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Optogenetische Störung der neuronalen Aktivität mit Laser Illumination in Semi-intakt

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DOI:

10.3791/50513

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4. Juli 2013

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1Department of Complexity Science and Engineering, Graduate School of Frontier Sciences, The University of Tokyo, 2Department of Physics, Graduate School of Science, The University of Tokyo

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll für optogenetische Manipulation motoneuralen Aktivität, während die Überwachung der Motorleistung (Muskelkontraktion) in semi-intakten Drosophila Larven mittels Laser in einem herkömmlichen konfokalen Mikroskop. Diese Technik ermöglicht es Forschern, lokale Störung der neuronalen Aktivität in wenigen Neuromeren erreichen, um die Dynamik des Motors Schaltungen aufzuklären.

Zusammenfassung

Drosophila Larven Fortbewegung ist ein herrliches Modellsystem in Entwicklungs-und physiologischen Neurowissenschaften, die aufgrund der genetischen Zugänglichkeit der zugrunde liegenden neuronalen Komponenten in den Schaltungen 1-6. Anwendung der Optogenetik 7,8 im Larvenstadium neuronalen Schaltkreis ermöglicht es uns, die neuronale Aktivität in räumlich und zeitlich strukturiert Möglichkeiten 9-13 manipulieren. Typischerweise Proben im Großen und Ganzen mit einer Quecksilberlampe belichtet oder LED, so Spezifität der Zielneuronen durch binäre Genexpressionssystemen wie die Gal4-UAS-System 14,15 gesteuert. In dieser Arbeit, die räumliche Auflösung auf "sub-genetische Auflösung" zu verbessern, wir lokal beleuchtet eine Untergruppe von Neuronen im Bauchmark mit Hilfe von Lasern in einem herkömmlichen konfokalen Mikroskop durchgeführt. Während der Überwachung der Bewegung des Körpers Wand des semi-intakten Larven wir interaktive aktiviert oder gehemmt neuronale Aktivität mit Channelrhodopsin 16,17 or Halorhodopsin 18-20, beziehungsweise. Durch räumlich und zeitlich eingeschränkte Beleuchtung des Nervengewebes, können wir manipulieren die Aktivität bestimmter Nervenzellen in der Schaltung bei einer bestimmten Phase des Verhaltens. Diese Methode eignet sich für die Untersuchung der Beziehung zwischen den Tätigkeiten eines lokalen neuronalen Assembly im Bauchmark und der raumzeitlichen Muster der Motorleistung.

Einleitung

Vorwärts peristaltische Fortbewegung in Drosophila-Larven erfolgt durch die Ausbreitung der Muskelkontraktion von hinten nach vorne Segmente. Diese Bewegung wird durch sequentielle Aktivierung von Motoneuronen in Bauchmark entlang der Körperlängsachse realisiert. Um die Schaltung hinter dieser gemusterten ausbreitenden Aktivität untersuchen, könnten lokale Störung der neuronalen Aktivität einen informativen Ansatz. Obwohl pharmakologische Assay spezifischen Substanz, wie Neurotransmitter, in Nervengewebe steuern kann, kann die Wirkung von pharmakologischen Drogen unter den fast alle Segmente ähnlich, weil die Larven Bauchmark ist repetitive Struktur von ähnlichen Neuromeren entlang der Längsachse aus. Alternativ könnte man optogenetische oder temperaturempfindlichen Sondenmoleküle in eine kleine Anzahl von Segmenten auszudrücken. Jedoch sind solche spezifischen GAL4 Linien sehr schwierig zu erzeugen. Hier präsentieren wir eine Methode zur Manipulation von Neuronen in einigen Segmentengen mit Laser-Beleuchtung. Unter Ausnutzung des räumlich begrenzten Ausleuchtung in der konfokalen Mikroskopie, kann man stören die Aktivität von Neuronen in einem lokalen Bereich. In Kombination mit dem Expressionsmuster der Sonde durch Teilmengen der Neuron-spezifische GAL4 Linien, diese Laserbeleuchtungsverfahren verbessert die räumliche Auflösung bei Störung. Und weil diese Methode erfordert nur einen herkömmlichen konfokalen Mikroskop, ist der Kauf von zusätzlichen Laborgeräte in der Regel nicht erforderlich.

Mit diesem Verfahren untersuchten wir die Rolle des Motors neuronalen Aktivität während der Ausbreitung der Motorleistung 13. Durch das Blockieren der Aktivitäten von Motoneuronen in wenigen Segmenten während peristaltische Bewegung, waren wir in der Lage zu prüfen, ob die Aktivität von Motoneuronen sich für die Ausbreitung des Motors Ausgangssignal erforderlich. Lokale und vorübergehende Blockade von Motoneuronen verhaftet die Ausbreitung der Peristaltik. Nachdem die Blockade entfernt wurde, propagation erschien am Segment, wo die Welle verhaftet worden war. Dieses Phänomen legt nahe, dass ohne Motor neuronaler Aktivität, die Ausbreitungs-Welle nicht entlang der Bauchmark einer weiteren Vertiefung, und somit die Aktivierung von Motoneuronen ist für peristaltische Bewegung. Wir haben bereits detaillierte Daten und Diskussionen über dieses Phänomen in Inada et al. (2011) 13 gemeldet. Hier beschreiben wir die Methode, um neuronale Aktivität während der Überwachung interaktiv stören die Bewegung der Larven seziert. Mit verschiedenen Gal4-Linien und eine Reihe von räumlich-zeitlichen Muster für Aktivität Manipulation kann eine Logik-Schaltung durch Störung Ansprechverhalten des Motors Schaltung untersuchen.

Protokoll

1. Larven Vorbereitung

  1. Pflegen Sie fliegen Zeilen OK6-Gal4, UAS-ChR2 oder OK6-Gal4, UAS-NpHR2 in Plastikröhrchen mit Standard-fly Essen.
  2. Spread-Hefe-Paste mit all-trans-Retinal (ATR) in geeigneten Konzentrationen (1 mM für ChR2, 10 mM für NpHR2 ("NpHR" für kurz) auf einem Apfelsaft-Agar-Platte.
  3. Pick up 2. oder 3. Larvenstadium aus den Fläschchen und legte sie auf den ATR-haltigen Platte.
  4. Rear sie bei 25 ° C in der Dunkelheit für einen angemessenen Zeitraum (1 Tag für ChR2, 2 Tage NpHR.)

2. Mikroskop-Setup

  1. Bringen Sie eine CCD-Kamera (XCD-V60, Sony) zu einem herkömmlichen konfokalen Mikroskop (in unserem Fall, FV1000, Olympus) mit einem C-Mount-Befestigung (Vergrößerung 0,35 x).
  2. Wenn es einen Auslöser entlang der Lichtweg von dem Objektiv der CCD-Kamera, die während der Laser-Scanning-schließt, entfernen Sie ihn sorgfältig. Da dieser Schritt hängt von der microsbewältigen Setup, kontaktieren Sie das Mikroskop Hersteller für den technischen Support, falls erforderlich.

3. Dissection

  1. Spülen Sie die ATR-fed Larven mit Wasser, um restliche Lebensmittel aus dem Körper zu entfernen.
  2. Legen Sie die Larve auf einem Sylgard Schale mit Beschichtung, Rückenseite nach oben (die Rückenseite hat zwei Trachealtuben längs verlaufende, einer auf jeder Seite der dorsalen Mittellinie). Die Dicke der Sylgard etwa 5mm.
  3. Legen Sie ein Insekt Stift (Austerlitz Insekt Stifte, Φ0.10mm, Edelstahl) in den Schwanz zwischen den Trachealtuben mit einer Pinzette (# 5 Inox, FST von Dumont, Schweiz). Die Stifte, ca. 10mm lang, sollte gebogen oder geschnitten werden, um kurz genug sein (~ 2mm lang) zu vermeiden, schlagen und Beschädigung der Oberfläche des Objektivs. Dann legen Sie die zweite Insekt Stift in den Kopf der Larve der Nähe der Mündung Haken, schwarz Klauen-artige Struktur am vorderen Ende.
  4. In Ca 2 +-freie Kochsalzlösung (NaCl 140 mM, KCl 2 mM, MgCl 2 6 mM, HEPES-NaOH 5 mM,Saccharose 36 mM (pH 7,1)) zu halten, der Larve feucht.
  5. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Nähe der Schwanz mit Mikro-Schere (MB-50-7, Napox, Japan).
  6. Von den Einschnitt, einen Längsschnitt entlang der dorsalen Mittellinie in Richtung des Kopfes. Achten Sie darauf, das Bauchmark (VNC) und Axone schädigen.
  7. Machen Sie einen kleinen Schnitt am Kopf seitlich.
  8. Platz 4 Stifte an jeder Ecke des seziert Körperwandschicht. Die Körperwand gestreckt werden sollen genug, um eine segmentale Muster der Körperwand zu visualisieren, aber nicht zu viel peristaltische Bewegung zu behindern.
  9. Entfernen Sie die inneren Organe mit Ausnahme des Gehirns und des VNC und spülen Sie die Probe mit Ca 2 +-freien normaler Kochsalzlösung.
  10. Stellen Sie die Ausrichtung des Bauchmark sein bilateral symmetrisch, indem die Position und Orientierung der Insekten Pins auf Körper Wand. Um die Position des Bauchmark beheben, legen Sie einen Stift durch das Gewebe zwischen dem Gehirn und den Mund Haken hinunter zum Sylgard.
  11. Tauschen Sie den Puffer mit 2 mM Ca 2 + Ringer-Lösung (NaCl 130 mM, KCl 5 mM MgCl 2 2 mM CaCl 2 2 mM, HEPES-NaOH 5 mM, 36 mM Saccharose (pH 7,3)).

4. Imaging mit Laser Illumination

  1. Bringen Sie ein 4x trocken Objektiv (UPlanSApo 4x, NA 0.16, Olympus, Japan) in der konfokalen Mikroskop und stellen Sie die Larve Vorbereitung auf der Bühne.
  2. Besorgen Sie sich ein Bild von der Übertragung seziert Vorbereitung mit einem roten Laser (633nm), um das Bauchmark durch konfokale Mikroskop suchen. Aus diesem Scannen, sicher sein, nicht um einen 488nm oder 559nm Laser, der unerwünschte Stimulation ChR2 oder NpHR induziert bzw. zu verwenden.
  3. Definieren Sie die Region of Interest (ROI) auf dem Übertragungsweg Bild. Vergrößerte Modus nützlich sein könnte für detaillierte Ermittlung des ROI.
  4. Ändern Sie den Filter-Set des Mikroskops mit 488nm oder 559nm Licht beleuchten.
  5. Beleuchten Sie die Vorbereitung mit einer Halogenlampe, um den Körper Wand zu visualisieren. The Zubereitung kann mit einer CCD-Kamera, die an dem konfokalen Mikroskop beobachtet werden.
  6. Notieren Sie sich die Bewegung des Körpers Wand und schalten Sie den Laserstrahl auf und ab, während die Überwachung der Bewegung.

Ergebnisse

Lokale und transiente Aktivierung von Motoneuronen mit ChR2.

Wir drückten ChR2 in Motoneuronen. Die Axone von Motoneuronen, die aus jedem Segment VNC Projekt zu einem entsprechenden Segment des Körpers Wand. Wenn wir ein oder zwei Segmente des VNC angeregt mit einem blauen Laser zeigten Muskeln in den entsprechenden Segmenten Kontraktionen (Abbildung 1).

Lokale und vorübergehende Hemmung von Motoneuronen mit NpHR.

Wir drückten NpHR in Motoneuronen. Wenn wir ein paar (1 ~ 2) Segmente des VNC angeregt mit einem gelben Laser während der Peristaltik Muskelkontraktionen wurde die sich ausbreitende Welle an den entsprechenden Segmenten des Körpers Wand (Abbildung 2) verhaftet. Dann die Welle gestartet von den Segmenten verhaftet, wenn wir ausgeschaltet Laserbeleuchtungsverfahren 13.

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Abbildung 1. Lokale Aktivierung von Motoneuronen mit ChR2. A. Schema der lokalen Aktivierung filetiert Vorbereitung. Mit blauer Belichtung von einigen Segmenten des Bauchmark Ausdruck ChR2 in Motoneuronen, werden die Muskeln in den entsprechenden Segmenten kontrahiert (Pfeilspitze). B. Übertragung von Bildern einer seziert Larve. Lokale Beleuchtung des Bauchmark (Pfeilspitzen) induziert segmentalen Kontraktion der Muskeln Körper Wand (Pfeile).

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Abbildung 2. Lokale Hemmung von Motoneuronen mit NpHR. A. Schema der lokalen Hemmung filetiert Vorbereitung. Mit gelb-light Beleuchtung von einigen Segmenten des Bauchmark Ausdruck NpHR in Motoneuronen, Muskeln Kontraktion während spontan aufgetreten Peristaltik (Pfeilspitze in der Spitze) sind entspannt (Pfeilspitze in den Boden.) B. Übertragung von Bildern einer seziert Larve . Lokale Beleuchtung des Bauchmark (Pfeilspitzen) entspannt die spontan vergeben Körper Wandsegmenten (Pfeile).

Diskussion

Zeitliche und lokale Störung der neuronalen Aktivität ist eine unschätzbare Technik für die Analyse der Netzwerk-Dynamik von neuronalen Schaltkreisen. In diesem Protokoll, präsentieren wir eine Methode, um neuronale Aktivität durch Optogenetik mit einem Laser zu manipulieren. Die Laser der hohen Richtwirkung ermöglicht mehr lokalisierte optogenetische Stimulation als weites Feld Stimulation mit Quecksilber oder Xenon-Lampe. Obwohl Laser Beleuchtung bereits auf optogenetics in früheren Studien angewendet werden spezielle Einrichtungen, wie Glasfaser, Mikromanipulator und Laserquelle in den meisten früheren Studien erforderlich. In diesem Protokoll, verwenden wir eine herkömmliche konfokale Mikroskopie für lokale Beleuchtung. Da der konfokalen Mikroskop-System weit verbreitet ist, wird diese Methode öffnen Sie die Möglichkeit, höhere Auflösung Optogenetik in vielen Labors gelten.

Das Protokoll hat zwei kritische Punkte: Larven Dissektion und Laserleistung. Erstens, wenn das Gehirn, das Bauchmark oder ein Motor Nerv beschädigt During Dissektion, werden die Larven weniger aufweisen oder keine spontane Peristaltik. Präzision ist es wichtig, insbesondere, wenn ein Einschnitt auf der Rückenseite mit Feder Schere und Entfernen von inneren Organen mit einer Pinzette. Details zu den Dissektion wurden bereits 21 gemeldet. Zweitens ist, wenn eine ausreichende Stimulation erreicht werden soll, eine Laserleistung von etwa 0,1 bis 1 mW / mm 2 für ChR2 oder 1 ~ 10 mW / mm 2 für NpHR erforderlich. Wir untersuchten die Laserleistung gesamten Lichtleistung unterhalb einer Objektivlinse um geschätzte Beleuchtungsfläche unterteilt. Wir messen die gesamte Lichtleistung mit einem Leistungsmesser (mobiken, Sanwa MI Technos, Japan). Wir schätzten die Beleuchtungsfläche als kreisförmige Konstanten mal dem Quadrat der Wellenlänge des Lasers, die in etwa gibt Ausleuchtung in Beugungsgrenze. Effektive Beleuchtung Macht auf die Probe kann nicht nur von der Leistung des Lasers Ausgang eingestellt werden, sondern auch durch die Änderung der Scangeschwindigkeit und tauber von Wiederholungen. Wir gescannt Laser mit 20-100 us / Pixel für 63 mal. Darüber hinaus sind die Expression von optogenetics Proteins und der Menge des ATR auch kritisch für die Stimulation Effizienz. Dementsprechend wird, wenn Larven zeigten keine Reaktion optogenetische, sollten die folgenden Punkte überprüft und korrigiert werden: 1) Laserleistung (durch Optimierung Mikroskop-System), 2) Expression von Optogenetik Protein (indem Genotyp und Aufzucht Temperatur) und 3) Menge ATR (durch Einstellen Konzentration von ATR und Fütterung Zeitraum). NpHR erfordert höhere Konzentration von ATR als ChR2 tut von unbekannten Gründen 13. ChR2 funktioniert gut in Larven in Lebensmitteln mit geringerer ATR (zB 0,1 mm), als hier (1 mM) gezüchtet. Wie füttern Larven bis 1 mM ATR ist ausreichend für die Herstellung ChR2 photo-reaktiven, empfehlen wir diese Konzentration für den ersten Versuch in ChR2 Experimente. Die Konzentration der ATR kann anschließend unten von 1 mM titriert werden. Was Expositionsdauer für ATR, empfehlen wirdie Dauer hier beschriebene robuste optogenetische Kontrolle. Wir haben oft versäumt, optogenetische Antwort zu beobachten bei der Fütterung Larven ATR für kürzere Dauer.

In diesem Protokoll werden Laserbeleuchtung und Bildaufnahme von einem separaten Rechner betrieben. Also, das ist eine leichte Erkennung von raum-zeitlichen Muster der Laser-Beleuchtung durch CCD-Kamera für die kritische Analyse der Daten. Wenn Laserpunkt oder Linie ist dim auf CCD-Bild, sollten Sie optimieren die Leistung der Halogenlampe und der Gain-Wert der CCD-Kamera, die Laserbeleuchtung visualisieren, während Körper Wand sichtbar.

Spatiotemporal Beleuchtung in diesem Protokoll gezeigt informiert über Larven Motorkreise, jedoch hat das Verfahren einige Einschränkungen. Wie der "räumlichen" Aspekt, Standort der Beleuchtung wird durch eine geringe Vergrößerung CCD Bild für Videoaufnahmen Körper Wand Bewegungen verwendet aufgezeichnet. Dementsprechend kann Beleuchtungsbereich auf Segmentebene zugeordnet werden, aber nicht auf zellulärer Ebene. Was den "temporal "Aspekt Zeitspanne zwischen dem Einschalten der Laser-Scan durch konfokale Mikroskop und Beleuchtung durch Laser hängt von dem konfokalen Mikroskop und Scannen Zustand. Folglich wurden Tests durch Versuch und Irrtum erforderlich ist, um eine Beleuchtung Timing einzustellen. Da der Zeitpunkt der Beleuchtung kann in CCD-Filme mit entsprechender Software wie ImageJ bestimmt werden kann, ist der kritische Faktor in zeitlicher Auflösung Bildrate von CCD-Kamera Bildgebung. typischerweise Wir setzen die Bildrate für 7,5-15 Frames pro Sekunde.

Advances in optogenetische Tools bieten uns die Chance, dieses Protokoll zu ändern. Wir verwendeten 3. Larvenstadium besitzen OK6-Gal4 und UAS-ChR2 [H134R] oder UAS-NpHR2. Andere optogenetische Werkzeuge statt ChR2 [H134R] oder NpHR2 wie ChR2 [T159C/E123T] NpHR3 oder Arch kann die Effizienz der Tätigkeit Steuerung 22 zu steigern. Darüber hinaus können mit anderen gal4 Linien oder Analyse in anderen Entwicklungsstadien mehr Informationen über den Motor circuits.

In diesem Protokoll wurde die motorische Aktivität durch Übermittlung Bilder der Körperwand Kontraktion mit einer CCD Kamera überwacht. Die Aktivität von Motoneuronen mit Calcium-sensitiven Fluoreszenz-Moleküle (zB GCaMP) kann auch direkt überwacht werden, während die Manipulation neuronale Aktivität mit ChR2 oder NpHR. In diesem Fall werden blaue Beleuchtung in einem weiten Bereich und eine hochempfindliche CCD-Kamera (zB EMCCD Kamera) anstelle einer Halogenlampe und der normalen CCD-Kamera zuvor beschrieben. Um räumliche Auflösung von Stimulation zu verbessern und gleichzeitig die Überwachung Körperwandschicht Bewegung, mit einem zusätzlichen Objektiv eine erweiterte Methode sein kann: Beleuchtung des Bauchmark durch eine hohe Vergrößerung Objektiv (zB 40x) von oben auf die Probe und Überwachung Körperwandschicht durch niedrige Vergrößerungslinsenposition (zB 4x) unterhalb der Probe. Dieses Dual Lens System ermöglicht es uns, Nervensystem in höhere räumliche Auflösung zu stimulieren.

Das Protokoll abgebildet anderen neuronalen Schaltkreise aufgebracht werden kann, vorgesehen optogenetische Werkzeuge im Nervensystem exprimiert und Herstellung in dem ausreichend Licht in das neuronale Gewebe abgegeben werden kann, kann hergestellt werden.

Offenlegungen

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch ein Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Bereiche unterstützt "Mesoskopische neurocircuitry" (Nr. 22115002) und "Comprehensive Brain Science Network" (Nr. 221S0003) des Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft, and Technology, Japan, um AN und Grant-in-Aid for Young Scientists (B) (Nr. 21700344) des Japan-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften (JSPS) zu HK

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BX61WI MikroskopOlympus CorporationBX61WI
Fluoview FV1000 konfokales SystemOlympus CorporationFV1000
CCD-KameraSonyXCD-V60
all-trans retinalSigmaR2500-500MG200 mM Aktien in 95% EtOH
Silpot184Dow Corning Toray3255981

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