A Caenorhabditis elegans Modell-System für Amylopathy Study

Zusammenfassung

Wir beschreiben Methoden, um Aspekte der amylopathies in der Schnecke zu studieren C. elegans. Wir zeigen, wie Würmer, die humane Aß konstruieren ₄₂ In Neuronen und wie sie ihre Funktion in Verhaltens-Assays zu testen. Wir zeigen, wie man weiter primären neuronalen Kulturen, die für pharmakologische Tests verwendet werden können, zu erhalten.

Zusammenfassung

Amylopathy ist ein Begriff, der anomalen Synthese und Akkumulation von Amyloid-beta (Aß) im Gewebe mit der Zeit beschreibt. Aß ist ein Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit (AD) und wird in Lewy-Körper-Demenz, Einschlusskörperchenmyositis und zerebrale Amyloid-Angiopathie ^1-4 gefunden. Amylopathies schrittweise mit der Zeit entwickeln. Aus diesem Grund einfache Organismen mit kurzen Lebensdauer kann helfen, molekulare Aspekte dieser Bedingungen aufzuklären. Hier beschreiben wir experimentelle Protokolle zu Aß-vermittelte Neurodegeneration mit den Wurm Caenorhabditis elegans zu untersuchen. So konstruieren wir transgene Würmer durch Einspritzen kodierende DNA menschlichen Aß ₄₂ in die Syncytial Keimdrüsen von erwachsenen Hermaphroditen. Transformantenlinien werden durch eine Mutagenese-induzierte Integration stabilisiert. Nematoden sind Alter durch das Sammeln und Säen ihre Eier synchronisiert. Die Funktion der Neuronen, Aß ₄₂ ist in opportun Verhaltensstörungen Assays getestet (Chemotaxis Assays). Primäre neuronale Kulturen aus Embryonen gewonnen werden, um Verhaltensänderungen Daten zu ergänzen und die neuroprotektive Wirkung von anti-apoptotischen Verbindungen testen.

Einleitung

Amyloid beta (Aß) ein Peptid mit 36-43 Aminosäuren, die nach sequentieller Spaltung des Amyloid-Vorläufer-Protein (APP) durch β und γ-Sekretase ¹ gebildet wird. Die γ-Sekretase verarbeitet die C-terminalen Ende der Aß-Peptid und ist verantwortlich für die variable Längen ^5. Die häufigsten Formen von Aß Aß sind ₄₀ und ₄₂ Aß, wobei letzteres häufiger pathologische Zustände wie AD ⁵ zugeordnet. Bei hohen Konzentrationen Aß Form β-Faltblättern, dass aggregieren zu bilden Amyloid-Fibrillen ^6. Fibrillen Ablagerungen sind der Hauptbestandteil der senilen Plaques umliegenden Neuronen. Beide Plaketten und diffusionsfähig, nicht-Plaque Aß-Oligomere, wird angenommen, dass die zugrunde liegenden pathogenen Formen von Aß darstellen.

Laboruntersuchung der neuronalen amylopathies wird durch die Tatsache, dass diese Bedingungen Zeitlicher Verlauf kompliziert. Daher ist es important zu genetisch manipulierbaren Tiermodellen komplementären entwickeln Mäuse-mit kurzen Lebensdauer. Diese Modelle können verwendet werden, um bestimmte Aspekte der amylopathies-Regel zellulären und molekularen und aufgrund ihrer Einfachheit dazu beitragen, das Wesen des Problems zu erfassen aufzuklären. Der Wurm Caenorhabditis elegans ist diese Kategorie fällt. Es hat eine kurze Lebensdauer, ~ 20 Tage und darüber hinaus grundlegende zelluläre Prozesse einschließlich der Regulierung der Genexpression, Protein-Trafficking, neuronale Konnektivität, Synaptogenese, Zellkommunikation und Tod sind ähnlich wie Säugetierzellen ^7. Einzigartige Merkmale des Wurms enthalten leistungsfähige Genetik und der Mangel an einem Schiff, das zu neuronalen Schäden unabhängig von Gefäßschäden studieren können. Andererseits begrenzt der Mangel eines Gehirns die Verwendung von C. elegans zu studieren viele Aspekte der Neurodegeneration. Darüber hinaus kann die Wiedergabe und Identifizierung der anatomischen Verteilung der Läsionen in diesem Organismus durchgeführt werden. Andere Limittionen wie die Schwierigkeit, sowohl Unterschiede in der Genexpression Profile und Wertminderungen von komplexen Verhalten und Memory-Funktion zu beurteilen. Hier beschreiben wir Methoden, um C zu erzeugen elegans Modelle amylopathies.

Protokoll

1. Bau von transgenen Worms

1. Transformation.
   1. Bereiten Injektion Pads. Geben Sie einen Tropfen von heißem, 2% Agarose in Wasser gelöst, auf ein Deckglas. Schnell stellen ein zweites Deckglas auf dem Tropfen und klopfen es. Nachdem die Agarose erstarrt ist, Dia-Deckgläser auseinander, und backen das Deckglas-Pad in einem Vakuumofen bei 80 ° CO / N.
   2. Ziehen Pipetten. Wir verwenden eine Sutter P-97 Abzieher 1/0.5 mm OD / ID Borosilikatglas Kapillaren mit Faden ziehen. Pipetten mit geschlossener Spitze, die offen zu einem späteren Zeitpunkt unterbrochen geschmiedet.
   3. Bereiten Injektion mischen. Machen Sie das Gemisch, das die Einspritzung DNA von Interesse (20 ng / ul pro Konstrukt) zzgl. leer Plasmid-DNA zu einer endgültigen Konzentration von 150 ng / ul. Zentrifuge die Injektion Mischung, jede Verunreinigung zu entfernen. Dieser Schritt ist wichtig, weil Verunreinigungen reduzieren Transformationseffizienz. Übertragen Sie die Top-5-ul (Ablagerungen und andere Verunreinigungen sammeln sich im Boden) in ein frisches Röhrchen zu be in Injektion verwendet.
   4. Legen Injektion Mischung durch Kapillarwirkung. Der Boden der Pipette in der Injektion Mischung getaucht. Typischerweise 0,5 ul ausreichen, um 100 Würmer injizieren.
   5. Legen Injektionspipette. Legen Sie die Pipette auf den Halter des Mikromanipulators und brechen sie offen durch Reiben ihrer Spitze gegen die Kante eines Deckglas auf einem Objektträger aus Glas oder alternativ gegen Schmutz auf der Agarose-Pad angebracht. Dies ist ein entscheidender Schritt, da zu groß Tipps Schäden der Wurm zu klein und Tipps sind leicht verstopft. Die Qualität der abgebrochene Spitze kann durch die Form und vor allem durch die Strömungsgeschwindigkeit gemessen werden. Die Fließgeschwindigkeit kann durch die Größe der Blasen, die sich aus der offenen Spitze in einem Tropfen Halogenkohlenstoff 700 Öl in Reaktion auf einen Einspritzdruck eingetaucht beurteilt werden.
   6. Übertragen Würmer Injektion Pad. Geben Sie einen Tropfen von 700 Halocarbonöl auf einer Spritzgießmaschine Pad und übertragen mehrere (1 oder 2 für Anfänger) Würmer auf das Öl. Verwenden Sie einen Wurm holen, um die Würmer nach unten drücken, auf das Kissen, bis diey auf der Agarose haften. Worms sollte in Reihen mit ventralen Seiten in die gleiche Richtung orientiert. Berühren Wurm den Kopf. Wenn nach mehreren Versuchen die Würmer auf dem Pad nicht einhalten, mit einem frischen Pad ersetzen oder erhöhen Agarose Dicke und / oder Konzentration.
   7. Legen Sie die Pipette in die Wurm. Durch Bewegen der Bühne, positionieren Sie den Wurm unter der Pipette. Positionieren Sie die Pipette in den zentralen Kern der Gonade, weil seine Zytoplasma von vielen Keimzelle Kernen gemeinsam genutzt wird. Dies erhöht die Wahrscheinlichkeit, die injiziert DNA viele Nachkommen zu liefern. Die Pipette sollte liegen fast parallel zu der Schnecke (~ 15 ° -25 ° Winkel). Drücken Sie vertikal die Spitze der Pipette nach unten des Wurms Körper, bis die Haut gedrückt wird. Dann vorsichtig am Manipulator tippen, um die Spitze Einsetzen induzieren. Für beste Ergebnisse spritzen beide Keimdrüsen.
   8. Injizieren Sie die DNA-Lösung. Üben Sie Druck auf die Pipette, bis die Gonade schwillt an. Stoppen Sie den Fluss und ziehen Sie den Wurm aus der Pipette. Testen Sie die Nadel für Durchfluss und verschieben Sie dannzum nächsten Wurm, und wiederholen Sie die Schritte Injektion.
   9. Recover die Würmer: Fügen Sie einen Tropfen (~ 10 ul) Erholung Puffer auf die Würmer und inkubieren, bis die Würmer schwimmen beginnen. In das gleiche Volumen M9, warten, bis wieder Würmer Schwimmen und mehrmals wiederholen, bis die Lösung ist meist M9. Individuell übertragen Würmer gesetzten Platten.
2. Integration.
   1. Zeigen 40 gesund, wohlgenährt, L4 Würmer in eine frische Platte
   2. Irradiate mit γ-ray mit 4.000 rad für 40 min. Übertragen bestrahlten Würmer (P0) in frischen, OP50 ausgesät Platten (4 Würmer / Platte). Worms kann alternativ mit einer Dosis von 300 J / m ² UV-Vertices bestrahlt werden.
   3. Übertragen 10-20 F1 Transformanten von jeder Platte zu einzelnen Platten bezeichnen die Platten mit dem entsprechenden P0 Ursprungs.
   4. Einzel-out 2-4 F2 Transformanten für jeden F1 zu getrennten Platten. Überprüfen Sie die F3 Nachkommen für 100% Transmission der Transformation Marker. Typischerweise 1-3% der Nachkommen einer bestrahlten Wurm will eine Integration Veranstaltung.
   5. Machen Bestände von drei oder mehr unabhängigen Transformantenlinien.

2. Behavioral Assays

1. Alter-Synchronisation.
   1. Wachsen Würmer in Standard 10 cm NGM-Platten + OP50 E. coli, bis eine große Population von schwangeren Erwachsenen erreicht ist (3-5 Tage).
   2. Sammeln Sie die Würmer in 50 ml Falcon-Röhrchen durch die Aussetzung in 1 ml M9-Puffer.
   3. 5 ml M9-Puffer und Zentrifuge bei 450 xg für 3 min. Überstand verwerfen. Wiederholen Sie 3-4x.
   4. Am Ende der letzten Zentrifugation den Überstand entfernen und hinzufügen 10 Bände der grundlegenden Natriumhypochlorit-Lösung (0,5 M NaOH, 1% Natriumhypochlorit frisch gemischt) zu den pelletierten Würmer. Inkubation bei RT für ~ 10 min. Die Lyse Reaktion kann, indem ein Tropfen der Lysereaktion auf einem Deckglas und Prüfung der Würmer unter dem Mikroskop beobachtet werden. Bei rund 80% der Würmer gebrochen werden sollte die Reaktion gestoppt werden.
   5. Stoppen Sie die Reaktion durch Lyse adding das gleiche Volumen an sterilem Puffer Ei.
   6. Sammeln Sie die Eier (und Karkassen) durch Zentrifugation bei 450 xg für 5 min.
   7. Waschen Sie die Eier mit sterilem Ei Puffer 2-3x.
   8. Inkubieren Sie die Eier O / N in M9-Puffer und Samen sie auf Standard NGM-Platten.
2. Chemotaxis-Assay.
   1. Bereiten Sie mehrere Stücke von Agar etwa 0.5x0.5x0.5 cm. Wir deponieren die Agar in einer 10-cm-Platte und wir schneiden die Agar Brocken von dort.
   2. Einweichen Agar Chunk in einer Lösung, die das gewünschte Lockstoff (bei Sättigung nahe-sättigenden Konzentrationen) für 2 Stunden. Typische Lockstoffe Lysin (0,5 M), Biotin (0,2 M).
   3. Deposit ein Agar-Stück in einer 10 cm Testplatte in dem der Ort einer Test-Ort und ein Kontrollfeld markiert wurden (Abb. 1A). Erlauben Äquilibrierung und Bildung eines Gradienten O / N (1B). Bereiten Sie 5 Platten für ein einzelnes Experiment.
   4. Vor dem Experiment werden 10 ul 20 mM NaN ₃ (anesthetic) an jedem Punkt.
   5. Platz 20 Jahren synchronisiert Würmer in der Mitte der Platte. Die Platte wird in den Inkubator bei 20 ° C.
   6. Nach 1 Stunde, zählen die Tiere auf den Test / Kontrolle Flecken und berechnen Sie die Chemotaxis-Index (CI) wie folgt: wobei N, _N-Test und N _Cnt., geben Sie die Gesamtzahl der Tiere, die Zahl der Tiere in der Prüfung vor Ort und die Anzahl der Tiere in der Kontrollgruppe vor Ort.

3. Primäre embryonale Zellkultur

1. Lyse Würmer wie im Alter-Synchronisation beschrieben.
2. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von Lyse das gleiche Volumen an sterilem Ei Puffer und Zentrifuge bei 450 xg für 5 min. Sanft Überstand verwerfen dabei darauf achten, nicht zu verlieren pelletiert Eier. Wiederholen Sie 2-3x oder bis Überstand klar ist.
3. Sedimentierte Eier (und Karkassen) In 2 ml sterile Ei-Puffer und 2 ml sterile 60% Saccharose in Ei-Puffer. Mischen Sie diese Lösung, bis Eier vollständig resuspendiert (wie sie zu Klumpen unter Zentrifugation neigen) von Hand oder durch Vortexen.
4. Zentrifuge bei 450 xg für 15 min.
5. Vorsichtig den Überstand (mit den Eiern) in ein steriles Röhrchen. Verwerfen Pellet enthält die Kadaver und andere Nebenprodukte der Lyse.
6. Rückstände von Saccharose durch Resuspendieren die Eier in Ei-Puffer und Zentrifugieren bei 450 xg für 5 min. Vorsichtig sammeln und den Überstand verwerfen. 3x wiederholen.
7. Unter einer laminaren Haube resuspendieren pelletiert Eier in sterile Ei-Puffer mit 1 U / ml Chitinase bei RT, um die Eierschalen zu verdauen. Nach 30 min beginnen, um die Reaktion (unter einem inversen Mikroskop Zellkultur) zu überwachen. Jede Charge von Chitinase hat eine etwas andere Tätigkeit. Typischerweise Verdauung in 1 h abgeschlossen.
8. Bei etwa 70-80% Eierschalen werden von Chitinase Add CM-15 (L-15 Zellkultur med. verdautium enthaltend 10% fötales Rinderserum, 50 U / ml Penicillin und 50 ug / ml Streptomycin). Dissociate Zellen unter Verwendung einer Spritze mit einer 27-Gauge. Filtern Sie die Zellsuspension mit einer 5,0 um Filter zu intakten Embryonen zu entfernen, Klumpen von Zellen und Larven.
9. Pellet das dissoziierte Zellsuspension durch Zentrifugation bei 450 xg für 15 min. Entfernen Sie den Überstand und das Pellet in CM-15 Zellkulturmedium.
10. . Platte dissoziierten Zellen auf Glas-Deckgläschen zuvor mit Erdnuss-Lectin (0,1 mg / ml) in Wasser gelöst beschichtet Hinweis: Zellen müssen an dem Substrat, um zu differenzieren.
11. Die Zellen können bei RT (16-20 ° C) in Luft für mehr als 2 Wochen aufrechterhalten werden.

Ergebnisse

Mit unserem Protokolle untersuchen wir die Auswirkungen der menschlichen Aß ₄₂ Oligomer auf die neuronale Funktion ^8. Ein Fragment, das menschliche Aß ₄₂ und der künstlichen Signalpeptid kodierende Sequenz von Feuer Vektor pPD50.52 Konstrukt wurde aus PCL12 ⁹ unter Verwendung der Primer, die eine Sma 1 Restriktionsendonukleasestelle an den Enden eingeführt. Das Fragment wurde dann in einem Konstrukt, das ein 2.481 bp FLP-6-Promotor-Sequenz in den Vektor pPD95.75 Feuer...

Diskussion

Hier beschreiben wir einen kombinierten Ansatz, um zelluläre und molekulare Aspekte der amylopathies mit C. studieren elegans. Die Vorteile dieses Ansatzes sind:. 1) niedrige Kosten C.elegans im normalen Petrischale mit Bakterien geimpft gehalten, bei Raumtemperatur. 2) Leistungsstarke Genetik. Transgene Tiere können in wenigen Monaten erreicht werden und eine Vielzahl von Promotorsequenzen ist, um die Expression des gewünschten Gens in spezifischen Neuronen fahren. 3) Einfach, gut charakteris...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1. NGM
Natriumchlorid	Sigma-Aldrich	S5886	3 g
bakteriologischer Agar	AMRESCO	J637	17 g
Bacto-Pepton	AMRESCO	J636	2,5 g
Destilliertes Wasser			Auf 975 ml
Sterilisiert durch Autoklavieren, dann die folgenden Elemente hinzufügen und gut mischen
Magnesiumsulfat	Sigma-Aldrich	M2643	1 ml von 1 M Stamm
Calciumchlorid	Sigma-Aldrich	C5670	1 ml von 1 M Stamm
Cholesterin	Sigma-Aldrich	C3045	1 ml von 5 mg/ml Stamm (in Ethanol)
Kaliumphosphatpuffer			25 ml von 1M Stamm
2. Kaliumphosphatpuffer
Kaliumphosphat monobasisch	Sigma-Aldrich	P5655	108,3 g
Kaliumphosphat zweibasisch	Sigma-Aldrich	P3786	35,6 g
Destilliertes Wasser			Auf 1 L
Sterilisiert durch Autoklavieren
3. M9 Puffer
Kaliumphosphat einbasisch	Sigma-Aldrich	P5655	3 g
Natriumphosphat zweibasisch	Sigma-Aldrich	S5136	6 g
Natriumchlorid	Sigma-Aldrich	S5886	5 g
Magnesiumsulfat	Sigma-Aldrich	M2643	1 ml von 1 M Vorrat
Destilliertes Wasser			Auf 1 L bringen
Sterilisiert durch Autoklavieren
4. Eipuffer (pH 7,3, 340 mOsm)
Natriumchlorid	Sigma-Aldrich	S5886	118 mM
Kaliumchlorid	Sigma-Aldrich	P5405	48 mM
Calciumchlorid	Sigma-Aldrich	C5670	2 mM
Magnesiumchlorid	Sigma-Aldrich	M4880	2 mM
HEPES	Fisher Scientific	BP310	25 mM
Destilliertes Wasser			auf 1 l
Sterilisiert durch Autoklavieren
5. CM-15
L-15 Kulturmedium	Gibco	11415	450 ml
Fötales Rinderserum	Gibco	10437-028	50 ml
Penicillin	Gibco	15140	50 Einheiten/ml
Streptomycin	Gibco	15140	50 g/ml
Auf 340 mOsm einstellen, dann steril in autoklavierte Flaschen filtern und bei 4 μg lagern; C
6. Sonstige Reagenzien
Halogenkohlenwasserstoff 700 Öl	Halogenkohlenwasserstoff Produkte	9002-83-9
5 μ m Acrodisc Spritzenvorsatzfilter	PALL Co.	4199
Chitinase	Sigma-Aldrich	C6137-5UN
Lektin (Erdnuss)	Sigma-Aldrich	L0881-10MG
Natriumhydroxid	Fisher Scientific	S320
Lysin	Sigma-Aldrich	L5501
Biotin	Sigma-Aldrich	B4639
Natriumhypochloritlösung	Sigma-Aldrich	425044
Natriumazid	Sigma-Aldrich	71289
Saccharose	Sigma-Aldrich	S0389