Laser Capture Mikrodissektion von Neuronen aus Differenzierte Menschen Neuroprogenitor Zellen in Kultur

Zusammenfassung

Menschen neuroprogenitor Zellen (NPCs) wurden unter proliferierenden Bedingungen erweitert. NSC wurden in Neuron-reiche Kulturen in der Gegenwart einer Kombination von Neurotrophinen unterscheiden. Neuronale Marker wurden durch Immunfluoreszenz-Färbung nachgewiesen. Um eine reine Population von Nervenzellen zu isolieren, wurden NPCs auf PEN-Membran-Folien differenziert und Laser-Mikrodissektion durchgeführt wurde.

Zusammenfassung

Neuroprogenitor Zellen (NPC) von der menschlichen fötalen Gehirn isoliert wurden unter proliferativen Bedingungen in Gegenwart von epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) und Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), um eine reichliche Zufuhr von Zellen bereitzustellen erweitert. NSC in Gegenwart einer neuen Kombination von Nervenwachstumsfaktor (NGF) differenziert, brain-derived neurotrophic factor (BDNF), Dibutyryl-cAMP (DBC) und Retinsäure auf mit Poly-L-Lysin-und Maus-Laminin beschichteten Platten zu erhalten Neuron reichen Kulturen. NPCs wurden auch in der Abwesenheit von Neurotrophine, DBC und Retinsäure und in Gegenwart von ciliary neurotrophic factor (CNTF) zu Astrozyten-reichen Kulturen ergeben differenziert. Differenzierte NPCs wurden durch Immunfluoreszenzfärbung für ein Panel von neuronalen Marker NeuN einschließlich, Synapsin, Acetylcholinesterase, Synaptophysin und GAP43 gekennzeichnet. Saure Gliafaserprotein (GFAP) und STAT3, Astrozyten-Marker wurden in 10-15% der differenzierten NPCs erkannt. Zur ErleichterungZelltyp-spezifische molekulare Charakterisierung wurde die Laser Mikrodissektion durchgeführt, um Neuronen auf Polyethylennaphthalat (PEN)-Membran gleitet kultiviert isolieren. Die in dieser Studie beschriebenen Methoden liefern wertvolle Werkzeuge, um unser Verständnis der molekularen Mechanismen der Neurodegeneration zu fördern.

Einleitung

Lebenslange Neurogenese ist bekannt, in der Subventrikularzone der Seitenventrikel und der subgranulären Schicht des Gyrus dentatus des erwachsenen Gehirns von Säugetieren ¹ auftreten. Neuroprogenitor Zellen (NPCs), die aus diesen Regionen stammen, sind multipotente Zellen, die in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten ² differenzieren können. NSC haben Interesse, weil ihr Potential bei Patienten mit verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen einschließlich Parkinson-Krankheit, amyotrophe Lateralsklerose, Schlaganfall und Alzheimer-Krankheit (AD) ³ transplantiert werden erzeugt. Studien mit NPCs haben in der Regel auf dieser Transplantation Winkel konzentriert, aber das Potential der NPC-abgeleiteten Neuronen als Zellkultur-Modell, um den Mechanismus der Neurodegeneration zu bestimmen, ist noch nicht vollständig ausgenutzt. Frühere Studien haben in der Regel verwendet, post-mitotischen Neuronen aus Nager-Hirngewebe, die für jedes Experiment isoliert werden müssen, da sie nicht isoliert sindSelbsterneuerung. Obwohl humane Neuroblastom-Zelllinien, einschließlich SH-SY5Y-und SK-N-MC-Zellen erweitert werden kann, haben sie nicht die Eigenschaften der primären Neuronen. Menschliche NSC, andererseits bieten sowohl Vorteile, da sie für mehrfache Durchgänge erweitert werden und differenziert werden, um eine Zellpopulation mit den Merkmalen des primären Neuronen ^4,5 zu erzeugen. In der aktuellen Studie beschreiben wir eine neue Differenzierungsprotokoll, um eine konsistente Neuron-reichen Bevölkerung aus kommerziell erhältlichen NPCs aus menschlichen fetalen Gehirns isoliert zu erhalten. Da diese Kulturen haben einen kleinen Prozentsatz von Gliazellen enthalten, brauchen wir zusätzliche Methoden, um eine reine Population von Neuronen zur molekularen Charakterisierung isolieren. Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) ist eine neuartige Technik, mit der eine homogene Population von Zellen aus einem Gewebeschnitt selektiv zur Genexpressionsanalyse ⁶ erfasst werden. Das Gehirn ist ein heterogenes Gewebe, bestehend aus Neuronen, Glia und anderen Zell types. LCM wurde verwendet, um Neuronen-spezifische Genexpression zu bestimmen, analysiert ^7-10. Wir haben schon früher durchgeführt LCM von Neuronen im Hippocampus von AD (Tg2576) Maushirnschnitten zu einer verminderten Expression des zyklischen AMP-Response-Element-bindendes Protein (CREB) und BDNF spezifisch in Neuronen im Hippocampus ¹¹ zeigen. In der vorliegenden Studie beschreiben wir Verfahren für die Erweiterung der menschlichen NPCs, neuronale Differenzierung, Immunfluoreszenzfärbung für neuronale Marker und LCM für die Isolierung von Neuronen auf PEN-Membran-Folien kultiviert.

Protokoll

1. Erweiterung des menschlichen NPCs (Abbildung 1)

1. Revive die Tiefkühllagerung von menschlichen NPCs aus fötalen Gehirns (Lonza Walkersville, MD, USA) und Kultur sie in Suspension in T-75-Flaschen als Neurosphären (Abbildung 1A) in Neurobasalmedium enthält Proliferation Ergänzungen, EGF (10 ng / ml) und FGF (10 ng / ml).
2. Nach 3 Tagen in Kultur übertragen die Neurosphären in ein 15 ml Zentrifugenrohr und bei 500 rpm für 5 min.
3. Überstand verwerfen und hinterließ ~ 100 ul Medium über dem Zellpellet und Überführung in ein Eppendorf-Röhrchen. A 100 ul Zellpellet ist genug, um in zwei T-75-Flaschen aufgeteilt. Wenn weniger, reduzieren Sie die Anzahl der Fläschchen, als neuroprogenitor Zellen nicht zu vermehren, wenn aufgeteilt dünn.
4. Verreiben des Pellets mit einer Spitze 200 ul 50x, während die 200 ul Spitze gegen den Boden des Röhrchens. Teilen Sie die Zellsuspension in zwei gleiche Teile und fügen Sie sie in zwei T-75-Flaschen (1-2 split), eine für die FortsetzungExpansion und eine weitere Differenzierung.
5. Fahren Sie mit der Kultur der neuroprogenitor Zellen für die Erweiterung (erste Kolben), indem das Medium alle 4-5 Tage, bis die Neurosphären ihrer ursprünglichen Größe von 300-500 um zu erreichen. Ändern Medium durch Zentrifugation (500 rpm, 5 min), entsorgen Sie das alte Medium und neue Medium.

2. Differenzierung von humanen NPCs in ein Neuron reiche Kultur (Abbildung 2)

1. Für die Differenzierung von Zellen in eine neuroprogenitor Neuron reiche Kultur, legen Sie eine einzelne Deckglas in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte und Mantel mit 100 ug / ml Poly-L-Lysin durch Zugabe von 500 ul in jede Vertiefung. Geschirr Inkubation 30 min bei RT.
2. Saugen Sie den Poly-L-Lysin-Lösung und spülen Sie die Platte mit sterilem Wasser.
3. Nächstes Beschichtung der Vertiefungen der Platte mit 500 ul 5 ug / ml Maus-Laminin und Inkubation für 30 min. Nach der Inkubation, Waschen der Vertiefungen mit PBS.
4. 4 Tage nach splitting der Zellen (Schritt 1.4), übertragen Sie die kleinen Neurosphären in den Kolben mit der Bezeichnung "Für Differenzierung" in die beschichteten Schalen in einer Dichte von ~ 500 Neurosphären pro Vertiefung einer 24-Well-Platte.
5. Nach 6 Stunden, wenn die Neurosphären in die Schale legen, entfernen Sie das Proliferationsmedium und fügen Differenzierungsmedium, bestehend aus Neurobasalmedium, B27 ergänzen, NGF (20 ng / ml), BDNF (10 ng / ml), DBC (100 mM), und Retinsäure (2 uM).

3. Immunfluoreszenz-Färbung von Differentiated NPCs (Abbildung 3)

1. Nach Kultur der Zellen in neuroprogenitor neuronalen Differenzierungsmedium für zwei Wochen, wird ein Neuron-reiche Kultur erhalten. Spülen Sie die Neuronen einmal in PBS und dann fix sie in 4% Paraformaldehyd für 30 min. Einmal befestigt, spülen Sie die Zellen dreimal mit PBS.
2. Inkubieren der Zellen mit Permeabilisierung Puffer (5% BSA und 0,2% Triton X-100 in PBS) bei Raumtemperatur für 60 min.
3. Geschirr O / N Inkubieren bei 4 ° C ina Shaker mit der folgenden Kombination von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern in 3% BSA in PBS: NeuN (1:250) und Synapsin (1:250); Acetylcholinesterase (1:500) und Synaptophysin (1:250), BDNF (1 : 500) und GAP43 (1:250); STAT3 (1:500) und GFAP (1:1000).
4. Dreimal Waschen Sie die Deckgläser mit PBS inkubiert und dann sie mit Anti-Kaninchen-Cy3-und Anti-Maus-FITC Sekundärantikörper bei RT in Dunkelheit für 90 min. Nach der Inkubation, waschen Sie die Deckgläser dreimal mit PBS.
5. Zeigen 10 ul Montagemedium auf einen Objektträger, nehmen Sie das Deckglas von der Kulturschale mit einer Pinzette, und legen Sie es auf den Kopf an der Montage Medium. Sanft, wischen Sie überschüssiges Medium Montage und die Ränder mit Nagellack.
6. Untersuchen der immun Neuronen in einem Fluoreszenzmikroskop.

4. Laser Mikrodissektion von Neuronen (Fig. 4)

1. Differenzieren NPCs in einem Neuron-reiche Kultur auf PEN-Membran SchieberS mit Poly-L-Lysin und Laminin der Maus nach den für Fig. 2 beschriebenen Verfahren beschichtet.
2. Führen Sie alle weiteren Schritte unter RNase-freien Bedingungen.
3. Stain die Kulturen mit HistoGene Stain (Arcturus), um die Zellen zu visualisieren.
4. Finden Sie die Bereiche der reinen neuronalen Populationen frei von Astrozyten mit der Straßenkarte Bild des gesamten Folie mit dem Veritas LCM-System. Markieren Sie die Neuronen mit Hilfe der Zeichenwerkzeuge.
5. Laser-Capture durchführen dieser Bereiche mit computergesteuerten Präzisions und Automatisierung in einem zweistufigen Prozess. Zuerst wird IR (Infrarot) an mehreren Stellen mit einer Laserleistungseinstellung von 70 mW und einer Puls 2.500 &mgr; gebrannt, um die Membran zu befestigen, um die Kappe. Als nächstes wird der markierte Bereich unter Verwendung eines UV-Schneidwerkzeug bei einem niedrigen Pegeleinstellung von 10 mV ausgeschnitten.
6. Kombination dieser Verfahren selektiv erfasst die markierten Bereiche aus der PEN-Membran auf CapSure LCM Makro Kappen. Wenn die Kappe angehoben wird, die Membran mit dem neurons hält sich an die Mütze.
7. Isolieren Gesamt-RNA aus LCM-Proben unter Verwendung eines PicoPure RNA-Isolierung-Kit (Arcturus) und Behandlung mit DNase.
8. Amplify die isolierte RNA mit RNA-Amplifikation Kit RiboAMP folgenden Anweisungen aus dem Kit.
9. Führen Sie Echtzeit-RT-PCR-Analyse unter Verwendung von TaqMan-Sonden für die menschliche Neurofilament schweren Kette (hNFHc) zu erfassen.

Abkürzungen:

AD, Alzheimer-Krankheit, BDNF, brain-derived neurotrophic factor, CREB, cyclische AMP-Antwortelement bindendes Protein, DBC, cyclische Dibutyryl AMP, EGF, epidermaler Wachstumsfaktor, FGF, Fibroblastenwachstumsfaktor, GFAP, saures Gliafaserprotein; LCM Laser Mikrodissektion, NGF, Nervenwachstumsfaktor; NPC, neuroprogenitor Zelle; PEN, Polyethylennaphthalat.

Ergebnisse

Ausbau der NPCs (Abbildung 1)

Wenn Neurosphären werden auf einer Einzelzellsuspension durch Verreiben gebrochen, muss der Pipettenspitze, um den Boden des Röhrchens zu berühren, so dass es einen gewissen Widerstand, wenn die Suspension auf und ab pipettiert. Die Anzahl der Verreibung wird zwischen Individuen und muß durch Versuch und Irrtum durch Untersuchen der resultierenden Zellsuspension unter dem Mikroskop bestimmt werden variieren. Es ist kritisch, um eine ausreichende Di...

Diskussion

Wir beschreiben in dieser Studie ein Neuron-reichen Zellkulturmodell durch die Differenzierung von selbst erneuernden menschlichen neuroprogenitor Zellen und eine Methode, um eine reine Population von Neuronen durch Laser-Mikrodissektion isolieren. Wir haben eine Kombination von NGF, BDNF, DBC und Retinsäure für die neuronale Differenzierung von NPCs verwendet. DBC wird zur CREB, ein Transkriptionsfaktor, der Neurogenese ¹² verbessert aktivieren. Retinsäure induziert Zellzyklusaustritt und reduziert die Glia-...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Neuroprogenitorzellen (NPCs)	Lonza	PT-2599
Neurocult NS-A humanes Basalmedium	Stammzelltechnologie	5750
Neurocult NS-A Proliferationsergänzung	Stammzelltechnologie	5753
Neurocult NS-A Differenzierungsergänzung	Stammzelltechnologie	5754
B-27 Ergänzung (50x)	Invitrogen	17504-044
Stammzelltechnologie	humanen epidermalen Wachstumsfaktors	2633
Fibroblasten-Wachstumsfaktor	Sigma	F0291
Vom Gehirn abgeleiteter neurotropher Faktor	Zellsignalisierung	3897S
Nervenwachstumsfaktor	Invitrogen	13257-019
Dibutyryl zyklisch AMP	Sigma	D-0627
Poly-L-Lysin	Sigma	P-5899
Maus Laminin	Sigma	L-2020
Retinsäure	Sigma	R-2625
STAT3 Antikörper	Zellsignalisierung	9132
GFAP Antikörper	Zellsignalisierung	3670
GAP43 Antikörper	Transduktionslaboratorien	612262
BDNF Antikörper	Millipore	AB1534SP
Acetyl Cholinesterase Antikörper	Santz cruz	Sc-11409
Synaptophysin Antikörper	Abcam	ab18008-50
NeuN Antikörper	Chemicon	MAB377
Synapsin Antikörper	Novus	NB300-104
Anti Maus FITC	Jackson Immuno	115-095-146
	Research Laboratories
Anti Rabbit Cy3	Jackson Immuno	711-165-152
	Research Laboratories
BSA	Sigma	A1653
Triton-X 100	Acros	21568-2500
Paraformaldehye	Fisher	4042
Deckglas (Big Circle Deckglas)	Fisherbrand	12-545-102
Eindeckmedium (Prolong Gold)	Invitrogen	P36930
Stiftmembran	Angewandte Biosysteme	LCM0521
Histogene LCM Färbekit für gefrorene Schnitte	Angewandte Biosysteme	KIT0401
RiboAmp RNA-Amplifikationskit	Angewandte Biosysteme	KIT0201
Picopure RNA Isolation Kit	Angewandte Biosysteme	KIT0202
CapsureMacro LCM-Verschlüsse	Angewandte Biosysteme	LCM0211