Durchflusszytometrieanalyse bimolekularer Fluorescence Komplementierung: A High Throughput Quantitative Methode zur Protein-Protein Interaction Study

Summary

Durchflusszytometrieanalyse bimolekularer Fluoreszenz Komplementation bietet einen hohen Durchsatz quantitative Methode zur Protein-Protein-Wechselwirkung zu untersuchen. Diese Methode kann zur Zuordnung Proteinbindungsstellen und zum Screening von Faktoren, die Protein-Protein-Interaktion reguliert angewendet werden.

Abstract

Unter den Verfahren zur Protein-Protein-Wechselwirkungen in Zellen zu studieren, ist Bimolekulare Fluoreszenz Komplementation (BiFC) relativ einfach und empfindlich. BiFC ist auf die Erzeugung von Fluoreszenz mit zwei nicht-fluoreszierenden Fragmente eines fluoreszierenden Proteins (Venus, gelb fluoreszierendes Protein Variante wird hier verwendet werden). Nicht fluoreszierende Venus Fragmente (VN und VC) mit zwei interagierende Proteine ​​(in diesem Fall AKAP-Lbc und PDE4D3) fusioniert, wodurch Fluoreszenz aufgrund VN-AKAP-LBC-VC-PDE4D3 Interaktion und der Bildung eines funktionellen fluoreszierendes Protein innerhalb der Zellen.

BiFC liefert Informationen über die subzelluläre Lokalisation von Proteinkomplexen und der Stärke der Protein-Wechselwirkungen auf Fluoreszenzintensität. Allerdings ist BiFC Analyse unter Verwendung der Mikroskopie, die Stärke der Protein-Protein-Interaktion zu quantifizieren zeitaufwendig und etwas subjektiv durch Heterogenität in der Proteinexpression und Interaktion. Durch die Kopplung durchflusszytometrischenAnalyse BiFC Methodik kann die fluoreszierende BiFC Protein-Protein-Wechselwirkung Signal genau für eine große Anzahl von Zellen in einer kurzen Zeit gemessen werden. Hier zeigen wir eine Anwendung dieser Methode auf Regionen in PDE4D3, die für die Interaktion mit AKAP-Lbc erforderlich sind, abzubilden. Dieser hohe Durchsatz-Screening Methode können Faktoren, die Protein-Protein-Interaktion reguliert angewendet werden.

Introduction

650.000 Protein-Protein-Wechselwirkungen werden geschätzt, um in den menschlichen interactome existieren, spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der normalen Zellfunktionen ^1,2. Neben Co-Immunopräzipitation (Co-IP), der Goldstandard Protein-Protein-Interaktion von Zelllysat studieren, mehrere Proteinfragments Komplementierungsassays (PCA) wurden entwickelt, um die Empfindlichkeit bei der Erkennung von Protein-Protein-Interaktion innerhalb der Zellen ³ verbessern. Techniken umfassen Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET), Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (BRET) und Fluoreszenz-Komplementation Bimolekulare (BiFC)

Protocol

1. Zelltransfektion

1. Teller Zellen am Tag vor der Transfektion Plattieren weniger Zellen für Immunfluoreszenz.
   1. Für Immunfluoreszenz: in einer 6-Well-Platte, Mantel Glasdeckgläschen (1 pro Well) mit 0,02% Gelatine bei 37 ° C für mindestens 4 Stunden, einmal abwaschen mit Medium und für jeden gut, Platte 1 x 10 ⁵ HEK 293T Zellen in 2 ml komplettem Wachstumsmedium [Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% FBS].
   2. Für Durchflusszytometrie und Western-Blot-Analysen: Platte 1,2 x 10 ⁵ HEK 293T Zellen / Vertiefung in 2 ml komplettem Wachstumsmedium in 6-Well-Platte (0,3 x 10 ⁵ HEK 293T-Zellen in 0,5 ml ko....

Results

AKAP-Lbc und PDE4D3 Konstrukte (1B) zu VN und VC Fragmente fusioniert sind. Wechselwirkung von AKAP-Lbc und PDE4D3 führt zu Funktionsstörungen YFP-Fluoreszenz (Abb. 1A). Hier verwenden wir die BiFC Verfahren zur Karte AKAP-LBC-Bindungsstellen in PDE4D3. Stromaufwärts konservierten Region 1 (UCR1) stromaufwärts konservierten Region 2 (UCR2) und katalytischen Bereich (CAT) werden unter PDE4-Proteine ​​konserviert daher Länge (FL), UCR1 und UCR2 plus Katzen Zum Screening wurden die Bindung.......

Discussion

BiFC ist eine einfache und sensitive Methode zur Protein-Protein-Wechselwirkung zu untersuchen. Diese Methode kann verwendet werden, um neue Protein-Protein-Interaktionen zu identifizieren, ist es jedoch besonders günstig, um Protein-Protein-Wechselwirkung innerhalb der Zellen zu bestätigen und funktionellen Eigenschaften zu untersuchen, wie subzelluläre Lokalisation von Proteinkomplexen, die Kartierung von Protein-Protein-Wechselwirkung Sites und für das Screening von kleinen Molekülen / Peptide, die Modulation von Pro.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENZIEN
Dulbecco’ s modifizierter Eagle’ s media (DMEM)	Invitrogen	11965-092
Penicilin-Streptomycin (Pen/Streptogramm), 100x	Invitrogen	15070-063
Fetales Rinderserum (FBS)	Invitrogen	16000-044
Anti-Flag Antikörper	Sigma	M2, F1804
Anti-HA Antikörper	Covance	16B12, MMS-101R
α-Tubulin	Sigma	DM1A, T9026
Anti-GFP-Antikörper	Clontech	632569
Zellkulturplatten, mit 6-Well-Gewebekulturen behandelt	Thermo Fisher Scientific	130184
HEK 293T-Zellen	ATCC	CRL-11268
Maxiprep Plasmid-Aufreinigungskit, Hochgeschwindigkeit	Qiagen	12663
Dulbecco’ s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS), steril 1x	Invitrogen	14190-144
Trypsin-EDTA, 0,05% (w/v)	Gibco	25300
Polystyrol-Rundbodenröhrchen für FACS-Färbung	BD Biosciences	352052
Paraformaldehyd	Fisher Scientific	S74337MF
Prolong Gold Antifading-Reagenz mit DAPI	Invitrogen	P-36931
Superfrost plus Objektträger	Fisher Scientific	12-550-15
Fisherfinest Premium-Deckglas	Fisher Scientific	12-548-5P
EQUIPMENT
CO2 luftummantelt Inkubator	NuAIR DH autoflow
Konfokales Mikroskop LSM510 META	Carl Zeiss, Inc
Elektrophorese- und Transfereinheit	Biorad
Cyan ADP Durchflusszytometer	Beckman Coulter