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Methodenartikel

Durchflusszytometrieanalyse bimolekularer Fluorescence Komplementierung: A High Throughput Quantitative Methode zur Protein-Protein Interaction Study

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DOI:

10.3791/50529

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15. August 2013

 , 
1Department of Pharmacology, University of Illinois at Chicago

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Durchflusszytometrieanalyse bimolekularer Fluoreszenz Komplementation bietet einen hohen Durchsatz quantitative Methode zur Protein-Protein-Wechselwirkung zu untersuchen. Diese Methode kann zur Zuordnung Proteinbindungsstellen und zum Screening von Faktoren, die Protein-Protein-Interaktion reguliert angewendet werden.

Zusammenfassung

Unter den Verfahren zur Protein-Protein-Wechselwirkungen in Zellen zu studieren, ist Bimolekulare Fluoreszenz Komplementation (BiFC) relativ einfach und empfindlich. BiFC ist auf die Erzeugung von Fluoreszenz mit zwei nicht-fluoreszierenden Fragmente eines fluoreszierenden Proteins (Venus, gelb fluoreszierendes Protein Variante wird hier verwendet werden). Nicht fluoreszierende Venus Fragmente (VN und VC) mit zwei interagierende Proteine ​​(in diesem Fall AKAP-Lbc und PDE4D3) fusioniert, wodurch Fluoreszenz aufgrund VN-AKAP-LBC-VC-PDE4D3 Interaktion und der Bildung eines funktionellen fluoreszierendes Protein innerhalb der Zellen.

BiFC liefert Informationen über die subzelluläre Lokalisation von Proteinkomplexen und der Stärke der Protein-Wechselwirkungen auf Fluoreszenzintensität. Allerdings ist BiFC Analyse unter Verwendung der Mikroskopie, die Stärke der Protein-Protein-Interaktion zu quantifizieren zeitaufwendig und etwas subjektiv durch Heterogenität in der Proteinexpression und Interaktion. Durch die Kopplung durchflusszytometrischenAnalyse BiFC Methodik kann die fluoreszierende BiFC Protein-Protein-Wechselwirkung Signal genau für eine große Anzahl von Zellen in einer kurzen Zeit gemessen werden. Hier zeigen wir eine Anwendung dieser Methode auf Regionen in PDE4D3, die für die Interaktion mit AKAP-Lbc erforderlich sind, abzubilden. Dieser hohe Durchsatz-Screening Methode können Faktoren, die Protein-Protein-Interaktion reguliert angewendet werden.

Einleitung

650.000 Protein-Protein-Wechselwirkungen werden geschätzt, um in den menschlichen interactome existieren, spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der normalen Zellfunktionen 1,2. Neben Co-Immunopräzipitation (Co-IP), der Goldstandard Protein-Protein-Interaktion von Zelllysat studieren, mehrere Proteinfragments Komplementierungsassays (PCA) wurden entwickelt, um die Empfindlichkeit bei der Erkennung von Protein-Protein-Interaktion innerhalb der Zellen 3 verbessern. Techniken umfassen Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET), Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (BRET) und Fluoreszenz-Komplementation Bimolekulare (BiFC) 4,5. , Die jeweils zu einem potenziellen Partner interagierende Protein (in diesem Beispiel verwenden wir AKAP-Lbc und PDE4D3) verschmolzen sind; BiFC auf dem erleichtert Assoziation von zwei Fragmente eines fluoreszierenden Proteins (YFP eine Variante hier benutzen wir Venus) basiert. Wechselwirkung der beiden Proteine ​​von Interesse in den Zellen führt zu Funktionsstörungen Fluoreszenz, die sichtbar gemacht werden kann fluorescence Mikroskopie mit entweder live oder fixierten Zellen 6,7,8. Im Vergleich zu anderen PKA ist BiFC empfindlicher und weniger technisch anspruchsvoll, mit Potenzial, die zelluläre Lokalisation in lebenden Zellen zu studieren. Ein wesentlicher Nachteil dieses Verfahrens ist jedoch, daß einmal gebildet, das fluoreszierende Protein-Komplex kann nicht rückgängig gemacht werden. Daher ist es nicht eine gute Methode, um dynamische Protein-Protein-Wechselwirkung zu untersuchen. In diesem Papier, verwenden wir, um die Interaktion BiFC Websites von PDE4D3 mit AKAP-Lbc Karte durch die Überwachung der Fluoreszenz-Intensitäten der Venus. Im Vergleich zu herkömmlichen Analyse mittels Fluoreszenzmikroskopie, die zeitaufwendig und arbeitsintensiv (falls nicht mit automatisierten Hochdurchsatz-Maschinen durchgeführt) ist, bietet die Durchflusszytometrie eine einfache quantitative Analyse von Tausenden von Zellen in einer heterogenen Population über eine kurze Zeit 9, 10. Hier wird durch die Durchführung einer Side-by-Side-Vergleich der Durchflusszytometrie-Analyse und BiFC traditionellen Ko-IP, zeigen wir, dass die beiden methoden vergleichbare Daten ist jedoch durchflusszytometrische Analyse BiFC weniger zeitaufwendig und benötigt weniger Material, das nützlicher sein kann, wenn die Zellen von Interesse sind begrenzt.

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Protokoll

1. Zelltransfektion

  1. Teller Zellen am Tag vor der Transfektion Plattieren weniger Zellen für Immunfluoreszenz.
    1. Für Immunfluoreszenz: in einer 6-Well-Platte, Mantel Glasdeckgläschen (1 pro Well) mit 0,02% Gelatine bei 37 ° C für mindestens 4 Stunden, einmal abwaschen mit Medium und für jeden gut, Platte 1 x 10 5 HEK 293T Zellen in 2 ml komplettem Wachstumsmedium [Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% FBS].
    2. Für Durchflusszytometrie und Western-Blot-Analysen: Platte 1,2 x 10 5 HEK 293T Zellen / Vertiefung in 2 ml komplettem Wachstumsmedium in 6-Well-Platte (0,3 x 10 5 HEK 293T-Zellen in 0,5 ml komplettem Wachstumsmedium pro Vertiefung in 24-Well-Platte ).
  2. Bereiten DNA für die Transfektion gemäß Herstellerangaben Protokoll: Effectene (Qiagen) zur Immunfluoreszenz eingesetzt. TRANSIT-LT1 (Mirus) ist für durchflusszytometrische und Western-Blot-Analysen verwendet. Anzahl der DNA verwendet wird unten aufgeführt.
    24-Well-Platte (ng) 6-Well-Platte (ng)
    CFP-Vektor 10 50
    VN N-AKAP-Lbc 200 1000
    VC N-PDE4D3-FL (full-length PDE4D3) 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 100
    VC-N PDE4D3-UCR1 (a PDE4D3 N-terminale Fragment mit dem UCR1 Domain) 100
    VC-N PDE4D3-UCR2 + CAT (a PDE4D3 C-terminalen Fragments mit den UCR2 und katalytischen Domänen) 100
    Transfektion unter Verwendung Effectene (6-well):
    1. In angegebene Menge von Plasmid-DNA + 4 ul Enhancer zu 100 ul Puffer EC, Mischung und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur.
    2. In 5 ul Effectene, Mischung und Inkubation für 10 min beiRaumtemperatur. In den Zellen tropfenweise.
    Transfektion mit Transit-LT1 (6-well/24-well):
    1. In angegebene Menge an Plasmid-DNA zu 250 ul μl/50 Opti-MEM I serumfreiem Medium in ein steriles Röhrchen.
    2. In TRANSIT-LT1 Reagenz zu der verdünnten DNA-Gemisch und Pipette vorsichtig mischen. (Transit-LT1 Reagenz: DNA-Verhältnis ist 3 ul TransIT-LT1 Reagenz pro 1 ug DNA).
    3. Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur und fügen Sie tropfenweise zu den Zellen.

2. Handy Vorbereitung für die Durchflusszytometrie, Western Blot und Immunfluoreszenz

  1. 24 Stunden nach der Transfektion überprüfen Fluoreszenz unter Epifluoreszenzmikroskop Zellen vor der Ernte.
  2. Zellpräparat zur durchflusszytometrische Analyse:
    1. Waschen der Zellen mit 0,5 ml / 2 ml eiskaltem PBS 24-well/6-well Platten.
    2. Trennen Zellen mit 50 μl/250 ul 0,05% Trypsin.
    3. Neutralisieren Trypsin mit 200 ul / 1 ml DMEM-Medium.
    4. Collect 250 ul Zellen (sowohl für 24-Well-und 6-Well-Platte) durch Zentrifugation bei 500 xg für 5 min, verwenden Sie die restlichen Zellen (1 ml) für Western-Blot-Analyse.
    5. Die Zellen in 250 ul FACS-Puffer [PBS + 0,5% (w / v) BSA + 2 mM EDTA], auf Eis lagern für durchflusszytometrische Analyse. Die Zellen können auch in 1% Paraformaldehyd fixiert werden (in PBS), wenn Durchflusszytometrie nicht sein wird sofort.
  3. Handy Vorbereitung für Western-Blot-Analyse: parallel durchgeführten mit Zellpräparat zur Durchflusszytometrie.
    1. Waschen der Zellen 1x mit 2 ml eiskaltem PBS lysiert Zellen durch Zugabe von 100 ul Lysepuffer [10 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 6,95, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1% Triton X-100] .
    2. Sammeln Zelllysat durch Zentrifugation für 10 min bei 21.000 × g bei 4 ° C.
    3. Quantifizierung Protein-Konzentration von Bradford-Protein-Assay, laden Sie gleiche Mengen von Protein pro Spur für SDS-PAGE und Transfer auf Nitrozellulose für Immunoblot.
  4. Zellpräparat zur Immunfluoreszenz.
    1. Spülen Zellen 3x mit 2 ml PBS, fixieren Zellen in 1 ml 3,7% Paraformaldehyd (in PBS) für 10 min bei Raumtemperatur, dann waschen mit 2 ml PBS 3x für 5 min.
    2. Montieren Deckglas auf einem Objektträger aus Glas, mit Montage Medium. Deckglasränder Kanten mit Nagellack, wenn nötig.
    3. Bewahren Sie die Objektträger bei 4 ° C vor der Prüfung.

3. Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenz-Mikroskopie

  1. Durchflusszytometrie unter Verwendung eines Beckman Coulter Cyan ADP mit 488 nm ausgestattet, 405 nm und 642 nm Festkörperlaser. Summit Software zur Erfassung und Analyse verwendet.
    1. Kalibrieren Durchflusszytometer unter Verwendung von Standard-Perlen.
    2. Grundstück Vorwärtsstreuung (FSC) / Seitwärts Streulicht (SSC) auf einer linearen Skala für Gating Live-Zell-Population.
    3. Plot FSC / Spannungsimpulsbreite für Gating nicht aggregierten Live-Zell-Population.
    4. Grundstück count/FL6 (CFP fluorescence, 405 nm) auf einer logarithmischen Skala für Gating nicht aggregierten Live-GFP-positiven Zellen.
    5. Grundstück count/FL1 (YFP Fluoreszenz, 488 nm) auf einer logarithmischen Skala für BiFC Intensität.
    6. Führen YFP-CFP-double negative Proben, stellen FSC, SSC, FL1 und FL6 Photomultiplier (PMT) Spannung, um die Schwelle für jedes Signal gesetzt.
    7. Führen einzigen positiven (beide YFP und CFP + +) Proben für zukünftige off-line Entschädigung
    8. Erwerben Sie mindestens 10.000 gated Veranstaltungen (nicht aggregierten Live GFP +-Zellen) für die Analyse.
  2. Immunfluoreszenzmikroskopie wird unter Verwendung eines Zeiss LSM 510 konfokalen Mikroskop. Hinweis: es ist wichtig, um alle Einstellungen (wie die Zoom, Lochkamera, Detektor Gain Verstärker-Offset, Baugröße, Scan-Geschwindigkeit, Scan-Durchschnitt, und Laserleistung) konsistent zu halten Proben für angemessenen Vergleich aller Daten.

4. Data Analysis (durchgeführt mit Summit Software)

  1. Richten Sie die Analyse-Protokoll ähnlich wie bei acquisition mit der richtigen Gating:
    Gate 1 in FSC / SSC Dot-Plot für lebende Zellen.
    Gate 2 in FSC / Pulsbreite von Gate 1 für nicht aggregierte lebenden Zellen.
    Gate 3 in count / CFP von Gate 3 für nicht-aggregierten GFP + lebenden Zellen.
  2. Kompensieren YFP und CFP-Signal mit YFP und CFP + + einzigen positiven Zellen.
  3. Neu zu bestimmen Cut-off-Linien für CFP / YFP-positiven Zellen.
  4. Export YFP mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) von GFP + Zellen in Excel für Daten-Plotten.
  5. Normalisieren YFP MFI zu Expression von AKAP-Lbc, PDE4D3 und Ladekontrolle α-Tubulin, wie durch Western Blot bestimmt.

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Ergebnisse

AKAP-Lbc und PDE4D3 Konstrukte (1B) zu VN und VC Fragmente fusioniert sind. Wechselwirkung von AKAP-Lbc und PDE4D3 führt zu Funktionsstörungen YFP-Fluoreszenz (Abb. 1A). Hier verwenden wir die BiFC Verfahren zur Karte AKAP-LBC-Bindungsstellen in PDE4D3. Stromaufwärts konservierten Region 1 (UCR1) stromaufwärts konservierten Region 2 (UCR2) und katalytischen Bereich (CAT) werden unter PDE4-Proteine ​​konserviert daher Länge (FL), UCR1 und UCR2 plus Katzen Zum Screening wurden die Bindung...

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Diskussion

BiFC ist eine einfache und sensitive Methode zur Protein-Protein-Wechselwirkung zu untersuchen. Diese Methode kann verwendet werden, um neue Protein-Protein-Interaktionen zu identifizieren, ist es jedoch besonders günstig, um Protein-Protein-Wechselwirkung innerhalb der Zellen zu bestätigen und funktionellen Eigenschaften zu untersuchen, wie subzelluläre Lokalisation von Proteinkomplexen, die Kartierung von Protein-Protein-Wechselwirkung Sites und für das Screening von kleinen Molekülen / Peptide, die Modulation von Pro...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Wir danken der O'Bryan Labor an UIC für kritische experimentelle Evaluation und Diskussion. UIC Zentrum für Klinische und Translational Sciences Zuschuss UL1TR000050 - Diese Arbeit wurde von der American Heart Association Zuschuss 11SDG5230003 zu GKC und National Center for Advancing Translationale Wissenschaft unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
REAGENZIEN
Dulbecco’ s modifizierter Eagle’ s media (DMEM)Invitrogen11965-092
Penicilin-Streptomycin (Pen/Streptogramm), 100xInvitrogen15070-063
Fetales Rinderserum (FBS)Invitrogen16000-044
Anti-Flag AntikörperSigmaM2, F1804
Anti-HA AntikörperCovance16B12, MMS-101R
α-TubulinSigmaDM1A, T9026
Anti-GFP-AntikörperClontech632569
Zellkulturplatten, mit 6-Well-Gewebekulturen behandeltThermo Fisher Scientific130184
HEK 293T-ZellenATCCCRL-11268
Maxiprep Plasmid-Aufreinigungskit, HochgeschwindigkeitQiagen12663
Dulbecco’ s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS), steril 1xInvitrogen14190-144
Trypsin-EDTA, 0,05% (w/v)Gibco25300
Polystyrol-Rundbodenröhrchen für FACS-FärbungBD Biosciences352052
ParaformaldehydFisher ScientificS74337MF
Prolong Gold Antifading-Reagenz mit DAPIInvitrogenP-36931
Superfrost plus ObjektträgerFisher Scientific12-550-15
Fisherfinest Premium-DeckglasFisher Scientific12-548-5P
EQUIPMENT
CO2 luftummantelt InkubatorNuAIR DH autoflow
Konfokales Mikroskop LSM510 METACarl Zeiss, Inc
Elektrophorese- und TransfereinheitBiorad
Cyan ADP DurchflusszytometerBeckman Coulter

Referenzen

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  10. Koshy, S., Alizadeh, P., Timchenko, L. T., Beeton, C. Quantitative measurement of GLUT4 translocation to the plasma membrane by flow cytometry. J. Vis. Exp. (45), e2429(2010).
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