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Methodenartikel

Immunhistochemische Analyse im Rat des Zentralnervensystems und peripheren Lymphknoten Gewebeschnitte

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DOI:

10.3791/50425

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14. November 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Neuroscience, Neuroimmunology Unit, Center for Molecular Medicine, Karolinska Institutet, 2Department of Neuroimmunology, Center for Brain Research, Medical University of Vienna, 3Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Vascular Biology Unit, Karolinska Institutet

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir präsentieren hier ein optimiertes, detailliertes Protokoll für die Doppelimmunfärbung in Formalin-fixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten des Zentralnervensystems (ZNS) und des peripheren Lymphknotens (LN) von Ratten.

Zusammenfassung

Immunhistochemie (IHC) bietet hochspezifische, zuverlässige und attraktive Protein-Visualisierung. Korrekte Durchführung und Interpretation einer IHC-basierten Mehrfarbenkennzeichnung ist anspruchsvoll, insbesondere dann, wenn für die Beurteilung der Zusammenhänge zwischen Zielproteine ​​in das Gewebe mit einem hohen Fettgehalt, wie beispielsweise das zentrale Nervensystem (ZNS) verwendet.

Unser Protokoll stellt eine Weiterbildung der Standard Immunomarkierung Technik besonders angepasst für den Nachweis von sowohl strukturelle als auch lösliche Proteine ​​in der Ratte ZNS und peripheren Lymphknoten (LN) durch Neuroinflammation betroffen. Dennoch mit oder ohne weitere Modifikationen, könnte unser Protokoll wahrscheinlich für die Erkennung von anderen verwandten Protein-Targets verwendet werden, auch in anderen Organen und Arten als hier dargestellt.

Einleitung

Trotz Nutzung moderner Hochdurchsatzanalysen auf der Methylom, Transkriptom oder sogar Proteom-Ebene durchgeführt, Immunfärbung bleibt der Goldstandard für die Proteindetektion direkt in der Gewebeprobe, Zellkultur oder einer Zellabstrich. Durch die Offenlegung der Lokalisierung / Verteilungsmuster, Immunhistochemie (IHC) beurteilen kann relativen Verhältnisse und topographischen Zusammenhänge der Zielproteine ​​und sogar zeigen ihre biologischen Aktivitäten. Daher wird IHC breit für klinische und Forschungszwecke verwendet, beispielsweise zur Diagnose, Behandlung Evaluationen Untersuchung von Krankheitsmechanismen, funktionale und phänotypische Veränderungen in Tiermodellen, usw.

Im wesentlichen Histologie, Pathologie, Biochemie und Immunologie umfasst, hat IHC signifikant seit 1941 fortgeschritten, wenn fluoreszierend markierte Antikörper zum ersten Mal verwendet wurden 1 Pneumokokken - Antigene in infizierten Gewebe zu identifizieren. Visualisierung von zellulären Produkten und Komponenten durch IHC basiert von Antikörpern (Abs) zu ihrem spezifischen Antigen (Ag) auf die Bindung. Neben der Verwendung von Fluorophor markierten Antikörper können Immunreaktionen auch unter Verwendung von Enzymen wie Peroxidase 2,3 oder alkalische Phosphatase 4 sichtbar gemacht werden. Ferner werden zum Nachweis spezifischer Antigen-Antikörper - Wechselwirkung von Licht und Elektronenmikroskopie, während radioaktive Markierungen sichtbar gemacht werden durch Autoradiographie kolloidales Gold-markiertem Antikörper 5 verwendet.

Die Ag-Ab-Immunreaktion kann über direkte und indirekte Methoden erfasst werden. Die direkte Methode ist wesentlich schneller und einfacher, da es direkt primäre Abs 6 beschriftet verwendet. Jedoch aufgrund erheblicher Mangel an Empfindlichkeit, sind indirekte Methoden der direkten diejenigen bevorzugt. Zweischritt indirekten Nachweisverfahren unmarkiert erfordern primäre Abs, wie die erste, und markierten sekundären Abs gegen den primären Abs, als die zweite Schicht 7.Signalverstärkung kann durch die Einbeziehung weiterer, enzymgekoppelter tertiären Ab (dreistufigen indirekten Methode), das bindet an den sekundären Ab erreicht werden. Üblicherweise verwendete indirekte Nachweismethoden sind und Avidin-Biotin-Peroxidase-Antiperoxidase (PAP). Alternativ können alkalische Phosphatase-antialkaline Phosphatase (APAAP) -Komplex anstelle des PAP-Methode verwendet werden. Bemerkenswerterweise scheinen alkalischer Phosphatase (AP) Verfahren sogar als 4 Immunperoxidase Methoden empfindlicher zu sein. Avidin-Biotin-Komplex (ABC) -Methode verwendet biotinylierten sekundären Ab in Kombination mit entweder markiertem Avidin-Biotin-Komplex (LAB) oder Streptavidin-Biotin-Komplex (SLAB) markiert. Nachweisempfindlichkeit kann durch Avidin beteiligt mit Peroxidase oder alkalischer Phosphatase markiertem 8 erhöht werden. Andere Nachweisverfahren im Einsatz sind polymere Kennzeichnung, Tyramin - Amplifikation und Immuno-Rolling - Circle - 9. Bemerkenswerterweise können verschiedene Detektionsverfahren für mehrere Ag Detektions in demselben Gewebe kombiniert werden,Probe, die zum ersten Mal im Jahr 1978 4. Simultaneous Doppelimmunfärbungs präsentiert die hier berichtet wurde , wurde in Formalin fixierten, in Paraffin eingebettete Ratten CNS und LN Gewebeschnitten unter Verwendung von Peroxidase-gebundenen und AP-konjugiertem Sekundärantikörper jeweils durchgeführt. Die Signale wurden 3,3'-diaminobencidine (DAB) Chromogen und die Fast Blue (FB) APAAP-Komplex sichtbar gemacht sind.

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Protokoll

Ethische Erklärung
Vorliegenden Studie ist es in Übereinstimmung mit den Richtlinien des schwedischen National Board für Versuchstiere und der Europäischen Gemeinschaft Richtlinie (86/609 / EWG) unter den ethischen Genehmigungen durchgeführt N338 / 09, N15 / 10 und N65 / 10, die durch die genehmigt Nord Stockholm Tierethikkommission.

1. Gewebepräparation

  1. Perfusions & Fixierung
    1. Anesthetize das Tier mit Isofluran transkardialer Perfusion über linken Ventrikels durchzuführen. Initiieren Spülen von Gefäßen mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), um die Blutbestandteile zu entfernen, gefolgt von 4% Paraformaldehyd in 0,1 M PBS (PFA).
    2. Fixieren Sie seziert Gehirn, Rückenmark und periphere LN Gewebe durch in PFA eingetaucht wird. Nach 24 Stunden bei 4 ° C, übertragen das Gewebe aus PFA in PBS und lagern bei 4 ° C bis zur Weiterverarbeitung. Alternativ zu kommerziellen PBS, lösen sich 9 g NaCl in 250 ml der S &# 246; rensen Puffer und 750 ml VE - Wasser (dH 2 O) hinzuzufügen; 0,2 M Sörensen - Puffer (pH 7,4) lösen sich 13,8 g NaH 2 PO 4 x 1 H 2 O und 71,2 g Na 2 HPO 4 x 2H 2 O in 2,5 l dH 2 O. vorzubereiten
  2. Dehydration & Einbetten
    1. Schneiden Sie das Gewebe in etwa 5 mm dicke Abschnitte mit einer Rasierklinge.
    2. Initiieren des Gewebes Härtungsprozess (Dehydratisierung) , indem das Tissue-Tek VIP Vakuuminfiltrationsprozessor verwendet (Standardverfahren basierend auf Eintauchen in aufsteigenden Konzentrationen von Ethanol, gefolgt von Xylol und schließlich Paraffin (Tabelle 1).
    3. Legen Sie das Gewebe in eine Form und gießen in dem flüssigen Paraffin um die Probe eine "Paraffinblock" zu bilden. Langzeitlagerung erfordert Raumtemperatur (RT). Jedoch vor dem Schneiden ist es empfehlenswert , die Blöcke zu kühlen, beispielsweise über Nacht (o / n) bei 4 ° C.

2. Sectioning

  1. Platzieren Sie den Paraffinblock in eine feste Halterung des Schlittens Mikrotom, die hin und her über das Messer bewegen kann. Stellen Sie den optimalen Winkel zwischen dem Block und dem Mikrotom-Messer (das hängt von Messergeometrie, sondern auch auf der Schnittgeschwindigkeit und Technik).
  2. Schneiden Sie 3 bis 5 um dicke Querschnitte aus dem Paraffinblock.
  3. Übertragen Sie einfach schneiden Abschnitt in einen Wasserbehälter und montieren Sie ihn anschließend aus dem Wasser auf den Glasträger.
  4. Drücken Sie die montierten Abschnitt sorgfältig gegen ein Papiertuch Restwasser und mögliche Luftblasen zu entfernen. Im Handel vorbeschichteten sind Klebstoff Glasobjektträger zu empfehlen.
  5. Trocken gerahmte Dias für ein paar Stunden in einem Ofen 50 - 60 ° C.

3. Entparaffinierung (Rehydrierung & Blockierung der Endogene Peroxidase)

  1. Tauchen Sie die Dias 2x in Xylol (alternativ XylolersatzXEM-200), jedes Mal 15 bis 20 '.
  2. Spülen in 99% Ethanol.
  3. Um die endogene Peroxidase-Aktivität zu blockieren, inkubiere die Abschnitte 30 'in Methanollösung, die 0,25% Wasserstoffperoxid.
  4. Weiter Rückfettung durch Ethanol mit steigendem Wassergehalt unter Verwendung von (99%, 70%, endet in destilliertem Wasser.
  5. Von diesem Punkt der Abdeckung bis Montage schlüpft Abschnitte feucht gehalten werden müssen.

4. Antigen Retrieval

  1. Verwenden Sie einen Dampfgarer zum Kochen Sie die Folien in einer Antigen - Retrieval - Lösung (in diesem Fall EDTA pH 8,5 - Puffer) für 60 '(EDTA Puffer - Stammlösung enthält 1,21 g Tris und 0,37 g gelöst EDTA in 50 ml dH 2 O; zur Herstellung des Arbeits Lösung verdünnte 2,5 ml EDTA - Stammlösung in 47,5 ml dH 2 O).
  2. Das Abkühlen der die Folien auf RT ca. 1 Stunde und dann spülen 3 - 5-fach mit Tris-gepufferte Salzlösung (TBS, verwenden Sie alternativ PBS), bestehend aus 0,05 M Tris und 0,15 M NaCl; pH-Wert 7,5 eingestellt with HCl. Alternativ kommerzielle TBS verwenden.

5. Das Blockieren der unspezifischer Bindungsstellen

  1. Zur Vermeidung von unspezifischen Hintergrundreaktionen, inkubiere die Abschnitte auf RT für 30 'in der blockierenden Lösung, die 10% fötales Kälberserum (FCS) und 90% DAKO Puffer enthält.

6. Doppelimmunmarkierung: Die gleichzeitige Inkubation mit dem primären Abs

  1. Verdünnte erforderliche Menge an primären Antikörper in der Blockierungslösung und Inkubieren o / n bei 4 ° C. Für die Doppelimmunfärbungs kombinieren α-Eotaxin (CCL11; 1: 300) mit α-CD68 (Ed1; 1: 1000) oder α-Iba1 (AIF1, 1: 1000) oder α-CD8a (Ox-8; 1: 200) .
  2. Spülen Sie die Folien 3-5x mit TBS-Puffer (verwenden Sie alternativ 10x verdünnt DAKO-Puffer).
  3. Verdünnte erforderliche Menge an sekundärem Antikörper (biotinylierter anti-Ziege und AP-konjugiertem Anti-Maus, die beide 1: 200) in der Blockierungslösung und inkubiere 1 h bei RT.
  4. Spülen Sie die Folien 3 - 5-fach mit TBS-Puffer (use alternativ 10x verdünnt DAKO-Puffer).
  5. Inkubieren der Objektträger mit Avidin-Meerrettich-Peroxidase-Komplex (HRP) in der Blockierungslösung für 1 Stunde bei RT verdünnt.
  6. Spülen Sie die Folien 3 - 5x mit TBS-Puffer (verwenden Sie alternativ 10x verdünnt DAKO-Puffer).

7. Visualisierung

  1. Visualisierung des gebundenen AP-markierten sekundären Antikörper
    1. Bereiten 0,1 M Tris-HCl - Puffer durch Lösen von 12,1 g Tris in 1 l dH 2 O und pH - Wert auf HCl unter Verwendung von . Verwenden Sie die gleiche Tris-HCl-Puffer 1 M levamisole Lösung herzustellen. Bereiten Sie frisch 4% NaNO 2 -Lösung in dH 2 O.
    2. Zur Erzielung 50 ml des Fast Blue (FB) Substrat (Volumen erforderlich für eine Standard-Glasküvette) auflösen 6,25 mg Naphtol-AS-MX-Phosphat in 312,5 ul DMF in der Glasröhre und rühren in 50 ml vorgewärmten (37 ° C) Tris-HCl-Puffer. in 312,5 ul 2 N HCl hinzufügen 312,5 ul zuvor 12,5 mg FB RR Salz zu lösen preparot 4% NaNO 2 Lösung und rühren Sie die Mischung in den gleichen 50 ml vorgewärmtes Tris-HCl - Puffer. Schütteln Sie leicht, bis die gelbe Flüssigkeit klar wird, und fügen Sie schließlich 77 ul zuvor hergestellten 1 M Levamisol Lösung. Das Filtrat erhaltene Mischung und gieße auf platziert Folien in der Glasküvetten.
    3. Initiieren Sie die Inkubation bei 37 ° C und Kontrollprozess unter dem Lichtmikroskop zu entwickeln ca.. alle 15 - 30 min. Wenn Fuzzy-Drehen, ersetzen Sie die FB-Lösung mit der frischen Mischung.
    4. Spülen Sie die Folien 3 - 5-fach mit TBS-Puffer und Transfer anschließend in PBS-Puffer.
  2. Visualisierung des gebundenen biotinylierten sekundären Antikörper
    1. Bereiten DAB / H 2 O 2 Entwicklungslösung , die durch Verdünnen von 1 ml DAB - Stammlösung (25 mg DAB pro 1 ml PBS) in 49 ml PBS. Fügen 16,5 & mgr; l H 2 O 2 und das Filtrat vor Gießen auf Abschnitte.
    2. Die Umwandlung des Chromogens DAB in Ausfällen Stirnn Pigment kann sofort erfolgen. Steuern Sie den Entwicklungsprozess unter dem Lichtmikroskop (sogar einige Sekunden längere Inkubationszeit kann einen hohen Hintergrund erhöhen und die Maske das spezifische Signal).
    3. Die Intensität des braunen Pigmentes Niederschlag kann alternativ durch Inkubation in 2% Kupfersulfat und 0,9% NaCl für 5 ', die aus Lösung verbessert werden.
    4. Spülen Sie die Folien 3 - 5x mit PBS und schließlich mit dH 2 O, verwenden Sie alternativ Leitungswasser.
    5. Montieren Sie die Folien mit Deckel direkt aus dem Wasser gleitet durch die Verwendung wässriger GelTol Eindeckmediums. Vermeiden Sie Luftblasen zu schaffen.
    6. Ermöglichen eine vollständige Trocknung des Befestigungsmedium, beispielsweise o / n bei 4 ° C. Shop getrockneten Folien auf RT.
1. % Ethanol 20 ' 40 ° C
2. % Ethanol 60 &# 39; 40 ° C
3. % Ethanol 90 ' 40 ° C
4. % Ethanol 60 ' 40 ° C
5. % Ethanol 90 ' 40 ° C
6. % Ethanol 60 ' 40 ° C
7. % Ethanol 90 ' 40 ° C
8. % Ethanol 120 ' 40 ° C
9. Xylol 30 ' 40 ° C
10. Xylol 60 ' 40 ° C
11. Paraffin 60 ' 60 ° C
12. Paraffin 60 ' 60 ° C
13. Paraffin 60 ' 60 ° C
14. Paraffin 120 ' 60 ° C

Tabelle 1 Gewebeverarbeitung von Tissue-Tek VIP Vakuuminfiltrationsprozessor.

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Ergebnisse

Doppelimmunfärbungen (co-Anfärbungen) wurden in Formalin fixierte, in Paraffin eingebettete Ratten CNS und LN Abschnitten durchgeführt. 3-5 um dicke Gewebeschnitte wurden mit einem Schlitten Mikrotom geschnitten, vorbeschichtete Klebeglasobjektträger aufgebracht anschließend auf und behandelt wie zuvor 10,11,12 beschrieben. Kurz gesagt, nach deparaffinizing, Gewebe Rehydratation und endogene Peroxidase Inaktivierung wurden die Schnitte auf den Antigen-Retrieval-Verfahren unter...

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Diskussion

Standard-immunhistochemischen Verfahren erfordern häufig spezifische Anpassungen ein optimales Ergebnis zu erzielen, die häufig umfangreiche Erfahrung beinhaltet, sondern auch "trial and error" -Ansatz. Von Gewebeaufbereitung bis Target-Visualisierung, fast jeder Schritt in dem Protokoll können einzeln unterzogen werden, um entworfen Modifikationen, um das Endergebnis zu verbessern. Doppelfärbung Protokoll hier vorgestellten Beispiel für IHC-basierte Protein besonders angepasst Targeting durch neuroinflammatio...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

Wir danken Hans Lassmann und Jan Bauer für ihre Anleitung und Unterstützung. Wir danken auch Katalin Benedek für die hervorragende technische Unterstützung und Caroline Westerlund für die kritische und sprachliche Würdigung.

Diese Studie wurde durch Zuschüsse von Biogen Idec, der Wenner-Gren-Stiftung, dem Schwedischen Forschungsrat, der Schwedischen Vereinigung von Menschen mit neurologischen Behinderungen, der Schwedischen Gehirnstiftung, dem 6. EU-Rahmenwerk EURATools (LSHG-CT-2005-019015) und Neuropromise (LSHM-CT-2005-018637) unterstützt. Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung über die Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Reagenz
Isofluran (Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (difluormethylether) 2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan (C3H2ClF5O)Baxter1001936060Augenbestrahlung. Beeinflusst wahrscheinlich die Fruchtbarkeit und schädigt das Baby in der Gebärmutter. Nur in einer angemessen ausgestatteten Anästhesieumgebung verabreichen.
Natriumchlorid (NaCl)Merck1.0604
Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS), TabletteSigma-AldrichP4417
Paraformaldehyd (OH(CH2O)nH (n = 8 - 100)), 4% in 1x PBSApl pharma34 24 28Gesundheitsgefahr. Ätzend. Flambierbar. Akute Toxizität.
Ethanol ≥ 99.5%, absolut (CH3CH2OH)Sigma-Aldrich459844-1LFlambable.
Xylol (Xylole, histologischer Grad; C6H4(CH3)2 Sigma-Aldrich534056Flamable. Akute Toxizität.
Histo-Comp ParaffinwachsTissue-TekV0-5-1001
Selbstklebende ObjektträgerStarfrostMIC-1040-W
Xylol-Ersatz XEM-200 Vogel GmbHND-HS-200Sensibilisierung der Atemwege. Kanzerogenität.
α-CD8 (Ox-8) Maus Anti-Ratte, PrimärantikörperAbD SerotecMCA48G
α-Iba1 (AIF1) Maus Anti-Ratte, PrimärantikörperMilliporeMABN92
α-CD68 (ED1) Maus Anti-Ratte, PrimärantikörperAbD SerotecMCA341R
α-Eotaxin C-19 (CCL11) Ziege Anti-Ratte, PrimärantikörperSanta Cruz BTSC-6181
Alkalische Phosphatase (AP)-konjugierter SekundärantikörperDakopatts, DänemarkD0314
Biotinylierter SekundärantikörperAmersham BiotechRPN1025
Avidin-Meerrettich-Peroxidase-Komplex (HRP) Sigma-AldrichA3151
Naphthol AS-MX-Phosphat (C19H18NO5P)Sigma-AldrichN4875-1GAkute Toxizität.
Fast Blue RR Salz, Azoic Diazo Nr. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2)Sigma-AldrichFBS25
Levamisolhydrochlorid (C11H13ClN2S)Sigma-Aldrich31742Akute Toxizität.
3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB Chromogen)DAKOS3000Leicht entzündlich. Giftig.
Kupfersulfat (CuSO4)Merck1.02791Akute Toxizität. Umweltgefahr.
GelTol Wässriges EindeckmediumThermo Electron Corporation230100
Wasserstoffperoxid, 30% (H2O2)Merck107210Akute Toxizität.
Methanol (CH3OH)Fluka65543Akute Toxizität. Sensibilisierung der Atemwege. Kanzerogenität. Brennbar.
Tris (Hydroxymethyl) Aminomethan, TRIS Base (C4H11NO3 )AppliChemA1379Haut- und Augenreizungen.
Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS), TabletteSigma-AldrichT5030
Di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat (Na2HPO4 x 2H2O)Merck1.0658
Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat (NaH2PO4 x 1H2O) Merck1.06346
Fötales Kälberserum (FCS) Cambrex BioScienceDE-14-802F
DAKO Zytomationswaschpuffer 10x DAKOS3006Sollte bei 2-8 & Grad gelagert werden; C zur Hemmung des Bakterienwachstums. Vermeiden Sie Schaumbildung.
N,N-Dimethylformamid; ZMS (C3H7NO)Fluka40250Entzündlich. Akute Toxizität.
Glas-Deckgläser 24 x 36 mm Menzel-Glä serBB024036A1
Salzsäure, konz. (HCl)Sigma-Aldrich30721Korrosiv, reizend, permeatorisch. Lungensensibilisator (als saurer Nebel). Giftig.
Salzsäurelösung volumetrisch, 2 M HCl (2 N)Fluka71826Ätzend, reizend, permeatorisch. Lungensensibilisator (als saurer Nebel). Giftig.
Natriumnitrit, ReagentPlus, ≥ 99,0% (NaNO2)Sigma-AldrichS2252Oxidationsmittel. Giftig. Gefährlich für die Umwelt.
Ethylendinitriltetraessigsäure-Dinatriumsalz-Dihydrat (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O)Merck1.08454Orale Exposition kann Auswirkungen auf die Fortpflanzung und die Entwicklung haben.
Ausrüstung
Tissue-TekV.I.P Vakuum-InfiltrationsprozessorSakura5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz
Hacker-Bright 8000 Serie Base Sledge Mikrotom Hacker-Instrumente
Haushalts-Dampfgarer BraunMultiGourmet FS 20
Lichtmikroskop Leica Polyvar 2

Referenzen

  1. Coons, A., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med. 47, 200-202 (1941).
  2. Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).
  3. Avrameas, S., Uriel, J. Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 262, 2543-2545 (1966).
  4. Mason, D. Y., Sammons, R. Rapid preparation of peroxidase: anti-peroxidase complexes for immunocytochemical use. Journal of immunological. 20, 317-324 (1978).
  5. Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
  6. Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of experimental medicine. 91, 1-13 (1950).
  7. Polak, J. M., Van Noorden, S. Introduction to immunocytochemistry. , Bios Scientific Publishers Ltd. Oxford, UK. (2003).
  8. Elias, J. M., Margiotta, M., Gaborc, D. Sensitivity and detection efficiency of the peroxidase antiperoxidase (PAP), avidin-biotin peroxidase complex (ABC), and peroxidase-labeled avidin-biotin (LAB) methods. American journal of clinical pathology. 92, 62-67 (1989).
  9. Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Vet Pathol. 42, 405-426 (2005).
  10. Adzemovic, M. Z., et al. Expression of Ccl11 associates with immune response modulation and protection against neuroinflammation in rats. PloS one. 7, 39794(2012).
  11. Bauer, J., et al. Endoplasmic reticulum stress in PLP-overexpressing transgenic rats: gray matter oligodendrocytes are more vulnerable than white matter oligodendrocytes. Journal of neuropathology and experimental neurology. 61, 12-22 (2002).
  12. Bradl, M., Bauer, J., Flugel, A., Wekerle, H., Lassmann, H. Complementary contribution of CD4 and CD8 T lymphocytes to T-cell infiltration of the intact and the degenerative spinal cord. The American journal of pathology. 166, 1441-1450 (2005).
  13. Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury. Experimental eye research. 81, 700-709 (2005).
  14. Hirasawa, T., et al. Visualization of microglia in living tissues using Iba1-EGFP transgenic mice. Journal of neuroscience research. 81, 357-362 (2005).
  15. Norment, A. M., Salter, R. D., Parham, P., Engelhard, V. H., Littman, D. R. Cell-cell adhesion mediated by CD8 and MHC class I molecules. Nature. 336, 79-81 (1988).
  16. Hoetelmans, R. W., van Slooten, H. J., Keijzer, R., Jvan de Velde, C. J., van Dierendonck, J. H. Routine formaldehyde fixation irreversibly reduces immunoreactivity of Bcl-2 in the nuclear compartment of breast cancer cells, but not in the cytoplasm. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 74-80 (2001).
  17. Hayat, M. Microscopy, Immunohistochemistry and antigen retrieval methods for light and electron microscopy. , Kluwer Academic. New York. (2002).
  18. Boenisch, T. Formalin-fixed and heat-retrieved tissue antigens: a comparison of their immunoreactivity in experimental antibody diluents. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 176-179 (2001).
  19. Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 741-748 (1991).
  20. Huang, S. N. Immunohistochemical demonstration of hepatitis B core and surface antigens in paraffin sections. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 33, 88-95 (1975).
  21. Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 45, 327-343 (1997).
  22. Taylor, C. R., Shi, S. R. Antigen retrieval: call for a return to first principles. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 8, 173-174 (2000).
  23. Kitamoto, T., Ogomori, K., Tateishi, J., Prusiner, S. B. Formic acid pretreatment enhances immunostaining of cerebral and systemic amyloids. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 57, 230-236 (1987).
  24. Nelson, P. N., et al. Monoclonal antibodies. Molecular pathology : MP. 53, 111-117 (2000).
  25. Van der Loos, C. Immunoenzyme multiple staining methods. , Bios Scientifc publishers Ltd. New York. (1999).
  26. Elias, J. Immunohistopathology. A practical approach to diagnosis. , ASCP Press. Chicago. (2003).
  27. Straus, W. Letter: Cleavage of heme from horseradish peroxidase by methanol with inhibition of enzymic activity. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 22, 908-911 (1974).
  28. Streefkerk, J. G. Inhibition of erythrocyte pseudoperoxidase activity by treatment with hydrogen peroxide following methanol. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 20, 829-831 (1972).
  29. Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 29, 981-984 (1981).
  30. Petrelli, F., Coderoni, S., Moretti, P., Paparelli, M. Effect of biotin on phosphorylation, acetylation, methylation of rat liver histones. Molecular biology reports. 4, 87-92 (1978).
  31. Yagi, T., Terada, N., Baba, T., Ohno, S. Localization of endogenous biotin-containing proteins in mouse Bergmann glial cells. The Histochemical journal. 34, 567-572 (2002).
  32. Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).

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ImmunhistochemieGewebevorbereitungAntigen RetrievalLichtmikroskopieParaffineinbettungperiphere LymphknotenPrim rantik rperSekund rantik rperAvidin Meerrettichperoxidase
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