Protein Purification-freie Methode der Bindungsaffinität Bestimmung durch Microscale Thermophorese

Summary

Microscale Thermophorese (MST) kann in weiten Bereichen zur Bestimmung der Bindungsaffinität werden ohne Reinigung des Zielproteins aus Zelllysaten. Das Protokoll umfasst die Überexpression des GFP-Fusionsprotein, Zell-Lyse in nicht-denaturierenden Bedingungen, sowie Erkennung MST Signal in der Gegenwart von variierenden Konzentrationen des Liganden.

Abstract

Quantitative Charakterisierung von Protein-Wechselwirkungen ist wichtig, in praktisch jedem Bereich der Biowissenschaften, insbesondere der Wirkstoffforschung. Die meisten der derzeit verfügbaren Methoden der K _D Bestimmung benötigen Zugriff auf gereinigtes Protein von Interesse, die Erzeugung von denen zeitaufwändig und teuer werden kann. Wir haben ein Protokoll, das zur Bestimmung der Bindungsaffinität von mikroskaligen Thermophorese (MST) ermöglicht ohne Reinigung des Zielproteins aus Zelllysaten entwickelt. Das Verfahren beinhaltet die Überexpression des GFP-Fusionsprotein und Zell-Lyse in nicht-denaturierenden Bedingungen. Anwendung des Verfahrens zur STAT3-GFP transient in HEK293 Zellen erlaubt erstmals die Affinität der gut untersuchten Transkriptionsfaktors an Oligonukleotide mit verschiedenen Sequenzen bestimmen ausgedrückt. Das Protokoll ist einfach und kann eine Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten für auf Interaktionen von Proteinen mit kleinen Molekülen, Peptiden, DNA, RNA haben und proteins.

Introduction

Quantitative Charakterisierung der Affinität von intermolekularen Wechselwirkungen ist in vielen Bereichen der biomedizinischen Forschung wichtig. Binding Dissoziationskonstante (K _D) ist wichtig, nicht nur in der Wirkstoffforschung, sondern ist auch ein wichtiger Parameter bei der Charakterisierung eines binären Wechselwirkung in einem biologischen System. Biochemische Methoden zum Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen eingesetzt werden, wie Immunpräzipitation und Hefe-Zwei-Hybrid-Screens, uns nicht informieren, wie eng sind diese Wechselwirkungen, während Affinität definiert, ob diese besondere Komplex unter gegebenen Bedingungen in vivo vorliegt. In Drug Discovery-Prozess, ist bindend Assay-Entwicklung eine der notwendigen und häufig den zeitaufwendigen Schritte. Die am häufigsten verwendeten Methoden der K _D Bestimmung gehören Fluoreszenz Polarisation, ¹ Oberflächen-Plasmon-Resonanz (SPR)-Technologie, ² Radioligandenbindung, ³ isothermen Titrationskalorimetrie, ⁴ Gleichgewichtsum Dialyse (ED), ⁵ Ultrafiltration (UF), ⁵ und Ultrazentrifugation (UC). ⁶ Alle von ihnen erfordern erhebliche Mengen von gereinigtem Zielprotein. Microscale Thermophorese (MST) ist eine sich schnell entwickelnde Verfahren die gerichtete Bewegung von Molekülen in einem mikroskopischen Temperaturgradienten ermittelt. Änderungen der Hydrathülle von Biomolekülen zu einer relativen Änderung der Bewegung entlang des Temperaturgradienten. ⁷ MST wird verwendet, um Bindungsaffinitäten zu bestimmen und ist für die Untersuchung Ligandenbindung an fluoreszenzmarkierten Proteinen oder fluoreszierenden Liganden an ein Zielprotein angewendet. ^{8, 9} MST ermöglicht die Messung von Wechselwirkungen direkt in Lösung ohne die Notwendigkeit der Immobilisierung auf einer Oberfläche (Immobilisierung-freie Technik). Praktisch ist jede Bindung durch eine Änderung in der MST-Signal begleitet, obwohl die Größe der Veränderung unterscheidet sich von System zu System deutlich. Für den Nachweis von Molekülen durch Bewegung MST, haben sie zu fluoreszierennt. Diese wesentliche Einschränkung des Verfahrens kann in einen Vorteil ausgeschaltet werden. Wenn ein Protein als ein GFP-Fusionsprotein in einem System exprimiert wird, wird es das einzige fluoreszierende Molekül sein und kann somit ohne Isolierung aus dem Zelllysat oder zellfreies Expressionssystem untersucht werden. Generierung von Zelllysaten, die für die Bindung Bedingungen erlauben mit minimalen Artefakten ist die große Herausforderung. Hier beschreiben wir ein Protokoll Zelllysat Vorbereitung und MST Experiment, das für viele lösliche und Membranproteinen verwendet werden können.

STAT-Proteine ​​zytoplasmatischen Transkriptionsfaktoren Tyrosinphosphorylierung in Reaktion auf extrazelluläre Signale aktiviert sind latent und werden in vielen biologischen Prozessen einschließlich Immunität, Hämatopoese, Entzündung und Entwicklung. ¹⁰ In Säugetieren beteiligt besteht der STAT-Familie STAT 1, 2, 3, 4 5A, 5B und 6. Alle aktivierten STATs bekannt sind, um zu der gleichen DNA-Sequenz zu binden, sogenannten GAS-Motiv, IFN-gamma-Sequenz aktiviert. Allerdings ist die transcriptional Auswirkungen verschiedener STATs sind sehr unterschiedlich. ¹¹ Trotz der Beteiligung an vielen pathologischen Prozessen und umfangreiche Untersuchungen was als 17.000 Publikationen wurden die K _D von STAT Wechselwirkungen mit anderen DNA-Sequenzen nicht bestimmt worden. Nur relative Affinität von verschiedenen STATs Varianten von GAS Motiv charakterisiert worden. Schwierigkeiten in ¹¹ Proteinexpression und-reinigung sind die größten Hindernisse bei der Charakterisierung von STATs 'DNA-Bindung Selektivität. Obwohl die Mehrzahl der Studien über die Rolle der "aktivierten" stats, die ein Synonym für Tyr-phosphorylierten Transkriptionsfaktor wurde, die Rolle der nicht-phosphorylierten STATs (U-Stats) bei der Regulation der Transkription konzentriert haben sich rasch. Jedoch ^12, Diese Mechanismen werden kaum verstanden, und es war unklar, ob U-STATs tatsächlich an DNA binden oder wirken durch Wechselwirkungen mit anderen Transkriptionsfaktoren. Wir haben kürzlich gezeigt, dass U-STAT3 an DNA binden sequences anders GAS Motive mit noch höherer Affinität. ^13. Der Befund hat erhebliche Auswirkungen für unser Verständnis der biologischen Funktionen dieses wichtigen Proteins. Wir haben Mikrobereich Thermophorese zu relativen Affinitäten von STAT3 zu GAS bestimmen aufgebracht und AT-reiche Oligonukleotid S +100 (Abbildung 4). Nahezu identische Protokoll wurde für K _D Bestimmung wurde für die Bindung von einem anderen STAT3 Ligand, ein Lipopeptid-Hemmer. ¹⁴ keine Bindung an eine verbundene Transkriptionsfaktor, GFP-STAT1, das als negative Kontrolle verwendet wurde nachgewiesen werden konnte bestätigt damit die Selektivität der Wechselwirkung werden. ¹⁴

Protocol

1. Herstellung von Cell Lysate

Dieses Protokoll wird für adhärente Zellen, die keine GFP-Fusionsprotein bestimmt. Benötigte Zellzahl kann von so niedrig wie 10 ⁶ bis zu 20 x 10 ⁶ Zellen je nach dem Niveau der Proteinexpression. Zum Beispiel wurde Lysat von HEK-Zellen überexprimiert GFP-STAT3 durch Behandlung von Zellen in 10 T75-Flaschen gezüchtet nahe 70% Konfluenz mit 1 ml Lysepuffer. Dies hatte jedoch Lysat verdünnt 150-fache auf optimale Niveau der Fluoreszenz für MST Experiment zur Verfügung zu stellen. Zell-Lyse-Protokoll hängt stark von den Eigenschaften und der intrazellulären Lokalisation des Proteins ab. Bei der Verwendung von Reinigungsmitteln ist wegen der Instabilität Protein unerwünscht, Beschallung unten beschrieben, könnte die beste Wahl sein. Verschiedene Additive zum Lysepuffer Proteinmodifizierung Reaktionen verhindern kann hinzugefügt werden: EDTA verhindert die Phosphorylierung hemmt Natriumvanadat Protein-Tyrosin-Phosphatasen, sodium Fluorid ist ein Inhibitor der Serin / Threonin-Phosphatasen.

1. Bereiten Lysepuffer. Für einfach zu extrahieren zytoplasmatische Proteine ​​der folgenden Zusammensetzung funktioniert gut: 25 mM Tris HCl, pH 8,0, und Proteaseinhibitorcocktail 100-fach verdünnt (Sigma-Aldrich P2714, bestehend aus 2 mM AEBSF, 0,3 uM Aprotinin, 130 pM Bestatin, 1 mM EDTA, 14 pM E-64, 1 uM Leupeptin). Alternativ kann für weniger lösliche Proteine, kann man kommerzielle RIPA-Puffer mit Protease-Inhibitoren-Cocktail und nichtdenaturierenden Reinigungsmittel verwenden. Halten Sie den Puffer auf Eis.
2. Waschen der Zellen kurz mit eiskaltem PBS mit 10 ml Puffer pro T75-Flasche. Halten Zellen auf Eis für 5 min, oder bis die Zellen beginnen Lösen aus dem Kolben. Kratzen Zellen mit Zellschaber zu lösen, wenn nötig.
3. Die Zellen in 10 ml eiskaltem PBS und Transfer zu einem vorgekühlten 14 ml Rundkolben Zentrifugenröhrchen.
4. Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 400-600 g bei 4 ° C für 5 min. Kombinieren Sie mehrere Zellen aus Kolben an diesem Punkt if benötigt.
5. Entfernen PBS Überstand und Pellet in 200 ul eiskaltem Lysepuffer Übertragung Suspension auf eine pre gekühlt 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen.
6. Halten Zellen auf Eis, um lokale Überhitzungen zu minimieren. Lyse Zellen mit 3x 10 sec Impulse Beschallung bei 30% Amplitude, mit einem 2-3 mm vorgekühlt Spitze. Halten Sie die Spitze unter der Oberfläche zu minimieren Aufschäumen. Lassen Sie diesen Schritt bei der Verwendung von Reinigungsmittel-haltigen Puffer und Inkubation auf Eis für 30 min statt.
7. Korrigieren Sie die Lysatlösung auf physiologische Salzkonzentration (100 mM NaCl) bei Bedarf unter Verwendung von 5 M NaCl enthalten.
8. Sammeln Lysate durch Zentrifugation bei etwa 26.000 × g bei 4 ° C für 10 min.
9. Bestimmen Sie die optimale Verdünnung Lysat (wie in Abschnitt 3 beschrieben) und Menge des Lysats für eine Titration (in der Regel rund 300 ul vorverdünnte Lysat) benötigt.
10. Aliquot das Lysat und an einem geeigneten Temperatur für das Protein untersucht (-80 ° C, in den meisten Fällen).

2. MST Buffer Auswahl und Vorbereitung

1. Da die Protein-Ligand-Wechselwirkungen abhängig Pufferbedingungen sind, ist MST Puffer Zusammensetzung basierend auf den Eigenschaften eines bestimmten Systems gewählt. Im allgemeinen ist es vorteilhaft, mindestens zwei unterschiedlichen Puffern testen.
2. Bereiten 2 5x MST Puffer. Wir hatten gute Erfahrungen mit diesen beiden Kompositionen: HEPES (250 mM HEPES, pH 7,4; 25 mM MgCl _2; 500 mM NaCl; 0,25% NP-40) und Tris HCl (250 mM Tris HCl, pH 7,4; 750 mM NaCl; 50 mM MgCl _2, 0,05% Tween-20). Die Zugabe von BSA (5% in der endgültigen verbindlichen Mischung) kann verhindern, Adhäsion von Proteinen an Kunststoffrohren und Glaskapillaren. NaN ₃ (0,5 mm), können ebenfalls enthalten, um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern.

3. Bestimmung der optimalen Lysate Dilution

1. Wählen Sie die LED Anregungsquelle mit der Wellenlänge λ = 470 nm auf der MST Instrument.
2. Legen Kapillaren mit der cell extrahieren verdünnt 2 und 10x mit MST-Puffer.
3. Führen Sie "Find Kapillaren" Operation Control Software von MST Instrument. Der optimale Bereich Fluoreszenz in verdünnten Lysats von 400 bis 1.500 Fluoreszenzeinheiten.

4. Bestimmung der optimalen Ligandkonzentrations Reichweite

1. Die höchste Konzentration des Liganden sollte mindestens 20x höher als die erwartete Dissoziationskonstante.
2. Die niedrigste Konzentration Ligand sollte niedriger sein als molare Konzentration des fluoreszierenden Proteins.

Finden Sie in der NanoTemper Technologies Konzentration Finder-Tool für den Liganden Konzentrationsbereich Schätzung.

5. Herstellung von Cell Lysate und Ligand Verdünnungen

1. Setzen Sie ein Rohr Rack mit einer benötigten Anzahl (in der Regel 10-16) von 0,5 ml LoBind Zentrifugenröhrchen auf Eis. Je 25 ul MST Puffer auf der Unterseite jedes Röhrchen. In 25 ul des Liganden Stammlösung zur ersten Wannee (# 1, Ligand höchste Konzentration) und führen seriellen zweifachen Verdünnung des Liganden mit dem Rest der Rohre. Halten Sie das Rack mit Liganden Proben auf Eis.
2. Thaw Zelllysat langsam auf Eis.
3. Verdünnen Zelllysat mit MST Puffer, um den optimalen Wert des fluoreszierenden Zielprotein in der Bindungsreaktionen zu stellen. Endproteinkonzentration sollte nahe erwarteten K _D oder niedriger. Es sollte eingestellt werden, um notwendige Anzahl von Fluorescence Counts in der Endlösung zu erhalten. Für die Bestimmung der GFP-STAT3-Konzentration im Lysat wurde das Instrument mit einer Hilfe von Fluorescein kalibriert. Die molare Konzentration von GFP in dem Lysat wurde unter Verwendung des Verhältnisses von Fluorescein und EGFP Quantenausbeuten, 0,85 und 0,61 sind. ¹⁵

6. Microscale Thermophorese Bindungsstudien

1. Wählen Sie die LED Anregungsquelle mit λ = 470 nm auf der MST Instrument.
2. Platz 0,5 ml LoBind Röhrchen in der tube Rack gegenüber Röhren mit Liganden Reihenverdünnung Proben. Vorsichtig 15 ul des Zelllysats an der Unterseite jedes Röhrchen. Versuchen Sie nicht, Röhrenwände berühren, um Probe zu vermeiden.
3. In 15 ul des Liganden Probe mit der höchsten Konzentration (# 1) in das entsprechende Röhrchen Nummer 1 mit dem Zelllysat. Gut mischen und verändern einer Pipettenspitze. Diesen Schritt mit dem Rest der Rohre mit Ausnahme des letzten, das keinen Liganden enthalten sollte.
4. In 15 ul MST Puffer zur letzten Röhre und gut mischen.
5. Füllen Sie ca. 2/3 der ersten Kapillare mit der Bindung Mischung aus Rohr # 1, kippen, um die Lösung in Richtung Zentrum bewegen, und legen Sie die Kapillare an der Kapillare Fach auf die Position # 1 (die nächste Position auf dem Tablett Öffnung) . Wiederholen Sie diesen Schritt mit dem Rest Kapillaren. Kapillar-Enden mit Wachs für mehr Experimente gesteckt werden.
6. Setzen Sie das Fach in der MST Instrument, und schließen Sie das Instrument Tür.
7. Führen Sie "Find Kapillaren"Befehl, damit das Instrument genauen Positionen der Kapillaren und messen Fluoreszenz der Proben.
8. Basierend auf dem Fluoreszenzsignalintensität, passen Sie die LED-Leistung (10 bis 100%), um es in 400-1,500 Einheiten Intervall zu bringen.
9. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Start", um die Thermophorese Experiment durchzuführen. Mehr als ein IR-Laserleistung für den Versuch ausgewählt werden, um den optimalen Temperaturgradienten für das jeweilige System zu finden. Sammeln von Daten 2-3 Läufe für den gleichen Satz von Kapillaren, um die Reproduzierbarkeit der Messungen zu gewährleisten. Es dauert 10-12 min zu einem Satz von 16 Kapillaren ausgeführt.

7. Microscale Thermophorese Data Analysis

1. Öffnen Sie die Analyse-Software.
2. Laden Sie das Projekt Ordner. Im Run-Viewer erschien Informationen zu einem bestimmten IR Laserleistung thermophoretische Kurven gesammelt wählen. Es gibt eine Option der Eröffnung alle thermophoretische Spuren unter verschiedenen Bedingungen wie IR Laserleistung gesammelt, LED-power, Temperatur, Konzentration, etc.. auf einmal auswählen und dann alle Kurven für die Analyse, indem er sie ein und aus (auf das Experiment den Namen klicken).
3. In die Beurteilung Punkte Graph Fenster, wählen Sie die Thermophorese oder Thermophorese mit T-Sprung. Stellen Sie sicher, dass blaue und rote Linien korrekt positioniert sind. Um die gemittelten Punkte mit Standardabweichungen zu erhalten, wählen Sie "Durchschnitt" oder "Unterscheiden läuft" für Läufe.
4. Um eine Dissoziationskonstante fit plotten, wählen Sie "Average", geben und fixieren Sie die markierten Molekül Konzentration Wert (überprüfen Sie die "Konzentration" Quadrat in einem Anfall Fenster-Menü), und passen Sie die Kurve. Die K _D-Wert mit seiner Standardabweichung wird in einem separaten Informationen Popup-Fenster. Um eine Anpassung mithilfe Hill Verfahren plotten, wählen Sie "Average", Hill Verfahren, und dann passen die Kurve. Der EC _50-Wert mit seiner Affinität Standardabweichung wird in diesem Fall gezeigt. Das Merkmal der K _D oder Hill "border" kann auch genutzt werden, wenn Sättigung werdenin einem gebundenen Zustand nicht erreicht wird.
5. Speichern Sie die durchschnittliche fit Daten in einer Textdatei und Transfer zu Excel.
6. Plot F _norm (normalisierte Fluoreszenz), AF _Norm (Differenz in normalisierten Fluoreszenz, wenn verschiedene Experimente verglichen werden), oder die Fraktion gebunden (siehe Formel unten) als Funktion des unmarkierten (titriert)-Molekül Konzentration.

Gebundene Fraktion (Fraktion der Moleküle in einem Komplex) = (Therm (C)-ungebunden) / (gebundene-ungebunden), wo Therm (C) ist Thermophorese für die Konzentration C gemessen wird, ist ungebunden Thermophorese für die ungebundenen Zustand (wenn Moleküle sind nicht in einem Komplex) und gebunden ist Thermophorese für den vollständig gebundenen Zustand.

Results

Messung der Affinität der nicht-phosphorylierten STAT3-Protein-Bindung an Oligonukleotide.

HEK293-Zellen, die STAT3-GFP wurde als eine Quelle von fluoreszenzmarkierten STAT3 für DNA-Bindungstest verwendet. Zelllysate wurden unter Verwendung RIPA Puffer (20x10 ⁶ Zellen / ml). Für Bindungsstudien wurden die Lysate verdünnt 150x mit MST DNA-Bindungspuffer auf das optimale Niveau des fluoreszierenden Proteins in der Bindungsreaktion (etwa 20 nm) zu liefern. Nicht-transfi...

Discussion

Proteinexpression und-reinigung ist aufwendig und teuer Schritt, das ist jedoch notwendig, zur Bestimmung der Wechselwirkungen 'K _D von den meisten derzeit verwendeten Verfahren. Anwendung von MST ermöglicht die Vermeidung Proteinreinigung damit deutlich vereinfacht und beschleunigt quantitative Charakterisierung von Wechselwirkungen. Es stellt besonders deutliche Vorteile bei schwer Expression und Aufreinigung von Proteinen, wie Membranproteine ​​und Transkriptionsfaktoren.

D...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RIPA-Puffer	Millipore	20-188	Puffer anderer Hersteller funktionieren genauso
Proteaseinhibitoren Cocktail	Sigma-Aldrich	P2714
Monolith NT.115	NanoTemper Technologies GmbH	G008
Monolith NT.115 Kapillarschale	NanoTemper Technologies GmbH	T001
Monolith NT.115 Standard behandelt Kapillaren	NanoTemper Technologies GmbH	K002
NT Steuerungssoftware	NanoTemper Technologies GmbH	2.0.2.29
NT Analysesoftware	NanoTemper Technologies GmbH	1.4.27
Tischkühlzentrifuge	Eppendorf	5417R	Sonstige gekühlte Mikroröhrchenzentrifugen mit
Protein LoBind Röhrchen 0,5 ml	Eppendorf	22431064