A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Modell-System für Amylopathy Study

Zusammenfassung

Wir beschreiben Methoden, um Aspekte der amylopathies in der Schnecke zu studieren C. elegans. Wir zeigen, wie Würmer, die humane Aß konstruieren ₄₂ In Neuronen und wie sie ihre Funktion in Verhaltens-Assays zu testen. Wir zeigen, wie man weiter primären neuronalen Kulturen, die für pharmakologische Tests verwendet werden können, zu erhalten.

Zusammenfassung

Amylopathy ist ein Begriff, der anomalen Synthese und Akkumulation von Amyloid-beta (Aß) im Gewebe mit der Zeit beschreibt. Aß ist ein Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit (AD) und wird in Lewy-Körper-Demenz, Einschlusskörperchenmyositis und zerebrale Amyloid-Angiopathie ^1-4 gefunden. Amylopathies schrittweise mit der Zeit entwickeln. Aus diesem Grund einfache Organismen mit kurzen Lebensdauer kann helfen, molekulare Aspekte dieser Bedingungen aufzuklären. Hier beschreiben wir experimentelle Protokolle zu Aß-vermittelte Neurodegeneration mit den Wurm Caenorhabditis elegans zu untersuchen. So konstruieren wir transgene Würmer durch Einspritzen kodierende DNA menschlichen Aß ₄₂ in die Syncytial Keimdrüsen von erwachsenen Hermaphroditen. Transformantenlinien werden durch eine Mutagenese-induzierte Integration stabilisiert. Nematoden sind Alter durch das Sammeln und Säen ihre Eier synchronisiert. Die Funktion der Neuronen, Aß ₄₂ ist in opportun Verhaltensstörungen Assays getestet (Chemotaxis Assays). Primäre neuronale Kulturen aus Embryonen gewonnen werden, um Verhaltensänderungen Daten zu ergänzen und die neuroprotektive Wirkung von anti-apoptotischen Verbindungen testen.

Einleitung

Amyloid beta (Aß) ein Peptid mit 36-43 Aminosäuren, die nach sequentieller Spaltung des Amyloid-Vorläufer-Protein (APP) durch β und γ-Sekretase ¹ gebildet wird. Die γ-Sekretase verarbeitet die C-terminalen Ende der Aß-Peptid und ist verantwortlich für die variable Längen ^5. Die häufigsten Formen von Aß Aß sind ₄₀ und ₄₂ Aß, wobei letzteres häufiger pathologische Zustände wie AD ⁵ zugeordnet. Bei hohen Konzentrationen Aß Form β-Faltblättern, dass aggregieren zu bilden Amyloid-Fibrillen ^6. Fibrillen Ablagerungen sind der Hauptbestandteil der senilen Plaques umliegenden Neuronen. Beide Plaketten ....

Protokoll

1. Bau von transgenen Worms

1. Transformation.
   1. Bereiten Injektion Pads. Geben Sie einen Tropfen von heißem, 2% Agarose in Wasser gelöst, auf ein Deckglas. Schnell stellen ein zweites Deckglas auf dem Tropfen und klopfen es. Nachdem die Agarose erstarrt ist, Dia-Deckgläser auseinander, und backen das Deckglas-Pad in einem Vakuumofen bei 80 ° CO / N.
   2. Ziehen Pipetten. Wir verwenden eine Sutter P-97 Abzieher 1/0.5 mm OD / ID Borosilikatglas Kapillaren mit Faden ziehen. Pipetten mit geschlossener Spitze, die offen zu einem späteren Zeitpunkt unterbrochen geschmiedet.
   3. Bereiten Injektion mischen. Machen Sie das Gemisch, das die Einspritz....

Ergebnisse

Mit unserem Protokolle untersuchen wir die Auswirkungen der menschlichen Aß ₄₂ Oligomer auf die neuronale Funktion ^8. Ein Fragment, das menschliche Aß ₄₂ und der künstlichen Signalpeptid kodierende Sequenz von Feuer Vektor pPD50.52 Konstrukt wurde aus PCL12 ⁹ unter Verwendung der Primer, die eine Sma 1 Restriktionsendonukleasestelle an den Enden eingeführt. Das Fragment wurde dann in einem Konstrukt, das ein 2.481 bp FLP-6-Promotor-Sequenz in den Vektor pPD95.75 Feuer.......

Diskussion

Hier beschreiben wir einen kombinierten Ansatz, um zelluläre und molekulare Aspekte der amylopathies mit C. studieren elegans. Die Vorteile dieses Ansatzes sind:. 1) niedrige Kosten C.elegans im normalen Petrischale mit Bakterien geimpft gehalten, bei Raumtemperatur. 2) Leistungsstarke Genetik. Transgene Tiere können in wenigen Monaten erreicht werden und eine Vielzahl von Promotorsequenzen ist, um die Expression des gewünschten Gens in spezifischen Neuronen fahren. 3) Einfach, gut charakteris.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1. NGM
Natriumchlorid	Sigma-Aldrich	S5886	3 g
bakteriologischer Agar	AMRESCO	J637	17 g
Bacto-Pepton	AMRESCO	J636	2,5 g
Destilliertes Wasser			Auf 975 ml
Sterilisiert durch Autoklavieren, dann die folgenden Elemente hinzufügen und gut mischen
Magnesiumsulfat	Sigma-Aldrich	M2643	1 ml von 1 M Stamm
Calciumchlorid	Sigma-Aldrich	C5670	1 ml von 1 M Stamm
Cholesterin	Sigma-Aldrich	C3045	1 ml von 5 mg/ml Stamm (in Ethanol)
Kaliumphosphatpuffer			25 ml von 1M Stamm
2. Kaliumphosphatpuffer
Kaliumphosphat monobasisch	Sigma-Aldrich	P5655	108,3 g
Kaliumphosphat zweibasisch	Sigma-Aldrich	P3786	35,6 g
Destilliertes Wasser			Auf 1 L
Sterilisiert durch Autoklavieren
3. M9 Puffer
Kaliumphosphat einbasisch	Sigma-Aldrich	P5655	3 g
Natriumphosphat zweibasisch	Sigma-Aldrich	S5136	6 g
Natriumchlorid	Sigma-Aldrich	S5886	5 g
Magnesiumsulfat	Sigma-Aldrich	M2643	1 ml von 1 M Vorrat
Destilliertes Wasser			Auf 1 L bringen
Sterilisiert durch Autoklavieren
4. Eipuffer (pH 7,3, 340 mOsm)
Natriumchlorid	Sigma-Aldrich	S5886	118 mM
Kaliumchlorid	Sigma-Aldrich	P5405	48 mM
Calciumchlorid	Sigma-Aldrich	C5670	2 mM
Magnesiumchlorid	Sigma-Aldrich	M4880	2 mM
HEPES	Fisher Scientific	BP310	25 mM
Destilliertes Wasser			auf 1 l
Sterilisiert durch Autoklavieren
5. CM-15
L-15 Kulturmedium	Gibco	11415	450 ml
Fötales Rinderserum	Gibco	10437-028	50 ml
Penicillin	Gibco	15140	50 Einheiten/ml
Streptomycin	Gibco	15140	50 g/ml
Auf 340 mOsm einstellen, dann steril in autoklavierte Flaschen filtern und bei 4 μg lagern; C
6. Sonstige Reagenzien
Halogenkohlenwasserstoff 700 Öl	Halogenkohlenwasserstoff Produkte	9002-83-9
5 μ m Acrodisc Spritzenvorsatzfilter	PALL Co.	4199
Chitinase	Sigma-Aldrich	C6137-5UN
Lektin (Erdnuss)	Sigma-Aldrich	L0881-10MG
Natriumhydroxid	Fisher Scientific	S320
Lysin	Sigma-Aldrich	L5501
Biotin	Sigma-Aldrich	B4639
Natriumhypochloritlösung	Sigma-Aldrich	425044
Natriumazid	Sigma-Aldrich	71289
Saccharose	Sigma-Aldrich	S0389