Mess-Wachstum und Genexpression von Tumor-Dynamics Targeted S. Typhimurium Bakterien

Zusammenfassung

Das Ziel dieser Versuche ist es, quantitative zeitliche Verlauf Daten über das Wachstum und die Genexpression Dynamik abgeschwächt erzeugen S. typhimurium Wachsenden Bakterienkolonien in den Tumoren. In diesem Video werden Tumorzelle Vorbereitung und Implantation Bakterien Vorbereitung und Injektion, Ganzkörper-Tier Lumineszenz Imaging, Tumorentfernung und bakterielle Koloniezahlbestimmung.

Zusammenfassung

Das Ziel dieser Versuche ist es, quantitative zeitliche Verlauf Daten über das Wachstum und die Genexpression Dynamik abgeschwächt S. generieren typhimurium wachsenden Bakterienkolonien in den Tumoren.

Wir generierte Modell Xenograft Tumoren in Mäusen durch subkutane Injektion eines menschlichen Ovarialkarzinom-Zelllinie, OVCAR-8 (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD).

Wir verwandelt abgeschwächte Stämme von S. typhimurium Bakterien (ELH430: SL1344 ^phoPQ-1) mit einem konstitutiv exprimierten Luciferase (luxCDABE) Plasmid zur Visualisierung ^2. Diese Stämme besiedeln speziell Tumoren während verbleibenden wesentlichen nicht-virulenten der Maus ^1.

Sobald messbare Tumore wurden hergestellt wurden Bakterien intravenös über die Schwanzvene mit unterschiedlicher Dosierung injiziert. Tumor-lokalisiert wurde bakterielle Genexpression in Echtzeit im Laufe von 60 Stunden unter Verwendung eines überwachtenin vivo Imaging System (IVIS). Zu jedem Zeitpunkt wurden Tumore herausgeschnitten, homogenisiert und ausplattiert, um Bakterienkolonien Korrelation mit Genexpressionsdaten quantifizieren.

Zusammen ergibt sich daraus Daten ein quantitatives Maß für die in vivo-Wachstum und die Genexpression Dynamik der wachsenden Bakterien in den Tumoren.

Einleitung

Synthetische Biologie hat sich in den letzten zehn Jahren Fortschritte gemacht und ist nun positioniert, um wichtige Probleme in den Bereichen Energie und Gesundheit auswirken. Allerdings hat die Expansion in den klinischen Bereich von Sicherheitsbedenken und einer Abwesenheit von der Entwicklung Design-Kriterien für in vivo genetische Schaltkreise verlangsamt worden. Beschleunigung hohe Schlagzähigkeit medizinische Anwendungen erfordern Methoden verwenden, die eine direkte Schnittstelle mit medizinischen Einrichtung Genetische Schaltkreise, die außerhalb des gesteuerten Testumgebung funktionieren, zu regeln und klinisch akzeptierten mikrobiellen Wirten.

Eine Reihe von Stämmen sind zur Krebstherapie aufgrund ihrer Fähigkeit, vorzugsweise wachsen in Tumoren untersucht. Diese haben C enthalten novyi, E. coli, V. cholorae, B. longum, und S. typhimurium ^3-8. S. typhimurium ist besonderem Interesse erzeugt, wie sie Sicherheit und Verträglichkeit in einer Reihe von klinischen Studien am Menschen haben gezeigt ^9-12. Diese bacteri A wurden gezeigt, Anti-Tumor-Wirkung durch Stimulation des Immunsystems des Wirts und von Nährstoffmangel für Krebs Zellstoffwechsel erforderlich erstellen. Produktion von therapeutischen Ladung wurde später durch genetische Modifikationen aufgenommen. Während diese Studien wichtige Fortschritte bei der Verwendung von Bakterien für die Tumor-Therapien dar, die Mehrheit der bestehenden Bemühungen auf hoher Ebene Ausdruck, führt in der Regel die Lieferung von hohen Dosierungen, Off-Target-Effekte, und die Entwicklung von Host-Widerstand ^13-16 berufen .

Jetzt können synthetische Biologie programmierbare Ladung Produktion durch den Einsatz rechnerisch ausgelegt genetischer Schaltkreise, die erweiterte Erfassung und Lieferung ^17-20 durchführen hinzufügen können. Diese Schaltungen können entworfen, um als Delivery-Systeme, die Tumor-spezifische Stimuli und selbst regulieren Fracht Produktion notwendigen Sinn zu handeln. Allerdings hat die Untersuchung der Funktion dieser Schaltungen in vivo bisher schwierig gewesen.

ve_content "> Da Plasmide der gemeinsame Rahmen für synthetische Schaltungen sind, beschreiben wir eine Methode, um die Dynamik von Plasmid-basierte Genexpression in vivo mit einem Maus-Modell zu charakterisieren. Diese Methoden nutzen Zeitraffer Lumineszenz Bildgebung und quantitative Messung der Biodistribution. Gemeinsam Diese Ansätze bieten einen Rahmen für die Untersuchung Plasmid-basierte Netze in vivo für klinische Anwendungen.

Protokoll

1. Zellpräparation

1. Passage Zelllinien unter Verwendung von Standard-Zellkultur-Techniken. In diesem Experiment verwendeten wir OVCAR-8-Zellen (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD). Wachsen Zellen zu einem Ziel Konfluenz von 80 - 100%.
2. Inkubieren Zellen mit 5 ml Trypsin für 5 min, dann 5 ml RPMI-Medium + FBS Trypsin zu inaktivieren.
3. Ernte und Anzahl Zellen auf einer Zählkammer. Resuspendieren in Phenolrot-freiem DMEM auf ein Ziel Konzentration von 5 x 10 ⁷ Zellen / ml oder etwa 200 ul pro Kolben.
4. In 15% reduzierten Wachstumsfaktor Matrigel (BD Biosciences) und halten Sie die Zellsuspension auf Eis bis zur Implantation.

2. Tumorimplantation

1. Anesthetize 4 Wochen alten weiblichen Ncr / Nu-Mäusen unter Verwendung von 3% Isofluran und warten etwa 5 min zu tiefe Narkose zu gewährleisten. Verwenden Tierarzt Salbe auf die Augen zu Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
2. Legen Sie die Zellen (100 ul pro Tumor) in einer 1 ml Spritze eine 27 1/ 2-Gauge-Nadel.
3. Für jede der beiden bilateralen hinteren Flanke Injektionsstellen, heben Sie die Haut vorsichtig mit einer Pinzette, um ein Zelt zu machen und injizieren Zellen an der Basis. Achten Sie darauf, nicht zu durchdringen zu tief, wodurch Blut. Mit einer Pinzette vorsichtig entfernen Spritze ohne Spritzer.
4. Überwachen Tumorwachstum täglich für 10 - 20 Tage, bis ein Tumor Durchmesser von 2 - 4 mm erreicht ist.

3. Bakterien Vorbereitung

1. Starten Sie eine Übernacht-Kultur von Bakterien in 3 ml LB-Medium + Ampicillin aus einer -80 C Gefrierschrank Lager oder gekühlten Teller. Bei diesem Experiment haben wir S. typhimurium Stamm ELH430 (SL1344 PhoPQ-aroA-).
2. In der Früh, verdünnen die Kultur 1:100 in LB gefiltert und wachsen, um OD600 0.4 - 0.6.
3. Abzentrifugieren und wäscht 3 mal in phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS) resuspendiert und in einer endgültigen OD 600 von 0,1 (etwa 1 x 10 ⁷ Zellen / ml).

4. Bakterien Injection

1. Anesthetize das Tier eind Position auf seiner Seite mit der Schwanz zeigte auf Ihrer dominanten Hand. Verwenden Tierarzt Salbe auf die Augen zu Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
2. Dilate die Schwanzvene mit warmem Wasser oder eine Wärmelampe.
3. Legen Sie die Bakterien (100 ul pro Maus) in einer 1 ml Spritze und biegen Sie die Spitze etwas weniger als 90 Grad.
4. Richten Sie die Spitze der Spritze mit der Schwanzvene, in geringer Tiefe (sollte kein Widerstand zu spüren ist) eindringen, und injizieren Bakterien. Beachten bloodflow Verschiebung für eine erfolgreiche Injektion.

5. Mouse Imaging

1. Anesthetize Tiere in der Induktion Kammer dann platzieren Sie jede Maus auf dem Imaging-Plattform. Verwenden Tierarzt Salbe auf die Augen zu Trockenheit während der Narkose zu verhindern. Pflegen präzise Positionierung auf quantitative Ergebnisse zwischen den Zeitpunkten zu gewährleisten.
2. Bild Tiere mit dem IVIS Spectrum Imaging System (Caliper Life Sciences). Wenn Bildgebung mehr als 1 Tier, Ort Lichtschranken zwischen ihnen zu verhindern Cross-illumung. Tiere zunächst auf der Bauchseite abzubildenden Lokalisierung von Bakterien zu bestätigen.
3. Bild Tieren dorsal mit IVIS alle 2 Stunden für die Dauer des Experiments (36 Stunden). Generieren Sie einen zeitlichen Verlauf für einen bestimmten ROI.

6. Quantifizierung Bakterielle Biodistribution

1. Euthanize Tiere mit CO ₂ und Platz auf der Rückseite auf einem saugfähigen Windel.
2. Schalten Sie das Tier, die beiden hinteren Flanke subkutanen Tumoren freizulegen. Schneiden Sie das umliegende Hautgewebe zu trennen und entfernen Sie die Tumoren. Halten Sie den Tumor mit einer Pinzette aus der Haut mit einer Schere umgekehrte Bewegung. Wenn die Mehrheit der Haut abgetrennt wurde, vollständig zu entfernen den Tumor mit einer Pinzette.
3. Legen Sie die Organe in vorgewogenen Mikrozentrifugenröhrchen. Da die Masse dieser Rohre erheblich variieren können, ist es wichtig, vor der gewogen für quantitative Ergebnisse.

7. Quantifizierung Bakterielle Biodistribution

1. Für jeden Zeitpunkt, Verbrauchsteuern und wiegen die Tumoren.
2. In 500 ul PBS + 15% Glycerin und homogenisieren mit einem Tissue-Tearor (BioSpec). Spülen Sie die Homogenisator 3 mal mit Ethanol zwischen den Proben.
3. Generieren serielle Verdünnungen und Platte für bakterielle Koloniezahlbestimmung. Um Platte mehrere Verdünnungen auf einer einzigen Platte Verwendung pre-geschnittene Platten.

Ergebnisse

Mit diesem Protokoll sind wir in der Lage, Daten über die in vivo-Wachstum und Genexpression Dynamik der Tumor gezielt Bakterien erzeugen. Der gesamte Workflow wird in Abbildung 1 zusammengefasst.

In der ersten Stufe injizieren wir Bakterien (grün) und Bild des Tieres mit IVIS die Genexpression mit Lumineszenz-(Blau) als Reporter zu messen.

Dann, in der zweiten Stufe, wir Verbrauchssteuern, zu homogenisieren und die Platte für Tumoren Ko...

Diskussion

Mit diesem Verfahren sind wir in der Lage, Zeit-Verläufe für das Wachstum und die Genexpression Dynamik von Bakterien besiedeln Tumoren zu erzeugen. Während diese Messungen routinemäßig in vitro in Batch-Kultur oder Mikrofluidik-Geräte ausgeführt, sind sie viel schwieriger in vivo durchzuführen.

Es gibt verschiedene Modifikationen zu diesen Methoden angewendet werden können. Während wir die OVCAR-8-Zelllinie verwendet, um unsere Mausmodellen zu erzeugen, kann eine Anzahl vo...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1 ml Spritze	BD Biosciences	309602
3/10 cc Insulinspritze	BD Biosciences	309301
PrecisionGlide Nadel	BD Biosciences	301629
RPMI Medium 1640 (1X), flüssig, mit L-Glutamin	Invitrogen	11875-119
Ampicillin	Sigma Aldrich	A0166-5G
LB Agar Bouillon	Sigma Aldrich	L2897
Luria-Bertani Bouillon	BD Biosciences	244610