Wir beschreiben die Dissektion des Nervensystems der Meeresumwelt Seehasen Aplysia Nach der Narkose, die Isolierung von Neuronen für kurzfristige-Gewebekulturen, und Aufnahmen von einzelnen Zelle Ionenströme über die Patch-Clamp-Technik.
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In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Meeresschnecke Aplysia californica Weichtier hat eine traditionsreiche Geschichte als Modell für die Funktion des Nervensystems, mit besonderer Bedeutung in den Studien von Lernen und Gedächtnis. Die typischen Vorbereitungen für solche Studien sind solche, bei denen die sensorischen und Motoneuronen intakt gelassen werden in einem minimal seziert Tier oder eine technisch aufwendige neuronalen Co-Kultur der einzelnen sensorischen und Motoneuronen. Weniger häufig ist das isolierte neuronale Vorbereitung, in denen kleine Gruppen von Neuronen sind nominell homogen dissoziiert in einzelne Zellen in kurzfristige Kultur. Solche isolierten Zellen sind für die biophysikalischen Charakterisierung Ionenströme mit Patch-Clamp-Techniken, und gezielte Beeinflussung dieser Leitwerte. Ein Protokoll für die Herstellung solcher Kulturen beschrieben. Das Protokoll nutzt die leicht identifizierbaren glutamatergen sensorischen Neuronen des Pleura-und Buccalganglien, und beschreibt deren Dissoziation und minimale Wartung in Kultur für mehrere Tage ohne Serum.
Einleitung
Die marine opistobranch Weichtier, Aplysia, ist ein nützliches neurobiologischen Modell für viele Jahrzehnte. Es ist am besten als ein Modell der Gewöhnung und klassische Konditionierung 7, 8 bekannt. Studien über Lernen und Gedächtnis in diesem Modell gewann den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin im Jahr 2000 für Eric R. Kandel, in einem Preis, den er mit Arvid Carlsson und Paul Greengard 10 geteilt. Studien mit elektrischen Aufnahmen von reduzierten Zubereitungen, in denen Elemente des Nervensystems des wirbellosen aus dem Tier seziert Nerven und Muskeln belassen wird, haben dazu beigetragen, erläutern die Rollen der einzelnen Ne....
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Protokoll
1. Zellpräparation
- Am Tag 1, wiegen und betäuben Tier.
- Wiegen eine 30 g-1 kg Tier. Anesthetize in 5-10 Tier Volumen von 1:1 Meerwasser: isotonische MgCl. 6H 2 0 1 h mit Belüftung wie eine elektrische Luftpumpe Aquarium mit angeschlossenem airstone.
- Bereiten Dissektion liefert.
- Montieren sauber Dissektion Tablett mit Edelstahl Stecknadeln, wie Stoff-Pins. Montieren Sie mehrere Petrischalen mit künstlichem Meerwasser (ASW, siehe Tabellen 1 und 3) + Penicillin / Streptomycin (P / S).
- Haben Sie bereit eine Low-Power-Mikroskop. Haben sauber Dissektionsinstrumente bereit....
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Ergebnisse
Die Positionen der sensorischen Neuronen im Ganglien, die in diesem Protokoll ausgerichtet sind, sind die BSC und PVC Neuronen in Abbildung 1 dargestellt. Die BSC Neuronen in 2 symmetrische oval Cluster auf der Bauchseite des bukkalen Ganglion, die Oberfläche, die abgewandt von der bukkalen Masse im intakten Ganglion (1A) angeordnet ist. Die PVC Neuronen bilden bilateralen, V-förmigen Cluster, die sich um die dorsale Oberfläche der Pleura Ganglion in Richtung der Mittelachse (1B.......
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Diskussion
Die Dissoziation hier beschriebenen Techniken ergeben sensorischen Neuronen Kulturen mit 50-100 isolierten Neuronen mit einer kleinen Anzahl von Gliazellen und anderen nicht identifizierten Zellen durchsetzt. Die wichtigsten Schritte in dem Protokoll sind die Zeit die Ganglien in Enzym Lösung bleiben, und schnippen, die Dissoziation der verdauten Zellhaufen auseinander zu brechen das Cluster in einzelne Zellen. Enzyme Verdauung (Schritt 1.8) muss bei der Temperatur zur Verfügung optimiert werden. Bei 23 ° C unter langsa.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Gefördert durch NIH P40 OD010952 die Korein Foundation, einer von der Universität Miami Stipendium für SLC und ein Stipendium für Maytag ATK. Die Autoren danken den Mitarbeitern der nationalen Ressource für Aplysia sowie Lauren Simonitis und Hannah Peck, die Aufnahmen für eine Figur zur Verfügung gestellt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Künstliches Meerwasser ASW | Sigma-Aldrich | sortiert ( | mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7,6 |
| Intrazelluläre Lösung | Sigma | sortiert | (mM): 450 KCl, 2,9 CaCl2 (2 H2O), 2,5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA und 40 HEPES-KOH, pH 7,4 |
| Poly-D-Lysin | Sigma | P6407 | |
| Penicillin/Streptomycin zu ASW um 1:100 hinzugefügt | Lonzo Walkersville, Inc. | 17-603E | 5.000 Einheiten/ml Penicillin plus 5.000 mg/ml Streptomycin |
| Neutrale Dispase II | Roche Diagnostics | 10165859001 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H4272 | |
| Kollagenase Typ XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| L-Glutamat (L-Glu) | Sigma-Aldrich | 49601-100G | |
| D-Aspartat (D-ASP) | Sigma-Aldrich | 11200-10G | |
| N-Methyl-D-aspartat (NMDA) | Biomol | 100002-268 | |
| L-ASP | Sigma | A6683-25G | |
| Alpha-Amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazol-propionsäure (AMPA) | Sigma | A6816-5MG | |
| L-Glu R Antagonisten, | verschiedene | ||
| agar | |||
| kynurenate | Sigma-Aldrich | 61250 | |
| APV | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentansäure (NMDAR-Antagonist) | |||
| 2-Propanol | VWRSP | BDH1133 | |
| Chloridlösung | Sigma | sortiert | 25 g FeCl3 + 25 ml konzentriertes HCl + 50 ml H2O |
| Sylgard Silikon 2-Komponenten-Polymer | World Precision Instruments (WPI) | SYL184 | Bietet Pin-Out-Oberfläche für kleine Präparierschalen |
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| Ag/AgCl Halbzelle | WPI | EP4 | |
| 15 ml Zentrifugenröhrchen, 35-2097 BD Falcon* Zentrifugenröhrchen | VWRSP | 21008-918 | nbsp; |
| Abgewinkelte Schere | Fine Science Tools | 15006-09 | |
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| 35 mm Falken-Gewebekulturschalen | VWRSP | 25382-064 | |
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| 15 ml Zentrifugenröhrchen, 35-2097 BD Falcon | VWRSP | 21008-918 | Für 6-Loch-Perfusionssystem mit Schwerkraftzufuhr |
| Aluminiumclips mit Schraubenlochenden | Baumarkt | Für Perfusionssystem | |
| 23 Gauge-Nadeln (manuell abfeilen Punkte) | VWRSP | Für Perfusionssystem | |
| Polyethylenschlauch 0,022" ID x 0,042" OD; 427411 | Becton-Dickinson | für Perfusionssystem | |
| H-7 Pipettenständer/-halter für Microcap-Perfusionsarray | Narishige Deutschland | Für Perfusionssystem | |
| Einwegventile | Für Perfusionssystem | ||
| Drummond Microcaps 1 μ l | VWRSP | Für Perfusionssystem | |
| 18 Gauge-Nadeln für die Absaugung (abgefeilte Punkte) | |||
| Polyethylen-Schlauch | Cole Parmer | 4.27436E+11 | |
| feine Sezierstifte | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Kapillarrohre | Kimble 71900-100 | feuerpoliert und U-förmig in einer Bunsenbrennerflamme gefüllt und gefüllt mit 3% Agar in ECS | |
| Modelliermasse | Bastelgeschäft | ||
| Schalenhalter für Mikroskoptisch mit isoliertem Bodenbad | Sonderanfertigung | ||
| Pasteurpipetten | VWRSP | 14672-412 | |
| Pipettenbirnen | VWRSP | 53283-911 | |
| acrodisk Spritzenvorsatzfilter | VWRSP | 28144-040 | |
| dickwandiges Borosilikat-Filamentglas mit 1,5 mm Durchmesser | WPI | 1B150F-3 | |
| Hochreiner Stickstoffzylinder und gabelbarer Regler | |||
Tabellen 1-3. Listen von Reagenzien, Materialien und Geräten. |
Referenzen
- Buttner, N., Siegelbaum, S. A. Antagonistic modulation of a hyperpolarization-activated Cl(-) current in Aplysia sensory neurons by SCP(B) and FMRFamide. J. Neurophysiol. 90 (2), 586-598 (2003).
- Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R.
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Nachdrucke und Genehmigungen
