Adenovirale Gentransfer in naiven CD4-T-Zellen mit transgenen Expression des Coxsackie Adenovirus-Rezeptor ermöglicht die molekulare Analyse von regulatorischen T-Zell-Differenzierung In vitro.
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Methodenartikel
Adenovirale Transduktion von Naive CD4 T-Zellen zu Treg Differenzierung Studieren
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Regulatorische T-Zellen (Tregs) sind unerlässlich, um Immuntoleranz auf Selbstbestimmung sowie auf bestimmte fremde Antigene zu präsentieren. Tregs kann von naiven CD4 + T-Zellen in vitro mit TCR-und Co-Stimulation in Gegenwart von TGF-und IL-2 erzeugt werden. Dies birgt ein enormes Potenzial für zukünftige Therapien, aber die Moleküle und Signalwege, die Kontrolle Differenzierung sind weitgehend unbekannt.
Primären T-Zellen können durch ektopische Expression manipuliert werden, aber üblichen Verfahren nicht die wichtigste naive Zustand der T-Zelle vor dem primären Antigen-Erkennung anzusprechen. Hier bieten wir ein Protokoll zu ektopische Gene in naiven CD4 T-Zellen exprimieren in vitro vor Induktion Treg Differenzierung. Es gilt Transduktion mit der Replikation-Adenovirus und erklärt, seine Erzeugung und Produktion. Das Adenovirus kann bis große Einsätze (bis zu 7 kb) und kann mit Promotoren ausgestattet werden, um hohe und vorübergehende Überbel erreichenression in T-Zellen. Es wandelt effektiv naive T-Zellen der Maus, wenn sie eine transgene Coxsackie Adenovirus-Rezeptor (CAR) auszudrücken. Wichtig ist, dass nach der Infektion die T-Zellen bleiben naive (CD44 niedrig, CD62L hoch) und Ruhe-(CD25 -, CD69 -) und kann aktiviert und in Tregs differenziert werden ähnlich nicht-infizierten Zellen. Somit ermöglicht dieses Verfahren Manipulation von CD4 T-Zell-Differenzierung von Anfang an. Es sorgt dafür, dass ektopische Genexpression ist bereits in Kraft, wenn sie früh signalisiert Ereignisse des ersten TCR Stimulation induziert zelluläre Veränderungen, die schließlich in Treg Differenzierung führen.
Einleitung
Tregs sind entscheidend für die Immuntoleranz zu halten und überschießenden Immunreaktionen dämpfen. Tregs unterdrücken Zuschauer T-Zell-Aktivierung. Folglich führt Ablation von Tregs zu tödlichen Autoimmunität und Selbstzerstörung durch aktivierte T-Zellen 1 angetrieben. Tregs im Thymus entwickeln während negative Selektion von CD4-positiven einzigen Vorstufen, aber sie können auch in der Peripherie zu unterscheiden von naiven CD4 + T-Zellen bei niedriger Dosis Antigen-Stimulation mit suboptimalen Kostimulation 1,2. Thymic Tregs scheinen Gewebe Autoimmunität gegen Selbst-Antigene zu unterdrücken, während peripheren Tregs bei der Bereitstellung ....
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Protokoll
1. Klonierung eines Gens von Interesse in einem Eintrag Vector
- Klonen Sie das Gen von Interesse in einem Eintrag Vektor. PCR-Amplifikation des Gens von Blunt-End-Ligation in einem Topoisomerase-gekoppelten Vektor (zB pENTR / D-TOPO) oder Restriktionsenzym-vermittelte Klonierung kann für dieses Verfahren verwendet werden, gefolgt.
2. Die Übertragung des Gens von Interesse in der pCAGAdDu Destination Vektor
- Übertragen Sie das Gen von Interesse aus dem Eintrag in das Ziel-Vektor Vektor durch LR Rekombination (zB Gateway-LR Clonase II Enzyme Mix). Dadurch wird der adenoviralen Expressionsvektors <....
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Ergebnisse
Virus Produktion
Zur Erzeugung hoher Virustiter, ist der Zeitpunkt der Zellernte HEK293A in primären Virusproduktion oder Virusamplifikation entscheidend. Repräsentative Fluoreszenz-und Phasenkontrast-Aufnahmen mit visuellen Zeichen der Virus-Produktion sind in Abbildung 3 dargestellt. Die CPE wurden 10 Tage nach der Transfektion von Zellen mit einem HEK293A Kontrolle pCAGAdDu Vektor ohne Insert beobachtet. CPE sind durch das Auftreten von Bereichen mit vergrößerten und Round-u.......
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Diskussion
Virus Generierung und Titration
Für eine optimale Transfektion Ergebnisse scheinen die Qualität und Menge der linearisierte Vektor wichtigste. Konnten wir nicht beobachten negative Auswirkungen auf die primären Lysat Produktion von einer anfänglichen Überwucherung der Kultur seit der Infektion schnell gehen wird, sobald effiziente Virus-Produktion auftritt. Virus kann jedoch die Produktion um HEK293A Zellen durch lange Einsätze, die die Effizienz verringern betroffen sein. Einige offene Leserah.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, keinen Interessenkonflikt.
Danksagungen
Die Autoren möchten Lirui Du für den Bau des pCAGAdDU Vektor und Oliver Gorka für die Bereitstellung der Fixierung Protokoll danken.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K240020 | |
| Gateway LR Clonase II Enzymmix | Invitrogen | 11791020 | |
| PacI | New England Biolabs | R057S | |
| jetPEI | Polyplus-Transfektion | 101-10N | |
| HEK293A Zelllinie | Invitrogen | R705-07 | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| 6-Well-Platten | BD Falcon | 353046 | |
| 14 cm Gewebekulturschale | Nunc | 168381 | |
| BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ 1)1Jdgr | Taconic Farms | Modell Nr. 4285 | |
| Naive CD4+ T-Zell-Isolationskit II | Miltenyi Biotech | 130-094-131 | |
| DMEM | Invitrogen | 41966-052 | |
| FBS | PAN Biotech | 1502-P110704 | |
| PenStrep | Invitrogen | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F | |
| NaPyruvate | Lonza | BE13-115E | |
| NEAA 100x | Lonza | BE13-114E | |
| L-Glutamin | Invitrogen | 25030 | |
| HEPES Puffer Lösung (1 m) | Invitrogen | 15630-056 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-7522 | |
| MEM Essentielle Vitaminmischung (100x) | Lonza | 13-607C | |
| Dynabeads Maus T-Aktivator CD3/CD28 für die Zellexpansion und -aktivierung | Invitrogen | 114-56D | |
| Rekombinant Human TGF-beta 1 | R& D Systems | 240B | |
| Proleukin S (18 x 106IE) | Novartis | ||
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L-23105 | |
| Maus BD Fc BlockT | BD Pharmingen | 553141 | |
| Anti-Maus/Ratte Foxp3 PE | eBioscience | 12-5773-82 | |
| Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay | Roche Applied Biosystems | ||
| LightCycler 480 Sonden Master | Applied Biosystems | 04902343001 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transkriptionskit | Roche Applied Biosystems | 4366596 |
Referenzen
- Lahl, K., Loddenkemper, C., et al. Selective depletion of Foxp3+ regulatory T cells induces a scurfy-like disease. The Journal of Experimental Medicine. 204 (1), 57-63 (2007).
- Kretschmer, K., Apostolou, I., Hawiger, D., Khazaie, K., Nussenzweig, M. C., von Boehmer, H.
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Nachdrucke und Genehmigungen
