Laser Capture Mikrodissektion von Neuronen aus Differenzierte Menschen Neuroprogenitor Zellen in Kultur

Summary

Menschen neuroprogenitor Zellen (NPCs) wurden unter proliferierenden Bedingungen erweitert. NSC wurden in Neuron-reiche Kulturen in der Gegenwart einer Kombination von Neurotrophinen unterscheiden. Neuronale Marker wurden durch Immunfluoreszenz-Färbung nachgewiesen. Um eine reine Population von Nervenzellen zu isolieren, wurden NPCs auf PEN-Membran-Folien differenziert und Laser-Mikrodissektion durchgeführt wurde.

Abstract

Neuroprogenitor Zellen (NPC) von der menschlichen fötalen Gehirn isoliert wurden unter proliferativen Bedingungen in Gegenwart von epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) und Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), um eine reichliche Zufuhr von Zellen bereitzustellen erweitert. NSC in Gegenwart einer neuen Kombination von Nervenwachstumsfaktor (NGF) differenziert, brain-derived neurotrophic factor (BDNF), Dibutyryl-cAMP (DBC) und Retinsäure auf mit Poly-L-Lysin-und Maus-Laminin beschichteten Platten zu erhalten Neuron reichen Kulturen. NPCs wurden auch in der Abwesenheit von Neurotrophine, DBC und Retinsäure und in Gegenwart von ciliary neurotrophic factor (CNTF) zu Astrozyten-reichen Kulturen ergeben differenziert. Differenzierte NPCs wurden durch Immunfluoreszenzfärbung für ein Panel von neuronalen Marker NeuN einschließlich, Synapsin, Acetylcholinesterase, Synaptophysin und GAP43 gekennzeichnet. Saure Gliafaserprotein (GFAP) und STAT3, Astrozyten-Marker wurden in 10-15% der differenzierten NPCs erkannt. Zur ErleichterungZelltyp-spezifische molekulare Charakterisierung wurde die Laser Mikrodissektion durchgeführt, um Neuronen auf Polyethylennaphthalat (PEN)-Membran gleitet kultiviert isolieren. Die in dieser Studie beschriebenen Methoden liefern wertvolle Werkzeuge, um unser Verständnis der molekularen Mechanismen der Neurodegeneration zu fördern.

Introduction

Lebenslange Neurogenese ist bekannt, in der Subventrikularzone der Seitenventrikel und der subgranulären Schicht des Gyrus dentatus des erwachsenen Gehirns von Säugetieren ¹ auftreten. Neuroprogenitor Zellen (NPCs), die aus diesen Regionen stammen, sind multipotente Zellen, die in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten ² differenzieren können. NSC haben Interesse, weil ihr Potential bei Patienten mit verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen einschließlich Parkinson-Krankheit, amyotrophe Lateralsklerose, Schlaganfall und Alzheimer-Krankheit (AD) ³ transplantiert werden erzeugt. Studien mit NPCs haben in der Regel auf dieser Tra....

Protocol

1. Erweiterung des menschlichen NPCs (Abbildung 1)

1. Revive die Tiefkühllagerung von menschlichen NPCs aus fötalen Gehirns (Lonza Walkersville, MD, USA) und Kultur sie in Suspension in T-75-Flaschen als Neurosphären (Abbildung 1A) in Neurobasalmedium enthält Proliferation Ergänzungen, EGF (10 ng / ml) und FGF (10 ng / ml).
2. Nach 3 Tagen in Kultur übertragen die Neurosphären in ein 15 ml Zentrifugenrohr und bei 500 rpm für 5 min.
3. Überstand verwerfen und hinterließ ~ 100 ul Medium über dem Zellpellet und Überführung in ein Eppendorf-Röhrchen. A 100 ul Zellpellet ist genug, um in zwei T-75-Flaschen aufgeteilt....

Results

Ausbau der NPCs (Abbildung 1)

Wenn Neurosphären werden auf einer Einzelzellsuspension durch Verreiben gebrochen, muss der Pipettenspitze, um den Boden des Röhrchens zu berühren, so dass es einen gewissen Widerstand, wenn die Suspension auf und ab pipettiert. Die Anzahl der Verreibung wird zwischen Individuen und muß durch Versuch und Irrtum durch Untersuchen der resultierenden Zellsuspension unter dem Mikroskop bestimmt werden variieren. Es ist kritisch, um eine ausreichende Di.......

Discussion

Wir beschreiben in dieser Studie ein Neuron-reichen Zellkulturmodell durch die Differenzierung von selbst erneuernden menschlichen neuroprogenitor Zellen und eine Methode, um eine reine Population von Neuronen durch Laser-Mikrodissektion isolieren. Wir haben eine Kombination von NGF, BDNF, DBC und Retinsäure für die neuronale Differenzierung von NPCs verwendet. DBC wird zur CREB, ein Transkriptionsfaktor, der Neurogenese ¹² verbessert aktivieren. Retinsäure induziert Zellzyklusaustritt und reduziert die Glia-.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neuroprogenitorzellen (NPCs)	Lonza	PT-2599
Neurocult NS-A humanes Basalmedium	Stammzelltechnologie	5750
Neurocult NS-A Proliferationsergänzung	Stammzelltechnologie	5753
Neurocult NS-A Differenzierungsergänzung	Stammzelltechnologie	5754
B-27 Ergänzung (50x)	Invitrogen	17504-044
Stammzelltechnologie	humanen epidermalen Wachstumsfaktors	2633
Fibroblasten-Wachstumsfaktor	Sigma	F0291
Vom Gehirn abgeleiteter neurotropher Faktor	Zellsignalisierung	3897S
Nervenwachstumsfaktor	Invitrogen	13257-019
Dibutyryl zyklisch AMP	Sigma	D-0627
Poly-L-Lysin	Sigma	P-5899
Maus Laminin	Sigma	L-2020
Retinsäure	Sigma	R-2625
STAT3 Antikörper	Zellsignalisierung	9132
GFAP Antikörper	Zellsignalisierung	3670
GAP43 Antikörper	Transduktionslaboratorien	612262
BDNF Antikörper	Millipore	AB1534SP
Acetyl Cholinesterase Antikörper	Santz cruz	Sc-11409
Synaptophysin Antikörper	Abcam	ab18008-50
NeuN Antikörper	Chemicon	MAB377
Synapsin Antikörper	Novus	NB300-104
Anti Maus FITC	Jackson Immuno	115-095-146
	Research Laboratories
Anti Rabbit Cy3	Jackson Immuno	711-165-152
	Research Laboratories
BSA	Sigma	A1653
Triton-X 100	Acros	21568-2500
Paraformaldehye	Fisher	4042
Deckglas (Big Circle Deckglas)	Fisherbrand	12-545-102
Eindeckmedium (Prolong Gold)	Invitrogen	P36930
Stiftmembran	Angewandte Biosysteme	LCM0521
Histogene LCM Färbekit für gefrorene Schnitte	Angewandte Biosysteme	KIT0401
RiboAmp RNA-Amplifikationskit	Angewandte Biosysteme	KIT0201
Picopure RNA Isolation Kit	Angewandte Biosysteme	KIT0202
CapsureMacro LCM-Verschlüsse	Angewandte Biosysteme	LCM0211