Immunhistochemische Analyse im Rat des Zentralnervensystems und peripheren Lymphknoten Gewebeschnitte

Milena Z. Adzemovic; Manuel Zeitelhofer; Marianne Leisser; Ulricke Köck; Angela Kury; Tomas Olsson

doi:10.3791/50425

Methodenartikel

Immunhistochemische Analyse im Rat des Zentralnervensystems und peripheren Lymphknoten Gewebeschnitte

DOI:

10.3791/50425

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14. November 2016

Milena Z. Adzemovic¹^,² , Manuel Zeitelhofer¹^,³ , Marianne Leisser² , Ulricke Köck² , Angela Kury² , Tomas Olsson¹

¹Department of Clinical Neuroscience, Neuroimmunology Unit, Center for Molecular Medicine, Karolinska Institutet, ²Department of Neuroimmunology, Center for Brain Research, Medical University of Vienna, ³Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Vascular Biology Unit, Karolinska Institutet

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir präsentieren hier ein optimiertes, detailliertes Protokoll für die Doppelimmunfärbung in Formalin-fixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten des Zentralnervensystems (ZNS) und des peripheren Lymphknotens (LN) von Ratten.

Zusammenfassung

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Immunhistochemie (IHC) bietet hochspezifische, zuverlässige und attraktive Protein-Visualisierung. Korrekte Durchführung und Interpretation einer IHC-basierten Mehrfarbenkennzeichnung ist anspruchsvoll, insbesondere dann, wenn für die Beurteilung der Zusammenhänge zwischen Zielproteine in das Gewebe mit einem hohen Fettgehalt, wie beispielsweise das zentrale Nervensystem (ZNS) verwendet.

Unser Protokoll stellt eine Weiterbildung der Standard Immunomarkierung Technik besonders angepasst für den Nachweis von sowohl strukturelle als auch lösliche Proteine in der Ratte ZNS und peripheren Lymphknoten (LN) durch Neuroinflammation betroffen. Dennoch mit oder ohne weitere Modifikationen, könnte unser Protokoll wahrscheinlich für die Erkennung von anderen verwandten Protein-Targets verwendet werden, auch in anderen Organen und Arten als hier dargestellt.

Einleitung

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Trotz Nutzung moderner Hochdurchsatzanalysen auf der Methylom, Transkriptom oder sogar Proteom-Ebene durchgeführt, Immunfärbung bleibt der Goldstandard für die Proteindetektion direkt in der Gewebeprobe, Zellkultur oder einer Zellabstrich. Durch die Offenlegung der Lokalisierung / Verteilungsmuster, Immunhistochemie (IHC) beurteilen kann relativen Verhältnisse und topographischen Zusammenhänge der Zielproteine und sogar zeigen ihre biologischen Aktivitäten. Daher wird IHC breit für klinische und Forschungszwecke verwendet, beispielsweise zur Diagnose, Behandlung Evaluationen Untersuchung von Krankheitsmechanismen, funktionale und phänotypische Veränderunge....

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Protokoll

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Ethische Erklärung
Vorliegenden Studie ist es in Übereinstimmung mit den Richtlinien des schwedischen National Board für Versuchstiere und der Europäischen Gemeinschaft Richtlinie (86/609 / EWG) unter den ethischen Genehmigungen durchgeführt N338 / 09, N15 / 10 und N65 / 10, die durch die genehmigt Nord Stockholm Tierethikkommission.

1. Gewebepräparation

Perfusions & Fixierung
1. Anesthetize das Tier mit Isofluran transkardialer Perfusion über linken Ventrikels durchzuführen. Initiieren Spülen von Gefäßen mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), um die Blutbestandteile zu entferne....

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Ergebnisse

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Doppelimmunfärbungen (co-Anfärbungen) wurden in Formalin fixierte, in Paraffin eingebettete Ratten CNS und LN Abschnitten durchgeführt. 3-5 um dicke Gewebeschnitte wurden mit einem Schlitten Mikrotom geschnitten, vorbeschichtete Klebeglasobjektträger aufgebracht anschließend auf und behandelt wie zuvor ^10,11,12 beschrieben. Kurz gesagt, nach deparaffinizing, Gewebe Rehydratation und endogene Peroxidase Inaktivierung wurden die Schnitte auf den Antigen-Retrieval-Verfahren unter.......

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Diskussion

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Standard-immunhistochemischen Verfahren erfordern häufig spezifische Anpassungen ein optimales Ergebnis zu erzielen, die häufig umfangreiche Erfahrung beinhaltet, sondern auch "trial and error" -Ansatz. Von Gewebeaufbereitung bis Target-Visualisierung, fast jeder Schritt in dem Protokoll können einzeln unterzogen werden, um entworfen Modifikationen, um das Endergebnis zu verbessern. Doppelfärbung Protokoll hier vorgestellten Beispiel für IHC-basierte Protein besonders angepasst Targeting durch neuroinflammatio.......

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

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Wir danken Hans Lassmann und Jan Bauer für ihre Anleitung und Unterstützung. Wir danken auch Katalin Benedek für die hervorragende technische Unterstützung und Caroline Westerlund für die kritische und sprachliche Würdigung.

Diese Studie wurde durch Zuschüsse von Biogen Idec, der Wenner-Gren-Stiftung, dem Schwedischen Forschungsrat, der Schwedischen Vereinigung von Menschen mit neurologischen Behinderungen, der Schwedischen Gehirnstiftung, dem 6. EU-Rahmenwerk EURATools (LSHG-CT-2005-019015) und Neuropromise (LSHM-CT-2005-018637) unterstützt. Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entschei....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Reagenz
Isofluran (Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (difluormethylether) 2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan (C₃H₂ClF₅O)	Baxter	1001936060	Augenbestrahlung. Beeinflusst wahrscheinlich die Fruchtbarkeit und schädigt das Baby in der Gebärmutter. Nur in einer angemessen ausgestatteten Anästhesieumgebung verabreichen.
Natriumchlorid (NaCl)	Merck	1.0604
Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS), Tablette	Sigma-Aldrich	P4417
Paraformaldehyd (OH(CH₂O)_nH (n = 8 - 100)), 4% in 1x PBS	Apl pharma	34 24 28	Gesundheitsgefahr. Ätzend. Flambierbar. Akute Toxizität.
Ethanol ≥ 99.5%, absolut (CH₃CH₂OH)	Sigma-Aldrich	459844-1L	Flambable.
Xylol (Xylole, histologischer Grad; C₆H₄(CH₃)₂	Sigma-Aldrich	534056	Flamable. Akute Toxizität.
Histo-Comp Paraffinwachs	Tissue-Tek	V0-5-1001
Selbstklebende Objektträger	Starfrost	MIC-1040-W
Xylol-Ersatz XEM-200	Vogel GmbH	ND-HS-200	Sensibilisierung der Atemwege. Kanzerogenität.
α-CD8 (Ox-8) Maus Anti-Ratte, Primärantikörper	AbD Serotec	MCA48G
α-Iba1 (AIF1) Maus Anti-Ratte, Primärantikörper	Millipore	MABN92
α-CD68 (ED1) Maus Anti-Ratte, Primärantikörper	AbD Serotec	MCA341R
α-Eotaxin C-19 (CCL11) Ziege Anti-Ratte, Primärantikörper	Santa Cruz BT	SC-6181
Alkalische Phosphatase (AP)-konjugierter Sekundärantikörper	Dakopatts, Dänemark	D0314
Biotinylierter Sekundärantikörper	Amersham Biotech	RPN1025
Avidin-Meerrettich-Peroxidase-Komplex (HRP)	Sigma-Aldrich	A3151
Naphthol AS-MX-Phosphat (C₁₉H₁₈NO₅P)	Sigma-Aldrich	N4875-1G	Akute Toxizität.
Fast Blue RR Salz, Azoic Diazo Nr. 24 (C₁₅H₁₄ClN₃O₃ x 1/2 ZnCl₂)	Sigma-Aldrich	FBS25
Levamisolhydrochlorid (C₁₁H₁₃ClN_2S)	Sigma-Aldrich	31742	Akute Toxizität.
3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB Chromogen)	DAKO	S3000	Leicht entzündlich. Giftig.
Kupfersulfat (CuSO₄)	Merck	1.02791	Akute Toxizität. Umweltgefahr.
GelTol Wässriges Eindeckmedium	Thermo Electron Corporation	230100
Wasserstoffperoxid, 30% (H₂O₂)	Merck	107210	Akute Toxizität.
Methanol (CH₃OH)	Fluka	65543	Akute Toxizität. Sensibilisierung der Atemwege. Kanzerogenität. Brennbar.
Tris (Hydroxymethyl) Aminomethan, TRIS Base (C₄H₁₁NO₃ )	AppliChem	A1379	Haut- und Augenreizungen.
Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS), Tablette	Sigma-Aldrich	T5030
Di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat (Na₂HPO₄ x 2H₂O)	Merck	1.0658
Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat (NaH₂PO₄ x 1H₂O)	Merck	1.06346
Fötales Kälberserum (FCS)	Cambrex BioScience	DE-14-802F
DAKO Zytomationswaschpuffer 10x	DAKO	S3006	Sollte bei 2-8 & Grad gelagert werden; C zur Hemmung des Bakterienwachstums. Vermeiden Sie Schaumbildung.
N,N-Dimethylformamid; ZMS (C₃H₇NO)	Fluka	40250	Entzündlich. Akute Toxizität.
Glas-Deckgläser 24 x 36 mm	Menzel-Glä ser	BB024036A1
Salzsäure, konz. (HCl)	Sigma-Aldrich	30721	Korrosiv, reizend, permeatorisch. Lungensensibilisator (als saurer Nebel). Giftig.
Salzsäurelösung volumetrisch, 2 M HCl (2 N)	Fluka	71826	Ätzend, reizend, permeatorisch. Lungensensibilisator (als saurer Nebel). Giftig.
Natriumnitrit, ReagentPlus, ≥ 99,0% (NaNO₂)	Sigma-Aldrich	S2252	Oxidationsmittel. Giftig. Gefährlich für die Umwelt.
Ethylendinitriltetraessigsäure-Dinatriumsalz-Dihydrat (EDTA; C₁₀H₁₄N₂Na₂O₈ x 2H₂O)	Merck	1.08454	Orale Exposition kann Auswirkungen auf die Fortpflanzung und die Entwicklung haben.
Ausrüstung
Tissue-Tek^V.I.P Vakuum-Infiltrationsprozessor	Sakura	5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz
Hacker-Bright 8000 Serie Base Sledge Mikrotom	Hacker-Instrumente
Haushalts-Dampfgarer	Braun	MultiGourmet FS 20
Lichtmikroskop	Leica Polyvar 2

Referenzen

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Coons, A., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med. 47, 200-202 (1941).
Nakane, P. K., Pierce, G. B.

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Schlagwörter

Immunhistochemie Gewebevorbereitung Antigen Retrieval Lichtmikroskopie Paraffineinbettung periphere Lymphknoten Prim rantik rper Sekund rantik rper Avidin Meerrettichperoxidase

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