidson und lassen bei Raumtemperatur Post-fix.
6. Nach 18 - 36 h in Davidsons Fixativ, zu 50% Ethanol (Raumtemperatur) übertragen für 6 - 8 Stunden, dann endlich zu 70% Ethanol (Raumtemperatur).
7. Kühlen Proben bei 4 ° C und Speicher bis Dissektion.

Intakte und Druck Auge Globen haben auf diese Weise gelagert bis zu 3 Monaten ohne Beeinträchtigung der resultierenden Histologie.

2. Identifizierung und Tissue Mapping

Die oben Fixierung Protokoll (Schritt 1) hat die Lederhaut durchscheinend gerendert und das Array ist jetzt sichtbar - inklusive der einzelnen Elektrode Websites (Abbildung 3).

1. Entfernen Sie die implantierten Globus aus Ethanol und sorgfältig wegschneiden überschüssiges Gewebe, einschließlich Bindehaut und Tenonkapsel. Trim Sehnerv zu einer 2 - 3 mm Länge (3A).
2. Mit einem histologischen Farbstoff marking Schema, beschriften Sie die Elektroden mit einem vordefinierten Farbcode, kümmert sich nicht um den Farbstoff zu verschmieren.

• Wir entschieden uns für einen handelsüblichen Suite von spezialisierten histologischen Farbstoff (siehe Anhang). Kleine Mengen des Farbstoffs wurden vorsichtig mit einer feinen Spitze Pinsel (Roymac Größe 00) auf das Gewebe aufgetragen und an der Luft für bis zu 5 min trocken.
• Für unsere Zwecke haben wir uns entschieden: grün für den aktiven Elektrode (n), die (waren) war angeregt maximal bei überschwellige Ebenen, für die Dauer der Studie; rot für andere aktive Elektroden, gelb für die größeren Durchmesser Rückkehr Elektroden und Blau für zusätzliche Führungen und / oder anatomischen Abstand Markierungen (3B und 3C).
• Einige trial and error erforderlich sein, um einen Farbstoff, der stabil ist in den nachfolgenden Schritten zu finden. Zum Beispiel in Figur 4 ist ersichtlich, dass der grüne Farbstoff elastischer als der roten Farbstoffs werden. Verdünnung der Farbstoff in 70% Ethanol verbessert Lipid penetration und Gewebe-Beschichtung.
• Es ist sinnvoll, skizzieren oder fotografieren das gefärbte Globus für die Zukunft.

3. Zurück zu 70% Ethanol, um den Farbstoff zu entwässern.
4. Wiederholen Sie Schritt 2.1 für die Steuerung unimplantierten Globus.
5. Mit den Fäden aus Schritt 1.3, richten Sie die Steuerung und das Auge implantiert Auge als gespiegelten Paar.
6. Platzieren eines Silikon-Vorlage (mit den gleichen Abmessungen wie die Elektrodenanordnung) in dem gespiegelten Position auf der Steuerung Auge als das Implantat implantiert Auge (NB die lichtdurchlässige Sklera und der Farbstoff Markierungen von Schritt 2.2 liegt damit bereit Visualisierung der implantierten Position im Array ).
7. Die Schritte 2.2 und 2.3 für die Steuerung Auge, so daß jede Elektrode implantiert ein Steuerelement Paar hat in einer anatomisch vergleichbar (dh spiegelgleichen Äquivalent) Lage.

3. Dissection und Einbettung

1. Entnehmen Sie das Implantat Array aus dem Auge und nehmen Sie die Vorderseite des Auges(Einschließlich der Hornhaut, Iris und Linse). Entfernen Sie die Glaskörper aus dem verbleibenden Auge cup (hintere Kammer).
2. Präparieren des implantierten Auge in mehrere Vertreter Streifen (~ 2 mm Dicke), die jeweils eine Teilmenge der Farbstoff markierte Bereiche (3D). Man beachte, dass die Orientierung der Streifen so zu wählen, bei der Beurteilung der verschiedenen Aspekte der Gewebereaktion auf das Implantat ⁷ zu unterstützen.

Es ist sinnvoll, für die Zukunft, um einen Datensatz von dem Farbstoff Regionen vorhanden sind, auf jedem Streifen und ihre relativen Positionen (und Farben) zu machen.

3. Sie den Streifen auf der Seite in einem flachen Becken von verflüssigtem Agar (4%, 80-90 ° C) mit der zu schneiden zuerst nach unten (Fig. 3E) wird.
4. Sobald das Agar gesetzt hat, um die Probe geschnitten und in einen Gewebekassette von Einlagen (3F) unterstützt.
5. Wiederholen Sie die Schritte für die Steuerung 3.1-3.3 Auge - taking Pflege zu sezieren Spiegel-Streifen abgestimmt.
6. Bearbeiten Sie alle Kassetten über Standard (automatisierte Übernachtung) Paraffin Verarbeitungstechnik.
7. Einbetten verarbeitet Gewebe in Paraffin mit der Seite zu schneiden zuerst nach unten werden.

4. Schneiden und Färben

1. Cut Paraffinblöcke in 5 um Abschnitte beziehen regelmäßig die Hinweise aus den Schritten 2 und 3.
2. Sammeln Abschnitte von jeder der gefärbten Regionen und Befestigung auf Objektträgern.

Der Bereich unmittelbar benachbart zu jeder gefärbten Fleck Sklera kann nun mit Sicherheit, dass sie in nächster Nähe zu der entsprechenden Elektrode in der Anordnung (4) wurde bewertet.

3. Stain oder führen Immunfluoreszenz nach Wunsch. Beispiel Flecken und Immunhistochemie in Abbildung 5 dargestellt sind: H &E; Luxol schnell blau (LFB); Kresylviolett; Masson Trichrom blau; Perjodsäure schiff (PAS); Perls 'Preußisch Blau stain, Anti-Glutamin-Synthetase (GS), Anti-Neurofilamentprotein (NF), Anti-saure Gliafaserprotein (GFAP) und 4 ',6-Diamino-2-phenylindol (DAPI).
4. Standard-und Spezial Flecken wurden so detailliert durchgeführt:
   1. H & E-Färbung wurde gemäß dem Protokoll, das von Leica Multistainer Bad Array ST5020 (Leica Biosystems) vorgesehen durchgeführt.
   2. LFB und Kresylviolett (modifiziert nach ^11):
      1. Entparaffinieren in 3 ändert Xylol (3x 2 min) und 2 Wechsel von Ethanol (100%, 100%) (2x 1 min) und Spülen in Leitungswasser (45 sec).
      2. Hydrate Abschnitte zu 95% Ethanol.
      3. Platz in der LFB-Lösung ¹¹ bei 37 - 42 ° C (über Nacht).
      4. Spülen Sie überschüssiges mit 70% Ethanol Fleck.
      5. Spülen in destilliertem Wasser.
      6. In verdünnter Lithiumcarbonat (8%) (einige Sekunden).
      7. Differenzieren in 70% Ethanol (einige Sekunden).
      8. Spülen in destilliertem Wasser.
      9. Wiederholen Sie die Schritte 4.4.2.6 bis 4.4.2.8, wenn nötig, bis background ist farblos.
      10. Platz in Kresylviolett Acetat funktionierende Lösung bei 37 ° C (10 min).
      11. Nicht mit Wasser waschen.
      12. Entwässern in 3 Änderungen absolutem Alkohol (1x 30 sec, 20 sec 2x) und 3 Änderungen Xylol (1x 1 min 30 sec, 2x 1 min).
      13. Berg und Deckglas mit DPX.
   3. Masson Trichrom blau (modifiziert nach ^11):
      1. Dewax gemäß 4.4.2.1.
      2. Bringen Abschnitte zu Wasser (2 min).
      3. Stain die Kerne mit Weigert Eisen-Hämatoxylin (2 min).
      4. Waschen in Leitungswasser, in destilliertem Wasser spülen.
      5. Färben in Biebrich Scharlach-Säurefuchsin Lösung (5 min).
      6. Spülen in destilliertem Wasser.
      7. Differenzieren in Phosphormolybdänsäure-Phosphowolframsäure bis Kollagen ist blassrosa (6 min).
      8. Spülen in destilliertem Wasser.
      9. Gegenfärbung in Anilin blau (1 min).
      10. Gut waschen in 1% Essigsäure (1 min).
      11. Entwässern, Halterung und Deckglas als p4.4.2.12 und 4.4.2.13 er.
   4. PAS (modifiziert nach ^11):
      1. Dewax gemäß 4.4.2.1.
      2. Oxidieren in 1% Perjodsäure (15 min).
      3. Waschen unter fließendem Wasser dann destilliertes Wasser.
      4. Färben in Schiff-Reagenz (15 min).
      5. Waschen in Wasser (5 min).
      6. Gegenfärbung mit Harris Hämatoxylin (1 min).
      7. Waschen Sie kurz in Leitungswasser.
      8. Differenzieren in 0,5% Säure Alkohol (1 dip).
      9. Waschen gut in Leitungswasser.
      10. Blau in Scotts Leitungswasser (1 min).
      11. Waschen gut in Wasser.
      12. Entwässern, Halterung und Deckglas nach 4.4.2.12 und 4.4.2.13.
   5. Perls 'Preußisch Blau Fleck wie in ¹¹ beschrieben.
5. Immunfluoreszenzfärbung wurde so detailliert durchgeführt:
   1. Dewax gemäß 4.4.2.1.
   2. Spülen in destilliertem Wasser (2x 5 min).
   3. Führen Antigen-Retrieval unter Verwendung von 0,01% Citrat-Puffer, pH 6 bei 75 - 80 ° C (20 min) eind zu ermöglichen, in 0,01% Citratpuffer (20 min) abgekühlt.
   4. Waschen Abschnitte in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) (2x 5 min).
   5. Permeabilisieren die Zellmembran in Waschpuffer-Lösung (10 min).
   6. Inkubation in Serum-Block-Lösung (2 h).
   7. Inkubieren Abschnitte in einer einzigen primären Antikörper in Antikörper verdünnt (10% normal goat serum/0.1% Triton X-100/PBS) (über Nacht im Kühlschrank). Der Titer der einzelnen primären Antikörper ist in Tabelle 1 gezeigt.
   8. Nach Inkubation über Nacht, waschen Abschnitte in Waschpuffer (5x 3 min). Von diesem Punkt an, halten Abschnitte in der Dunkelheit.
   9. Inkubieren Abschnitte in der entsprechenden sekundären Antikörper bei einem Titer von 1:500 für eine bestimmte Dauer (siehe Tabelle 1 für weitere Details).
   10. Wash Abschnitte in Waschpuffer (3x 5 min).
   11. Inkubieren Abschnitte in DAPI (1:25.000 / PBS) (30 min).
   12. Wash Abschnitte in Waschpuffer (3x 5 min).
   13. Berg und Deckglas mit fluoreszierennt Montage Medien.

Testproben und Kontrollproben sind bereit für paarweisen Vergleich.

Results

Abbildung 4 zeigt einen repräsentativen Ausschnitt aus Schneiden der Probe in Abbildung 3 dargestellt erhalten. Der Abschnitt bei 5 um Dicke und gefärbt mit H & E, nach den Protokollen beschrieben geschnitten. Die Brutto-Form der Teststreifen wird mit minimalem Differential Gewebe Artefakte (4A) erhalten. Beide Farbstoff Markierungen sichtbar waren auf der Lederhaut, obwohl die grüne Farbstoff war widerstandsfähiger als der rote (4B). Die retinalen Schichten wurden nicht artifactually abgelöst und die Netzhautmorphologie wird beibehalten (4C). Das retinale Gewebe benachbart zu dem Farbstoff Markierungen, die die Position der Elektroden in der Anordnung entspricht, können leicht identifiziert werden.

Abbildung 5 zeigt repräsentative spezielle Färbung und Immunhistochemie von Gewebeschnitten, die gemäß dem aktuellen Protokoll. Siehe Abbildung 5 caption und ergänzende Materialien für weitere Einzelheiten über die spezifischen Flecken und den Änderungen an ihrer Nutzung. Post-Modifikation, diese Flecken und Immunhistochemie waren äquivalent zu etablierten Standards - wie von Pathologen überprüft.

Art der primären Antikörper und Titer (in Klammern)	GFAP (1:1500)	NF200 (1:100)	GS (1:100)
Art des sekundären Antikörper-Titer und (in Klammern)	Alexa Fluor 594	Alexa Fluor 488	Alexa Fluor 488
Dauer der Inkubation von sekundärem Antikörper	1 Stunde	2 Stunden	45 min

Tabelle 1. Antibody Typ, Titre und Dauer der Kennzeichnung.

Abbildung 1. Suprachoroidal Prototype Electrode Array. A) Makroaufnahme einer klinischen Grad geformten Array. B) Mikroskopische Aufnahme einer handgefertigten präklinischen Array.

Abbildung 2. Ehemalige Retinal Histologie. Norm histologischen Methoden wurden verwendet, um diese vorzubereiten, H & E-gefärbten, Abschnitte eines Auges mit einem suprachoroidalen Elektroden-Array implantiert. A) Eine orthogonale Schnitt durch das Elektroden-Array Hohlraum (dargestellt durch einen Stern). Die Retina ist von der äußeren Augengewebe getrennt. Dies wird besonders deutlich unterhalb des implantierten Bereichs (Pfeil). Es ist unmöglich zu bestimmen, welcher Teil der Retina benachbart zu jeder einzelnen Elektrode des Arrays. Scalebar = 1 mm. B) Eine höhere Vergrößerung des boxed Region in Panel A. Es gibt mehrere, regelmäßig angeordneten, Artefakte in der Netzhaut layers (Pfeile), sowie die wichtigsten Loslösung von der Tapetenzellen Schicht (die reflektierende Schicht in Katzenaugen). Scalebar = 100 um. C) Ein höherer Vergrößerung des boxed Region in Panel B. Pfeil angedeutet den äußeren Segmenten der Photorezeptoren sowie die pigmental Epithel, die intakt bleiben, was darauf hindeutet, dass die Ablösung ein Artefakt Nebeneffekt der Verarbeitung, um die durch eine in vivo Trauma oder Pathologie verursacht entgegengesetzt war. Scalebar = 20 um.

Abbildung 3. Lokalisierung und Präparation der Elektroden-benachbartes Gewebe. AD) Hoher Dynamikbereich Makroaufnahmen einer entkernten Auge, mit einem suprachoroidalen Elektroden-Array in situ. A) Beitrag mit Davidsons Fixativ fixiert und vor dem Array entfernt, ermöglicht die transluzente Lederhaut Visualisierungdie einzelnen Elektroden in der Anordnung (einziges Beispiel angegeben mit Pfeil). B) Die Elektroden sind mit einem vorgegebenen Farbstoff markiert. C) Dye Markierungen in regelmäßigen Abstand von anatomischen Landmarken verwendet werden, um Konsistenz zu erhalten über Experimente. D) Nach dem Entfernen der Array wird das Auge von Hand in Teststreifen seziert. Farbige Pfeile zeigen zwei der Elektrode benachbarten Stellen auf der Lederhaut. Gelb gestrichelte Linie zeigt Schnittebene. E) Makro-Fotografie von Teststreifen in einem Agar-Block. F eingebettet) Makro-Fotografie von der Agar-Embed-Teststreifen von Panel E, ausgeschnitten und in einem Einbettungskassette unterstützt durch Schaum Biopsie-Pads um eine Bewegung des Abschnitts während der Verarbeitung zu minimieren.

Abbildung 4. New Retinal Histologie. trong> Das oben Probestreifen (von 3D), die die Elektrode Tasche wurde in Paraffin eingebettet, geschnitten bei 5 um und gefärbt mit H & E A) grün und rot gefärbten Bereiche (angedeutet durch die Pfeile, wie Fig. 3D) sind in ein Schnitt auf der Ebene der gelben gestrichelte Linie in 3D gemacht. Maßstab bar = 1000 um. Die Netzhaut ist nicht gelöst, weder unter dem Array Tasche noch fern. B) Der boxed Region von Panel A mit sichtbaren roten und grünen Farbstoff durch Pfeile angedeutet, und intakte Netzhaut ganz. Maßstab bar = 500 um. C) Der boxed Region von Panel B, zeigt die intakte, befestigt, Netzhaut neben dem grünen Farbstoff. Maßstab bar = 50 um. Wissen, dass die Lage des Farbstoffes zeigt die Anordnung einer Elektrode können wir sicher beurteilen benachbarten Netzhautgewebes für Schäden, falls vorhanden, die durch elektrische Stimulation.

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Abbildung 5. Beispiele für modifizierte retinalen cytohistochemistry mit speziellen Flecken und Immunfluoreszenz. Die Verwendung von Davidson Fixiermittel zu Standard Formalinfixierung Techniken erforderlich, Änderungen an den üblichen Färbemethoden, wie es im Hauptanspruch dargelegt Protokolltext entgegengesetzt. Pathologen haben bestätigt, dass diese Änderungen in gleicher Färbung geführt. A) H &E; Hämatoxylin Flecken Zellkerne violett, wohingegen Eosin Flecken Zytoplasma, Kollagen und Stützgewebe verschiedenen Schattierungen von Rosa. B) LFB Flecken Myelin blau, während die Kresylviolett Gegenfärbung verwendet werden kann, werden . identifizieren Ganglienzellen durch Färbung Nissl Stellen im Perikaryon blau und Hervorhebung der Satelliten-Zellen die Zellen umgebende C) Masson Trichrom blau; die Biebrich-Scharlach Säurefuchsin Lösung Flecken Muskel figlieder rot, während die blauen Flecken Anilin das Kollagen, in diesem Fall Lederhaut, blau D) PAS;. Glykoprotein Komponenten Basalmembran und Bindegewebe Komponenten sind gefärbt lila, während die Hämatoxylin Gegenfärbungen Zellkerne violett E) Perls 'Preußisch Blau. am Ort der Blutung, produziert die Bildung von Hämosiderin abgebaut roten Blutkörperchen und die Freisetzung von Eisen-Komplexe eine violette Farbe, während die Zugabe von Neutralrot Beizfarben Lysosomen rot F) GS;. diese Neurotransmitter abbauende Enzym in Müller-Zellen ¹³ gefunden (grün ), zu sehen, die sich in beide Richtungen bei Müller Zellkörper in der inneren Körnerschicht und Müller Zelle Endfüßen Bilden der inneren Grenzmembran G) NF-200 werden;. diese schweren Kette Zytoskelett-Protein (grün) in Zellsoma und Verfahren gefunden Vernetzungen mit anderen neurofilaments, um die Struktur von Neuronen ^14,15 aufrechtzuerhalten. GanglionZellen und ihrer Axone in den Ganglienzellen und Nervenfaserschicht zu sehen, während Axone horizontalen Zellen an der äußeren Grenze des inneren Körnerschicht in der Katze Netzhaut ebenfalls hervorgehoben. Gegenfärbung mit DAPI (blau) ermöglicht die Visualisierung von Netzhautschichten H) GFAP;. Diese Zytoskelettprotein (rot) in Müller-Zellen und Astrozyten während Gliose ¹⁶ vermehrt, zu sehen entlang der Nervenfaser Schicht mit Müller-Zellen bilden dünne Erweiterungen durch den inneren zu äußeren Schichten der Netzhaut. Gegenfärbung mit DAPI (blau) die Visualisierung der retinalen Schichten. Maßstab bar = 50 um in allen Panels. Die innere Retina an der Spitze eines jeden Bildes, die äußere Netzhaut an der Unterseite eines jeden Bildes, ohne Tafel E, die subscleral Reaktion zeigt.

Discussion

Die Beurteilung der Sicherheit des Implantats ist eine wichtige Überlegung für die präklinischen Studien. Bevor ein Netzhautprothese in Menschen implantiert werden können ist es wichtig, zu überprüfen, dass es keinen Schaden anrichten. Dies erfordert eine Einschätzung sowohl des Implantats Biokompatibilität ^17-23 sowie allen möglichen Schaden das könnte durch chronische elektrische Stimulation ^24-26 verursacht werden. Die Erfahrungen mit ähnlichen neuronalen Prothesen, wie das Cochlea-Implantat, bietet einen Einblick in das breite Spektrum der Stimulation und körperliche Parameter, die nicht verursachen Gewebeschäden ^27. Allerdings hat die Netzhaut unterschiedliche Eigenschaften auf andere Nidationsstellen und somit präzise Grenzwerte (z. B. maximale Ladungsdichte) kann nicht aus früheren Studien in anderen Systemen übernommen werden. Ladungsdichten am höchsten an der aktiven Elektrode Websites und dies entspricht mit dem größten Potenzial für Schäden. Daher ist ein Verfahren zur Lokalisierung der Gewebe direkt benachbartzu den einzelnen aktiven Elektroden stark erhöhen würde den Nutzen dieser Studien. Das Gewebe angrenzend an spezifische Bereiche des Implantats kann auch eine engere Kontrolle markiert. Dieser Ansatz ermöglicht gezielte weniger Abschnitte analysiert werden, unter Beibehaltung Vertrauen, dass das "worst case scenario" untersucht wurde.

Der Farbstoff skleralen Lokalisation hier beschriebene Verfahren wurde ausgiebig mit der Hand geformt und geformten Silikon / Pt-Elektrode Arrays ^28-30 getestet. Es wurde mit Dünnschicht-Polyamid-Arrays ^7,31 und auch Dünnschicht-Silikon / Pt-Arrays ³² verwendet worden. Einige Netzhautprothese Studien beschäftigt "kugelförmig" Elektroden mit intraskleralen Implantationen ^33. Die vorliegende Technik sollten wirksam für die Bewertung dieser Art von Elektroden-Arrays. Feline Augen mit dünnen Lederhaut (Dicke am hinteren Pol 90 - 200 um) erlaubt die Visualisierung der einzelnen Elektroden in einem Array. Selbst wenn einzelne elektrodes nicht sichtbar waren, ihre Position leicht abgeleitet werden kann unter Verwendung einer Silikon-Vorlage, wenn die Kontur des Feldes zu sehen (ähnlich wie in Schritt 2.6 verwendet werden).

Der Farbstoff Mapping begrenzt die Notwendigkeit, nicht relevant Gewebeschnitten zu erhalten, da nur abschnittsweise mit dem Farbstoff erhalten werden. Die Fähigkeit, genau zu folgern Elektrodenposition ermöglicht nicht nur relevant histopathologischen Analyse und eine größere statistische Power, hat aber einen großen Einfluss auf Zeit-und Kostenmanagement durch die Reduzierung der Menge von Dias und Schaufeln sowie die Kosten der Arbeit verwendet. Die Verwendung von Farbstoff, der haftend ist und Gewebebehandlung während auch sichtbar in ungefärbten Gewebeschnitten widerstehen ist eine wichtige erste Überlegung. Kenntnis der Lage des Farbstoffs und Orientierung des Gewebes an Präparation und beim Einbetten unterstützt den Schneidvorgang. Dies beinhaltet richtig Ausrichten des Blocks, um einen Abschnitt, die nicht schräg geschnitten zu erreichen und bietet einen vollständigen Vertreterinnenauf der Gewebe. Es ist daher wichtig, dass die Person, die das Schneiden vorliegenden Zeitpunkt der Farbauftrag, Präparation und Einbettung.

Das gesamte Protokoll ist robust, um kleinere Änderungen, insbesondere mit Fixierung Timings. Allerdings sind das Auge Dissektion und Farbstoff Markierungsschritte schwierige Vorgänge, die Nutzen aus gute manuelle Geschicklichkeit, um eine Beschädigung der Probe. Während Davidson Fixativ hat sich bewährt zur Verringerung artifactual Netzhautablösung in der Nähe eines Implantats, ist es nicht zu verhindern direkte mechanische Beschädigung beim Präparieren. Davidson fixative war nicht ohne weiteres kompatibel mit einigen speziellen histologischen und immunhistochemischen Verfahren. Daher gab es eine Notwendigkeit zu ändern / optimieren diese Schritte wie oben beschrieben. Inkrementelle Änderungen in Färbung und Konzentrationen wurden bis das optimale Ergebnis erreicht wurde - für weitere Details finden Sie in den ergänzenden Materialien.

Quantifizierung der retinalenHistologie bleibt problematisch. Die Netzhaut nicht homogen ist und sowohl die Dicke und die Zelldichte ändern sich mit zunehmendem Abstand vom Bereich centralis ^34,35. Daher kann benachbarte Gewebe im Auge implantiert nicht für Vergleiche verwendet werden und eine Kontrolle Auge statt beschäftigt. Paarweise passenden jedes Abschnitts mit der Steuerung Auge gibt uns einen stärkeren statistischen Vergleich der pathologischen Veränderungen, Wirksamkeit und Sicherheit Ergebnisse mit Retina-Prothesen werden besser beurteilt, wenn man die Augen in einem anderen Thema ^36. Besondere Vorsicht ist geboten, um schräg schneiden zu minimieren, da dies Quantifizierung beeinflussen würde.

Zusammenfassend, die oben beschriebenen Verfahren haben unsere histopathologischen Analyse, was wiederum zu einer effizienteren präklinischen Workflow geführt verbessert. Die Ergebnisse der präklinischen Studien mit diesen Methoden führte direkt zu einer klinischen Studie, in der 3 RP-Patienten wurden sicher haben mit suprachoroi implantiertdal retinale Prothesen. Diese Methoden sind sowohl auf die Netzhaut und andere Stimulatoren Augenimplantaten wo die pathologische Reaktion auf langfristige Implantation muss ausgewertet werden. Diese Methode bereitgestellt lohnt Vorteile für die Aufrechterhaltung der Zytoarchitektur und Registrierung der Pathologie in Regionen von Interesse auf dem Implantat. Obwohl nicht spezifisch geprüft werden, eine Modifikation dieser Verfahren in anderen Spezies und anderen anatomischen Stellen verwendet werden, insbesondere, wo eine Reihe oberflächlich implantiert wird.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Das Davidson Markierungssystem	Bradley Produkte	1163-4 - rot 1163-5 - blau 1163-2 - gelb 1163-1 - grün
Kaninchen Polyklonaler Anti-Glia-Fibrillärer saurer Protein-Antikörper	Millipore	AB5804 1	:1500, Inkubation über Nacht
Monoklonaler Anti-Glutamin-Synthetase-Antikörper Maus	Millipore	MAB302	1:100 Inkubation über Nacht
Monoklonaler Maus-Anti-Neurofilament 200-Antikörper	Sigma-Aldrich	N0142	1:100 Inkubation über Nacht
4',6-Diamindino-2-phenylindole, Dilaktat (Dilaktat)	Life Technologies	D3571	1:25.000 30 min Inkubation
Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Maus IgG	Life Technologies	A11029	1:500
Superfrost 90°; gelb	Grale Scientific	SF41299
FLEX IHC Objektträger	DAKO	K802021-2
Alexa Fluor 594 Ziegen-Anti-Kaninchen IgG	Life Technologies	A11037	1:500
Normales Ziegenserum	Life Technologies	PCN5000	10% Serum/0,1% Triton X-100/PBS
Nicht-Standard-Lösungsvorbereitung für spezielle Flecken 1% wässrige Cresylviolett-Stammlösung Cresylviolett 1 g Destilliertes Wasser 100 ml Cresylviolet Acetate Working Solution 1%ige wässrige Cresylviolett-Stammlösung 9 ml Destilliertes Wasser 51 ml 10% Essigsäure 0,5 ml Biebrich Scharlach-Säure Fuchsin Lösung 1% Beihrich Scharlach 90 ml 1% Säure Fuchsin 10 ml Eisessig 1 ml Phosphomolybdic-Phosphtungssäure Lösung Phosphomolybdinsäure 2,5 g Phosphotungssäure 2,5 g Destilliertes Wasser 100 ml Anilinblau-Lösung Anilinblau 2,5 g Eisessig 2 g Destilliertes Wasser 100 ml Lösungen für die Immunhistochemie Waschpufferlösung 0,1 % Triton X-100 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) Serum-Blocklösung 10 % normales Ziegenserum/0,1 % Triton X-100 in PBS SUPPLEMENTARY MATERIAL Luxol Fast Blue Der Zweck einer Luxol Fast Blue (LFB) Färbung bestand darin, die Ganglienzellen in der Ganglienzellschicht durch die Gegenfärbung von Cresylviolett zu identifizieren. Während LFB das Myelin färbt, bindet die Cresylviolett-Färbung an die Nissl-Substanzen in Neuronen, die aus dem rauen endoplasmatischen Retikulum und den Ribosomen bestehen. Zahlreiche Zellen in der Netzhaut enthalten Nissl-Substanz, darunter auch Amakrinzellen. Diese Zellen befinden sich in der Regel in der inneren Grenzschicht der inneren Kernschicht, aber verdrängte Amakrinzellen können in der Ganglienzellschicht gefunden werden. Die Färbung der Nissl-Substanz ist hilfreich bei der Unterscheidung von großen, stark gefärbten Ganglienzellen von kleineren verdrängten Amakrinzellen. Um die Visualisierung dieser Zellen zu erleichtern, modifizierten wir das Protokoll der Cresylviolett-Arbeitslösung, indem wir das Volumen der Kresylviolett-Stammlösung in der Arbeitslösung erhöhten. Wir haben das Volumen in 1,0-ml-Schritten von 6,0 ml auf 9,0 ml erhöht, was wiederum das Volumen des destillierten Wassers reduziert. Um die Leichtigkeit der Visualisierung und Identifizierung der Ganglienzellen zu beurteilen, wurde eine optimale Färbung mit 9 ml zusätzlicher Kresylviolett-Stammlösung und 51 ml destilliertem Wasser erreicht. Cresylviolett ist ein basischer Farbstoff, obwohl es zum Färben der Nissl-Substanz erforderlich ist, in einer sauren Lösung verwendet zu werden, und daher blieb das Volumen der Essigsäure unverändert bei 0,5 ml. Periodic Acid Schiff Die Färbung mit periodischer Säure Schiff (PAS) wurde durchgeführt, um hervorzuheben Polysaccharide, insbesondere Glykogen, die in Basalmembranen und Pilzzellwänden vorkommen und auf eine Pilzinfektion hinweisen. Der Prozess der PAS-Färbung besteht darin, die Hydroxylgruppen in Polysacchariden mit periodischer Säure zu oxidieren, wodurch Aldehydgruppen entstehen. Die Anwendung des Schiff-Reagenzes bindet an die Aldehydgruppen, wodurch eine magentafarbene Farbe entsteht, wobei Hämatoxylin-Gegenfärbung violette Zellkerne erzeugt. Unsere Objektträger zeigten eine schwache Färbung an der inneren Grenzmembran. Dies kann auf die vorhandenen Polysaccharide zurückzuführen sein, da nicht alle Polysaccharide in einem Standardzeitrahmen oxidiert werden können, insbesondere solche, die anionische Polysaccharide enthalten. Daher haben wir die Dauer des Oxidationsschritts von 10 min auf 12, 15 und 20 min erhöht. Wir fanden heraus, dass ein 15-minütiger Oxidationsschritt bei der PAS-Färbung am effektivsten war. Masson' s Trichrome Blue Das Prinzip der Masson'schen Trichromblau-Färbung besteht darin, Kollagen und Muskeln zu färben, was in unseren Netzhautpräparaten verwendet werden kann, um eine Zunahme des Kollagengewebes anzuzeigen, was auf eine Fibrose aufgrund einer Verletzung hinweisen kann. Dieser Fleck reagiert empfindlich auf Fixierungstechniken, so dass Änderungen erforderlich waren, um eine optimale Färbung zu erzielen. Der Prozess dieser Färbung besteht darin, das Zytoplasma und die Muskelfasern zunächst mit dem sauren Biebrich-Scharlachsäure-Fuchsinrot-Farbstoff rot zu färben. Die Differenzierung mit Phosphomolybd-/Phosphowolframsäure konkurriert mit dem roten Farbstoff in den Kollagenfasern. In der Sklera sind die großen Phosphomolybdic/Phosphotungssäure-Moleküle in der Lage, das lockere Bindegewebe zu durchdringen, im Gegensatz zu den dichten Muskelfasern, die nur für kleine Moleküle durchdringbar sind. Anschließend wird Anilinblau-Farbstoff aufgetragen, um die Säure in den Kollagenfasern zu ersetzen und blaugefärbte Sklera zu erzeugen. Um diese Färbung im Netzhautschnitt zu optimieren, wurde die Dauer der Färbung mit Biebrich-Scharlach-Fuchsin-Farbstoff verkürzt, um ein Gleichgewicht zwischen dem blauen und dem roten Farbstoff herzustellen. Die Verwendung von Davidsons Fixiermittel erforderte auch eine verlängerte Differenzierungszeit, um den roten Farbstoff aus dem Kollagen zu entfernen. Wir testeten die Differenzierung bei 5, 6, 8 und 10 Minuten, wobei optimale Ergebnisse bei 6 Minuten auftraten. Die Differenzierung variiert auch in Abhängigkeit von der Dicke und dem Schnitt glatter Schnitte, wobei möglicherweise eine Differenzierung von mehr als 6 Minuten erforderlich ist. Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antikörper Polyklonal, Wirtsspezies ist Kaninchen, hat ein Molekulargewicht von 50 kDa. Das GFAP-Antigen ist ein intermediäres Filament, das im Zytoplasma (dem Zytoplasma von Astrozyten und Mü B. Zellen in der Netzhaut), wird das Antigen aus 428 Aminosäuren gebildet und hat ein Molekulargewicht von 49512 Da. Neurofilament-200 antibody Monoklonal, Wirtsspezies ist die Maus, Klon N52, Isotyp IgG1, erkennt er phosphorylierte und nicht-phosphorylierte Formen der schweren Neurofilamente, die ein Molekulargewicht von 200 kDa haben. Der Antikörper bindet an ein Epitop in der Schwanzdomäne des Neurofilaments. Der Antikörper färbt Neurofilamente in den neuronalen Perikaryen, Dendriten und Axonen. Glutamin-Synthetase (GS)-Antikörper Monoklonal, Klon GS-6, Wirtsspezies ist Maus, hat ein Molekulargewicht von 45 kDa und Antikörper-Isotyp IgG2a. Das GS-Antigen befindet sich im Zellzytoplasma (Zytoplasma von Mü B. Zellen in der Netzhaut), hat das Antigen 373 Aminosäuren und ein Molekulargewicht von 42.064 Da.