Summary
Xenotrapianti tumorali umani in topi immunodeficienti sono strumenti preziosi per studiare biologia del cancro. Sono descritti i protocolli specifici per generare xenotrapianti sottocutanei e intraepatiche da cellule di carcinoma epatocellulare umani o frammenti di tumore. Rigenerazione epatica indotta da epatectomia parziale in topi riceventi si presenta come una strategia per facilitare l'attecchimento intraepatica.
Abstract
In vivo modelli sperimentali di carcinoma epatocellulare (HCC) che ricapitolano la malattia umana forniscono una valida piattaforma per la ricerca in fisiopatologia della malattia e per la valutazione preclinica di nuove terapie. Presentiamo una varietà di metodi per generare sottocutaneo o ortotopico xenotrapianti HCC umano in topi immunodeficienti che potrebbe essere utilizzato in una varietà di applicazioni di ricerca. Con un focus sull'uso del tessuto tumorale primario da pazienti sottoposti a resezione chirurgica come punto di partenza, si descrive la preparazione di sospensioni di cellule tumorali o frammenti di xenotrapianto. Descriviamo tecniche specifiche per xenotrapianto questi tessuti i) per via sottocutanea, oppure ii) intraepaticamente, mediante impianto diretto di cellule tumorali o frammenti nel fegato, o indirettamente mediante iniezione di cellule nella milza mouse. Noi descriviamo anche l'uso di resezione parziale del fegato di topo nativo al momento di xenotrapianto come strategia perindurre uno stato di rigenerazione epatica attiva nel topo ricevente che può facilitare l'attecchimento intraepatica di cellule primarie tumorali umane. I risultati attesi di queste tecniche sono illustrate. I protocolli descritti sono stati convalidati usando campioni di HCC umani elementari e xenotrapianti, che in genere svolgono meno robusto rispetto alle linee cellulari di HCC umano consolidate che sono ampiamente utilizzati e frequentemente citati nella letteratura. In confronto con linee cellulari, discutiamo i fattori che possono contribuire alla relativamente bassa probabilità di attecchimento primaria HCC in modelli di xenotrapianto e commentare su questioni tecniche che possono influenzare la cinetica della crescita xenotrapianto. Suggeriamo anche i metodi che devono essere applicate per garantire che xenotrapianti ottenuti ricordano con precisione i tessuti di HCC genitore.
Introduction
Il carcinoma epatocellulare (HCC) è il quinto tumore più comune al mondo e la più rapida crescita causa di morte per cancro in Nord America. Il fattore di rischio prevalente per HCC è la cirrosi epatica, più frequentemente si verificano a causa di epatite cronica virale, l'abuso di alcol, malattie autoimmuni o disturbi metabolici ereditari 1.
Nonostante il carico di malattia pesante imposto dalla HCC sulle popolazioni mondiali, la fisiopatologia di HCC è relativamente poco compresa in confronto ad altri tumori comuni come colon, seno, o cancro alla prostata. Ad esempio, gli eventi molecolari e cellulari specifici di guida tumorigenesi ancora essere chiaramente definiti 2. Come la maggior parte altri tumori epiteliali solidi, approcci genomici hanno rivelato l'eterogeneità delle aberrazioni connesse con HCC 3. Un certo numero di studi hanno rivelato attività disordinata di una varietà di vie di segnalazione coinvolte nella proliferazione cellulare, sursopravvivenza, differenziazione, e l'angiogenesi 4. Inoltre, il ruolo delle cellule staminali del cancro in HCC pathobiology Rimane da chiarire 5.
Con una comprensione limitata di HCC fisiopatologia, l'armamentario di terapie efficaci per HCC è rimasta relativamente limitato. Pazienti in fase iniziale con tumori confinati al fegato sono candidati per la terapia curativa con ablazione del tumore o la resezione chirurgica, anche se la ricorrenza è comune. Nei pazienti con malattia più avanzata, la chemioterapia e le radiazioni sono di efficacia limitata e sono utilizzati principalmente per il controllo delle malattie con intento palliativo 6.
Alta qualità in vivo modelli sperimentali di HCC umano così fornire una valida piattaforma per la ricerca di base tanto necessaria nella fisiopatologia del carcinoma epatocellulare umano, nonché per la valutazione di nuovi approcci terapeutici. Rispetto all'uso di linee cellulari o modelli murini altamente definiti, xenotrapianti di pritumori umani in topi immunodeficienti mary sono emersi come strumenti preziosi per tali studi, in quanto sono in grado di ricapitolare malattia umana con alta fedeltà e di cogliere l'eterogeneità che è presente all'interno e tra i diversi pazienti 7,8. A questo scopo, abbiamo sviluppato una varietà di metodi per stabilire xenotrapianti HCC umani in topi immunodeficienti. Mentre la maggior parte degli studi pubblicati che coinvolgono xenotrapianti HCC descrivono l'uso di linee cellulari di carcinoma epatico umano affermati per questo scopo, ci siamo concentrati su come ottimizzare le nostre analisi per generare xenotrapianti da campioni di HCC primari ottenuti subito dopo la resezione chirurgica di pazienti.
Diverse tecniche di xenotrapianto può essere richiesto per le diverse applicazioni di ricerca. Ad esempio, xenotrapianti sottocutaneo generati da frammenti tumorali sono generati rapidamente, sono facilmente monitorati e potrebbero essere più appropriato per l'amministrazione locale di nuove terapie con comodomonitoraggio della risposta tumorale. Xenotrapianti intraepatiche possono essere più rilevanti per gli studi relativi al ruolo del microambiente epatica in HCC biologia. Xenotrapianti generati da sospensioni di cellule tumorali sono necessarie per l'identificazione e la caratterizzazione delle sottopopolazioni di cellule tumorali iniziare o per esperimenti che richiedono manipolazioni in vitro di cellule tumorali prima xenotrapianto. Abbiamo così sviluppato e validato i seguenti protocolli di stabilire per via sottocutanea o xenotrapianti intraepatiche da sospensioni di cellule o frammenti tumorali derivati da campioni di HCC umani primari.
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Protocol
Una panoramica schematica del protocollo è presentata nella Figura 1.
1. Elaborazione di HCC umano Campioni
Ottenere campioni di HCC umano primarie con il consenso scritto del paziente e con l'approvazione del comitato etico della ricerca istituzionale. Questi protocolli sono stati eseguiti presso il nostro istituto, con l'approvazione del Comitato Etico Research University Health Network in conformità a tutte le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano.
Prelevare i campioni di HCC freschi appena possibile dopo l'intervento chirurgico campioni, una volta adeguate sono state prese per scopi clinici. Idealmente questo dovrebbe avvenire entro 30 minuti dopo la rimozione del tessuto dal paziente. Come illustrato nella Figura 2, un campione di almeno 1 cm 3 ottenuto dalla periferia del tumore è ottimale, in quanto la porzione centrale del tumore può essere necrotico.Tumori che non hanno ricevuto alcun trattamento prima della resezione come radioterapia, chemioterapia o l'ablazione sono preferiti al fine di massimizzare la possibilità che le cellule tumorali sono vitali. Maneggiare tessuti umani primari in conformità con i protocolli di protezione personali standard per materiale a rischio biologico. Eseguire tutte le manipolazioni di laboratorio di tessuti tumorali e preparazioni di cellule in un armadio di sicurezza biologica di classe II con tecniche asettiche.
- Collocare il campione HCC fresca in 10-25 ml Modified F12 Eagle Medium / Ham 's Dulbecco privo di siero a 4 ° C e trasferire sul ghiaccio al laboratorio per l'elaborazione immediata e la preparazione di frammenti e / o cellule di tessuto per xenotrapianto in topi.
- Utilizzando pinze sterili, collocare il campione di tumore in un x 20 mm piastra di Petri 100 mm o altra superficie di lavoro sterile adatto. Dividere il campione del tumore in frammenti di circa 2-3 mm 3 usando un bisturi chirurgico No.10. A questo punto, considerare scatto di congelamento o formalina fissa some frammenti di tumore di altri esperimenti o analisi come richiesto.
- Per xenotrapianto di frammenti di tumore, posizionare alcuni dei frammenti HCC in uno o più tubi microcentrifuga contenenti Matrigel sufficiente per permettere ai frammenti di rimanere sommersi. Mantenere questi tubi sul ghiaccio.
- Per la preparazione di una sospensione di cellule tumorali, utilizzare il bisturi chirurgico per tritare il rimanente tessuto HCC quanto possibile e mescolare con 5-10 ml di DMEM-F12 in una provetta da 50 ml a seconda del volume del tessuto tritato.
- Aggiungi collagenasi di tipo IV e dispasi II a concentrazioni finali di 200 unità / ml e 0,8 unità / ml. Pipettare la miscela su e giù bene con una pipetta 25 ml.
- Sigillare la provetta e incubare la miscela dal punto 1.6 a 37 ° C in un incubatore a biossido di carbonio 5% per 30-60 min a seconda della morbidezza del tessuto tumorale. Pipettare la miscela su e giù un paio di volte ogni 10 min per valutare i progressi della digestione enzimatica.
- Dopo digestion è completa, passare la soluzione di tumore attraverso un colino a 100 cellule micron. Schiacciare delicatamente il tessuto rimanente sul filtro cella utilizzando una punta di pipetta 25 ml per consentire il massimo numero di cellule tumorali di passare attraverso. Raccogliere la sospensione cellulare tesa in un tubo da 15 ml.
- Centrifugare la sospensione di cellule tumorali a 1.200 giri per 5 minuti a 4 ° C.
- Decantare delicatamente il surnatante. A seconda delle dimensioni del pellet, aggiungere 2-5 ml di ghiaccio freddo 1x globuli rossi (RBC) tampone di lisi e pipettare delicatamente su e giù per risospendere il pellet. Tenere in ghiaccio per 5 min.
- Aggiungere DMEM-F12 ad un volume totale di 15 ml e centrifugare a 1000 rpm per 5 minuti a 4 ° C per lavare il tampone di lisi RBC.
- Decantare delicatamente il surnatante e risospendere il tumore pellet RBC-libero delle cellule in DMEM-F12.
- Contare le cellule vitali mediante trypan blu manualmente o con un contatore automatico cella.
- Aliquote di cellule tumorali centrifuga contenenti il numbe desiderator di cellule iniettabile come sopra descritto, risospendere il pellet cellulare risultante in 30 ml di ghiacciata Matrigel, e memorizzare su ghiaccio.
Optional: Dopo il punto 1.11, abbiamo regolarmente impiegare una CD45 + cellule umane (leucociti) dalla sospensione massa di cellule tumorali e / o purifichiamo sottoinsiemi di cellule tumorali in citometria a flusso o sfere immunomagnetiche. Protocolli dettagliati per queste tecniche sono ben descritti da parte dei produttori degli anticorpi pertinenti, perline e citometri a flusso.
Nota: Il protocollo descritto sopra può essere usato per trattare tumori umani raccolti da topi al fine di eseguire il trapianto seriale, sostituendo il tessuto xenotrapianto per il tessuto HCC umano primario nel passaggio 1.1. In questa situazione, dopo passo 1.11, abbiamo quotidianamente impiegare una infiltrante cellule murine dalla sospensione cellulare utilizzando un anticorpo contro l'antigene del mouse istocompatibilità H2K.
2.Xenotrapianto
Eseguire tutte le procedure animali in conformità con i protocolli approvati dal comitato cura degli animali istituzionale. Le procedure qui descritte siano stati compiuti sotto uno specifico protocollo di uso di animali, approvato dal comitato Animal Care University Health Network in conformità e il rispetto di tutte le agenzie pertinenti normative e istituzionali, normative e linee guida.
Attrezzature per la consegna di anestetici volatili inalatori ai piccoli animali deve essere utilizzato in base alle procedure operative standard della struttura animale e istituto di ricerca. Eseguire tutte le procedure chirurgiche che utilizzano tecniche asettiche e strumenti sterili in un armadio biosicurezza di classe II. Utilizzare diabetici non obesi immunodeficienza combinata grave (NOD / SCID) o NOD / SCID / interleuchina 2 recettore gamma catena nulli (GFN) ceppi di topi di entrambi i sessi a 6-8 settimane di età (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) 9,10. Questetopi deve essere ospitato e mantenuto in una struttura in grado di fornire condizioni di assenza di patogeni adatti per gli animali immunodeficienti.
Preparare topi per la chirurgia in una camera di alimentazione 5% (v / v) inalato isoflurano in 1 L / min di ossigeno. Mantenere l'anestesia finché vi è perdita di riflesso corneale e punta nell'animale (s). Per xenotrapianto sottocutanea, radere una o più piccole aree sul dorso dell'animale (s) e pulire la pelle con il 70% di etanolo. Per xenotrapianto intraepatica, radere il torace e l'addome ventrale dell'animale (s) dal ascelle fino alla regione inguinale e detergere la pelle con il 70% di etanolo.
2.1 impianto sottocutaneo di frammenti di tumore
- Posizionare il mouse anestetizzato prona, mantenendo l'anestesia inalatoria isoflurano (2% (v / v) in 1 L / min O 2) con un boccaglio. Applicare strappo-Gel per proteggere gli occhi dell'animale da lesione traumatica.
- Sterilizzare l'area rasata dorsale (s) con Betadinescrub chirurgico seguito da etanolo al 70% e, infine, con una soluzione di povidone-iodio.
- Effettuare una incisione cutanea 5 millimetri usando forbici affilate sterili.
- Inserire una forbice smussato chiuso delicatamente nello spazio sottocutaneo e diffondere delicatamente per sviluppare una tasca abbastanza grande per ospitare un frammento di tumore.
- Inserire il frammento di tumore preparato nella fase 1.3 nella tasca sottocutanea utilizzando sterili pinza sottile.
- Chiudere l'incisione cutanea con suture o clip.
- Fornire assistenza postoperatoria per il mouse come descritto di seguito.
2.2 L'iniezione sottocutanea di cellule tumorali
- Preparare l'animale come descritto nei passi 2.1.1 e 2.1.2.
- Caricare la sospensione di cellule tumorali in Matrigel preparati nel passo 1.13 in una siringa da insulina con un 29 G 1/2 in dell'ago.
- Inserire l'ago nello spazio sottocutaneo e scaricare il contenuto della siringa. Avanzando l'ago diversi millimetri lungo il piano sottocutaneo lontano from il sito di puntura pelle impedisce la fuoriuscita della sospensione di cellule tumorali dal sito di puntura sul ritiro dell'ago.
- Fornire assistenza postoperatoria per il mouse come descritto di seguito.
2.3 Impianto intraepatica di frammenti di tumore
- Utilizzando un 27 G 1/2 in ago su un siringa da 1 ml, somministrare 350 ml di sterile normale soluzione salina per via sottocutanea nel dorso del collo dell'animale anestetizzato per compensare le perdite di fluido intraoperatorie. Per analgesia, somministrare 350 ml di sterile normale soluzione salina contenente buprenorfina (0,1 mg / kg) per via sottocutanea sul fianco dell'animale, utilizzando un 1/2-in ago 27 G in una siringa da 1 ml.
- Posizionare il mouse su una supina tampone pre-riscaldata con il naso e la bocca posizionata all'interno del boccaglio per fornire manutenzione anestesia inalatoria isoflurano (2% (v / v) in 1 L / min O 2).
- Estendere le membra e fissarli con nastro adesivo alla superficie operativa per ottimizzare l'esposizione dil'addome ventrale e del torace.
- Eseguire la procedura sotto una lampada di ingrandimento per ottimizzare la visualizzazione.
- Sterilizzare la pelle rasata sull'addome ventrale e del torace con Betadine scrub chirurgico seguito da etanolo al 70% e, infine, con una soluzione di povidone-iodio.
- Utilizzando forbici affilate sterili, fare un traverso un'incisione cutanea sottocostale bilaterale e dividere gli strati muscolari per entrare nella cavità peritoneale per consentire una adeguata esposizione di tutto il fegato.
- Collocare un punto nella pelle sopra il processo xifoideo e fissarlo al boccaglio con nastro al fine di consentire una migliore esposizione del fegato e strutture circostanti.
- Utilizzare due applicatori di cotone con punta adiacenti e posteriore al fegato per stabilizzarlo.
- Fare un'incisione 3 mm di lunghezza e profondità sulla superficie del fegato con un ago sterile No. 10 bisturi.
- Applicare immediatamente Surgicel e leggera pressione sul sito di incisione per ottenere l'emostasi; rimuovere dopo 60-90 sece procedere solo se completa emostasi è stato raggiunto.
- Posizionare un frammento di tumore passo 1.3 nell'incisione fegato con sterili pinza sottile o con un ago da 18 G.
- Applicare un piccolo pezzo di Surgicel sopra l'incisione fegato per impedire lo spostamento del frammento di tumore e assicurare la continua emostasi.
- Chiudere l'incisione con suture o clip.
- Fornire assistenza postoperatoria come descritto di seguito
2.4 Impianto intraepatica di cellule tumorali tramite iniezione diretta nel fegato
- Preparare il mouse come descritto nei punti da 2.3.1 a 2.3.7 sopra.
- Caricare la sospensione cellulare tumorale (preparato nella fase 1.13) in una siringa da insulina con un 29 G 1/2 in dell'ago.
- Con il fegato stabilizzato con un cotton-tip, inserire l'ago della siringa di insulina nel fegato e far avanzare la punta di qualche millimetro oltre il punto di prelievo lungo un piano subcapsular.
- Scarica delicatamente il contenuto della siringa e tgallina rimuovere l'ago dal fegato.
- Posto Surgicel sul sito della puntura e applicare una leggera pressione con un applicatore con punta di cotone per evitare perdite di sospensione cellulare tumorale e realizzare la completa emostasi.
- Chiudere l'incisione con suture o clip e fornire cure post-operatorie come descritto di seguito.
2.5 xenotrapianto intraepatica di cellule tumorali tramite iniezione nel Milza
- Preparare il mouse come descritto nei punti da 2.3.1 a 2.3.5 sopra.
- Utilizzando forbici affilate sterili, fanno un 1 cm a sinistra incisione sottocostale per entrare nella cavità peritoneale.
- Usare un applicatore con punta di cotone per riflettere lo stomaco craniale e al lato destro dell'animale al fine di esporre la milza.
- Gestendo i tessuti adiposi circostanti con sterili pinza sottile atraumatica, consegnare la milza nell'incisione e mettere un applicatore con punta di cotone dietro la milza per stabilizzarlo.
- Utilizzo di 5-0 sutura di seta, postoun sciolto nodo pre-legato intorno alla milza di sopra del polo inferiore.
- Caricare la sospensione cellulare tumorale (preparato nella fase 1.13) in una siringa da insulina con un 29 G 1/2 in dell'ago.
- Inserire la siringa di insulina nel polo inferiore della milza e avanzare oltre il livello del nodo allentato pre-legato.
- Scaricano lentamente il contenuto della siringa, rimuovere l'ago dalla milza, e stringere il nodo per evitare fughe di sospensione cellulare tumorale iniettato.
- Sostituire la milza nella cavità peritoneale.
- Chiudere l'incisione con suture o clip e fornire cure post-operatorie come descritto di seguito.
2.6 epatectomia parziale per facilitare intraepatica Engraftment di tessuto tumorale umano
- Preparare il mouse come descritto nei punti da 2.3.1 a 2.3.7.
- Con forbici affilate sterili, dividere il legamento falciforme attaccato al lobo mediano del fegato.
- Usando un applicatore con punta di cotone, di mobilitareil lobo sinistro del fegato e della posizione di un nodo sciolto pre-legato di 5-0 sutura di seta intorno al lobo sinistro. Avanzare il nodo allentato il più vicino possibile verso il peduncolo bilio-vascolare del lobo sinistro e stringere il nodo.
- Asportare il lobo distale sinistra alla legatura con le forbici sterili, lasciando un piccolo moncone per evitare lo slittamento del nodo e la successiva emorragia.
- Utilizzando una tecnica simile, legare e resecare la maggioranza del lobo mediano del fegato, evitando la cistifellea.
- Uso Surgicel e leggera pressione con un applicatore con punta di cotone lungo le superfici di taglio del parenchima epatico realizzare la completa emostasi.
- Per xenotrapianto intraepatica di un frammento tumore o cellule tumorali, procedere con gradini 2.3.8 a 2.3.11 o 2.4.2 a 2.4.5 come descritto sopra.
- Per xenotrapianto intraepatica di cellule tumorali mediante iniezione milza, utilizzare applicatori di cotone con punta di riflettere delicatamente lo stomaco craniale e al lato destro dell'animale, exposing la milza. Procedere con i punti 2.5.4 a 2.5.9 come descritto sopra.
- Chiudere l'incisione con suture o clip e fornire cure post-operatorie come descritto di seguito.
2.7 Cura postoperatoria
- Rimuovere il mouse dalla anestesia inalatoria boccaglio.
- Posizionare il mouse in una gabbia sotto una lampada di calore per circa 20 minuti fino a quando recuperato da anestesia e mobilitare pienamente.
- Ripetere la dose di buprenorfina ogni 8-12 ore durante i primi 2-3 giorni postoperatori.
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Representative Results
Figura 3 illustra l'aspetto tipico di un sottocutanea xenotrapianto HCC umano e il corrispondente aspetto istopatologico del tumore. Lo sviluppo e la crescita degli xenotrapianti sottocutanee possono essere facilmente monitorati dal quotidiano esame di topi riceventi. L'intervallo di tempo tra xenotrapianto e lo sviluppo di un tumore può variare notevolmente a seconda del tipo di tessuto (tumore frammento vs sospensione cellulare), fonte di tessuto (campione primario paziente, xenotrapianto diversi passaggi, o linea cellulare), e la quantità di tessuto impiantato ( numero di cellule o dimensione dei frammenti del tumore). Ad esempio, xenotrapianti consistenti possono sviluppare dalla iniezione di 5 x 10 6 cellule di una linea di cellule HCC consolidata in 1-2 settimane, mentre altre 6 mesi può essere necessario per lo sviluppo di un xenotrapianto simile da 1 x 10 5 cellule ottenuti da un campione HCC paziente primario. Non abbiamo osservato la formazione di xenotrapianto sottocutanea entro 6 mesi dalla implantation del campione del tumore, e quindi sacrificare topi riceventi in questo timepoint se xenotrapianti non hanno sviluppato.
La Figura 4 illustra le apparenze tipici della intraepatiche xenotrapianti HCC umano ottenuti da impianto diretto di tessuto tumorale nel fegato e quelli ottenuti da iniezione di cellule tumorali nella milza. Xenotrapianti intraepatiche non poter essere facilmente rilevati da esame fisico generale del mouse destinatario meno che il tumore è estremamente grande o ha portato allo sviluppo di ascite o distensione addominale. Anche se le piccole modalità di imaging animale come la TAC sono disponibili presso alcuni istituti di ricerca e potrebbero essere utilizzati per interrogare accuratamente il fegato del ricevente topi 11, noi non consideriamo questo un approccio ampiamente applicabile, pratico, o il costo-efficace per la maggior parte dei ricercatori. Abbiamo osservato che la velocità con cui xenotrapianti intraepatiche sviluppano analogo al tasso al quale subcutáneonoi xenotrapianti sviluppare, ed è altrettanto influenzati da variabili quali il tipo, l'origine e la quantità di tessuto impiantato. Sulla base della performance dei xenotrapianti sottocutanei derivati dallo stesso tessuto genitore come quello usato per xenotrapianti intraepatica, selezioniamo un timepoint per il sacrificio del mouse destinatario e l'esame del fegato, a meno chiara evidenza di un grosso tumore intraepatico è presente prima di questo. Abbiamo osservato che l'aggiunta di una epatectomia parziale alla procedura xenotrapianto intraepatica utilizzata migliora la probabilità di raggiungere attecchimento del tessuto tumorale umano nel fegato topo, ma non sembra accelerare il tasso di crescita xenotrapianto.
La tabella 1 riassume i tassi di attecchimento del tumore raggiunto dopo l'impianto di tessuti HCC umani primari in topi immunodeficienti utilizzando le diverse tecniche descritte in questo protocollo. Per ogni metodo di impianto, il denominatore del tasso di tumore riflette un ronzio unico un campione HCC. Questi dati dimostrano che, per i tessuti HCC umani primari, i tassi di attecchimento sottocutaneo sono inferiori ai tassi di attecchimento intraepatica ottenuti tramite iniezione di cellule tumorali intrasplenica o intraepatica frammento impianto del tumore, e che epatectomia parziale sembra migliorare l'attecchimento intraepatica. Anche se abbiamo utilizzato con successo l'iniezione diretta delle cellule nel fegato del mouse per generare xenotrapianti intraepatici dalle linee ben consolidate umani HCC cellulari (dati non riportati), non abbiamo conseguito alcun xenotrapianti intraepatici con questo metodo su campioni di HCC umano primario, nonostante l'uso di epatectomia parziale .
Figura 1. Schema di protocollo illustrare flusso di lavoro per l'elaborazione e la preparazione di campione HCC nonché le successive opzioni xenotrapianto (riquadro).
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Figura 2. La resezione epatica esemplare di un paziente con carcinoma epatocellulare. Questa paziente non aveva ricevuto alcuna terapia adiuvante per il tumore. La scatola bianca indica una parte vitale del tumore nei pressi della periferia che è stato ottenuto per xenotrapianto. Barra della scala in alto a destra corrisponde a 1 cm.
Figura 3. Epatocellulare umano carcinoma xenotrapianto generato dall'iniezione sottocutanea di cellule tumorali. A) Il tumore può essere facilmente apprezzato sul fianco destro dell'animale. B) Il tumore è visto per essere distinti dai tessuti circostanti dopo aver sacrificato l'animale. C) L' istologia del tumore mostra caratteristiche tipiche di carcinoma epatocellulare, comprese le cellule epatociti-like con atipie nucleari e elevato rapporto nucleare-to-citoplasmatica, l'assenza di spazi portali e disttrabecole orted con un aumento dello spessore delle lastre epatocellulari. Barra della scala corrisponde a 1 cm di pannelli A e B, e 100 micron di pannello C. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 4. Intraepatiche xenotrapianti carcinoma epatocellulare umano. A) Xenograft generato da impianto di un frammento di tumore umano nel fegato mouse. Tumore intraparenchimale indicato dalla freccia nera. Scala di righello nella parte inferiore della fotografia in B) Xenograft cm. Generato dall'iniezione di cellule tumorali umane nella milza topo seguente epatectomia parziale. Tumore intraparenchimale indicato dalla freccia nera. Barra della scala corrisponde a 1 cm. Sezione C) Istologia attraverso margine di intraepatica xenotrapianto dimoing caratteristiche tipiche di carcinoma epatocellulare umano (in basso a destra) e normale adiacente fegato di topo (in alto a sinistra). Barra della scala corrisponde a 100 micron. Clicca qui per ingrandire la figura .
| Impianto sito | Metodo Impianto | Tumore Prendere Tasso |
| sottocutaneo | sospensione cellulare | 6/55 (10,9%) |
| frammento di tumore | 23/136 (16,9%) | |
| milza | sospensione cellulare | 3/15 (20%) * |
| sospensione cellulare + epatectomia parziale | 6/14 (42,9%) * | |
| fegato | frammento di tumore | 6/13 (46,2%) |
| frammento di tumore + epatectomia parziale 2/3 (66,7%) | ||
| sospensione cellulare | non eseguita | |
| sospensione cellulare + epatectomia parziale | 0/8 (0%) | |
| * Parte dei campioni che hanno prodotto noduli tumorali intraepatiche | ||
Tabella 1. Tassi di attecchimento umani HCC in topi immunodeficienti corrispondenti a diverse tecniche di impianto.
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Discussion
Abbiamo descritto una varietà di tecniche per stabilire sottocutanea e intraepatiche xenotrapianti HCC umano in topi immunodeficienti che può essere applicata a una vasta gamma di domande e saggi sperimentali. Mentre xenotrapianti sottocutanei sono stati ampiamente utilizzati per studiare vari aspetti della biologia HCC, xenotrapianti intraepatiche sono raramente descritti in letteratura. Inoltre, la maggior parte degli studi che descrivono l'uso di xenotrapianti hanno generato questi da linee cellulari ben consolidata. Dati i limiti delle linee di cellule di cancro in modellazione biologia tumorale umano 12, siamo stati motivati a validare le tecniche sopra descritte utilizzando tessuti di HCC umano primari. Anche se non è supportato da analisi statistica a causa delle piccole dimensioni del campione dei gruppi sperimentali, le nostre osservazioni soggettivamente rivelano una tendenza irresistibile verso il miglioramento dei tassi di attecchimento con l'aggiunta di epatectomia parziale per l'impianto intraepatica di cellule tumorali o frammenti. </ P>
I pochi studi che hanno rigorosamente tentato di utilizzare tessuti primari hanno raggiunto con successo l'innesto sottocutaneo, con solo una piccola percentuale dei campioni dei pazienti ottenuti 13-15. Abbiamo anche osservato che la proporzione dei campioni di HCC umani primari che engraft successo nello spazio sottocutaneo di topi immunodeficienti utilizzando le tecniche sopra descritte è limitato a circa il 15%. Nel fegato umano, lesioni HCC sono ipervascolare, ricevendo loro apporto di sangue prevalentemente attraverso l'arteria epatica 16,17. Noi ipotizziamo che il tasso di attecchimento bassa di tessuti di HCC primari che noi ed altri abbiamo osservato può essere il risultato della vulnerabilità dei tessuti HCC freschi alla relativa ipossia del microambiente in cui sono eterotrapiantate, senza apporto arterioso stabilita. La suscettibilità dei tessuti HCC ad una rapida necrosi ischemica nell'intervallo tra la resezione chirurgica e xenotrapianto può anche Account per il tasso di attecchimento basso raggiunto nei topi.
Per la generazione di intraepatiche xenotrapianti HCC umano da sospensioni cellulari tumorali, abbiamo scoperto che l'iniezione di cellule nella milza è un approccio tecnicamente favorevole che comporta tassi superiori di attecchimento fegato da campioni di HCC umani primari. La milza è una struttura altamente vascolarizzato che possono sostenere meglio cellule HCC rispetto ad altre parti del corpo del mouse, e da cui le cellule tumorali sembrano viaggiare facilmente nel fegato attraverso le vene splenica e portale. In confronto con il parenchima epatico, in cui è tecnicamente difficile iniettare direttamente le cellule senza perdita o emorragia, la milza ha la capacità strutturale per accogliere il volume della sospensione cellulare che viene iniettato, e può essere facilmente ligato volta l'iniezione delle cellule tumorali è completa. Iniezione di sospensioni cellulari direttamente nella vena porta o dell'arteria epatica in 6-8 settimane di età topi non è tecnicamente feasbile.
Abbiamo utilizzato epatectomia parziale in topi riceventi per facilitare l'attecchimento intraepatica di tessuti di HCC umani. Sebbene i modelli murini di epatectomia parziale sono stati ampiamente utilizzati per studiare la biologia della rigenerazione del fegato 18, non siamo a conoscenza di tutti i rapporti che descrivono in combinazione con intraepatica xenotrapianti tumorali. Poiché rigenerazione epatica si verifica rapidamente entro i primi giorni seguenti epatectomia parziale, abbiamo ipotizzato che la notevolmente aumentata espressione di stimoli mitogeni e angiogenici nel parenchima epatico sarebbe meglio sostenere l'attecchimento e la proliferazione di vulnerabile tessuto tumorale umano o cellule impiantate nella porzione rimanente del fegato del topo, rispetto a un fegato topo nel suo "riposo" stato 19. Negli esseri umani, il fattore di rischio per lo sviluppo di HCC è avanzata fibrosi epatica o cirrosi, che è caratterizzata dallo sviluppo di disorganizzato non rigenerativaduli, e che è stato concettualizzato da alcuni come uno stato di danno epatico cronico e la rigenerazione 20. Le tecniche che abbiamo dimostrato di attecchire tessuti HCC umani nel fegato del mouse attivando la rigenerazione del fegato possono rivelarsi un modello valido per consentire un'indagine sul ruolo del microambiente epatico e fegato meccanismi rigenerativi nella fisiopatologia di HCC.
Mentre le tecniche qui descritte sono in grado di generare alta qualità xenotrapianti HCC umani primari in topi immunodeficienti, investigatori contemplano l'uso di questi protocolli devono considerare alcuni limiti del modello. In primo luogo, i nostri protocolli incorporano minimo ritardo tra la resezione chirurgica del tessuto del paziente e la sua successiva trasformazione in laboratorio, ma registrando alti tassi attecchimento è rimasta una sfida, questo suggerisce che l'attuazione vitale di queste tecniche richiede prossimità del sito di raccolta tessuto del paziente allaboratorio, o le infrastrutture che possono ridurre i ritardi nel trasferimento dei campioni freschi. In secondo luogo, complesse procedure chirurgiche addominali in 6-8 settimane vecchi topi immunodeficienti devono essere eseguite da personale adeguatamente addestrato, al fine di conseguire la sopravvivenza degli animali per diversi mesi prima di formare xenotrapianti; tali procedure e la successiva cura degli animali sono tempo e risorse. Terzo, lo sviluppo e la progressione di xenotrapianti intraepatiche non possono essere facilmente controllati senza sacrificare animali a predeterminati intervalli di tempo, limitando l'utilità di xenotrapianti in questa posizione per alcuni tipi di saggi come sopra descritto. Inoltre, xenotrapianti intraepatiche derivati da iniezione di cellule nella milza, possono presentare come noduli multipli sparsi nel parenchima epatico che sono difficili da quantificare con precisione in termini di carico totale del tumore. Infine, è importante notare che noduli tumorali intraepatiche risultanti dalla iniezione di cellule nella milza possono selezionareriflettere tivamente sottopopolazioni specifici di cellule capaci di migrazione dalla milza al fegato apertura e successiva tumore.
Durante la generazione di xenotrapianti di tessuti di HCC umano primario, è anche importante per confermare che i xenotrapianti risultanti assomigliano HCC. Abbiamo già dimostrato che può sviluppare linfomi inavvertitamente da leucociti passeggeri all'interno di allo-trapiantate tessuti di HCC umano 21. Abbiamo quindi regolarmente impiegare una CD45 + leucociti umani da sospensioni di cellule tumorali primarie e utilizziamo RT-PCR, citometria a flusso, la valutazione istopatologica, immunoistochimica e di saggiare xenotrapianti di caratteristiche tipiche di HCC. Quando passaging xenotrapianti stabilito per ulteriori studi, cellule murine tumore infiltrante dovrebbero essere esaurite utilizzando un anticorpo contro l'antigene di istocompatibilità del mouse H2K. Se l'applicazione di ricerca prevede l'utilizzo di frammenti di tumore o la misurazione della crescita xenotrapianto, analisi del xenograFTS presso l'endpoint studio dovrebbe includere una valutazione del grado in cui i tumori sono infiltrati dai leucociti e cellule umani mouse.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da una Canadesi Institutes of Health Research Fase 1 Clinico-Scientist Award (AG) e una sovvenzione di funzionamento dal Cancer Research Society (AG). Gli autori sono grati al Dr. John Dick per il suo sostegno di questo progetto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Mod. Eagle Medium/Ham’s F12 50/50 Mix x1(DMEM-F12) | WISENT Bioproducts | 319-075-CL | |
| Collagenase TypeIV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Dispase II | Stemcell Technologies | 7923 | |
| Matrigel Matrix | Becton-Dickinson Biosciences | 354234 | |
| 10 % Buffered Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| 0.9 % Saline Solution (NaCl), sterile | House Brand | 1011-L8001 | |
| Betadine surgical scrub | Purdue Pharma | NPN 00158313 | |
| Buprenorphine (Temegesic) NR 0.3 mg/ml | Reckitt Benckiser | ||
| Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | M60302 | |
| Tear-Gel | Novartis Pharmaceuticals | ||
| Frozen section compound | VWR | 95057-838 | |
| Cryomold, Tissue -Tek | Sakura Finetek | 4566 | |
| Precision Glide Needle 18G 1 ½ | Becton-Dickinson Biosciences | 305196 | |
| Precision Glide Needle 27G ½ | Becton-Dickinson Biosciences | 305109 | |
| Insulin syringe, 3/10 cc U-100, 29G½ | Becton-Dickinson Biosciences | 309301 | |
| Surgical blade No.10 | Feather Safety Razor Co. | 08-916-5A | |
| #5-0 Soft silk surgical suture, 3/8" taper point needle | Syneture | VS-880 | |
| Transpore surgical tape | 3M Health care | 1577-1 | |
| Cotton applicator | Medpro | 018-425 | |
| Surgicel, oxidized regenerated cellulose | Ethicon | 1951 | |
| Cell strainer 100 μm nylon | Becton-Dickinson Biosciences | 352360 | |
| Magnification lighting with mobile base | Benson medical Industries Inc. | model: RLM-CLT-120V | |
| Petridish sterile 100x20 mm | Sarstedt | 821474 | |
| Tissue forcep, 1x2 teeth, 4-1/2" | Almedic | A10-302 | |
| Adson dressing forcep 4-3/4" | Almedic | A10-220 | |
| Eye dressing forcep, serrated, straight, 4" | Almedic | A19-560 | |
| Hartman Hemostatic Forceps, curved, 3-1/2" | Almedic | A12-142 | |
| Iris scissor, curved, 4-1/4" | Almedic | A8-690 | |
| Iris scissor, straight, 4-1/2" | Almedic | A8-684 | |
| Olsen-Hegan needle driver, 5-1/2" | Almedic | A17-228 |
References
- El-Serag, H. B.
- Li, Y., Tang, Z. Y., Hou, J. X. Hepatocellular carcinoma: insight from animal models. Nat. Rev. Gastroenterol Hepatol. 9, 32-43 (2012).
- Tateishi, R., Omata, M. Hepatocellular carcinoma in 2011: Genomics in hepatocellular carcinoma--a big step forward. Nat. Rev. Gastroenterol Hepatol. 9, 69-70 (2012).
- Hoshida, Y., et al. Molecular classification and novel targets in hepatocellular carcinoma: recent advancements. Semin. Liver Dis. 30, 35-51 (2010).
- Ji, J., Wang, X. W. Clinical implications of cancer stem cell biology in hepatocellular carcinoma. Semin. Oncol. 39, 461-472 (2012).
- Villanueva, A., Hernandez-Gea, V., Llovet, J. M. Medical therapies for hepatocellular carcinoma: a critical view of the evidence. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2012).
- Jin, K., et al. Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review. Clin. Transl. Oncol. 12, 473-480 (2010).
- Sausville, E. A., Burger, A. M. Contributions of human tumor xenografts to anticancer drug development. Cancer Res. 66, 3351-3354 (2006).
- Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J. Immunol. 154, 180-191 (1995).
- Ohbo, K., et al. Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the interleukin-2 receptor gamma chain. Blood. 87, 956-967 (1996).
- Fiebig, T., et al. Three-dimensional in vivo imaging of the murine liver: a micro-computed tomography-based anatomical study. PLoS One. 7, e31179 (2012).
- Masters, J. R. Human cancer cell lines: fact and fantasy. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 233-236 (2000).
- Yamashita, T., et al. EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitor cell features. Gastroenterology. 136, 1012-1024 (2009).
- Ma, S., et al. miR-130b Promotes CD133(+) liver tumor-initiating cell growth and self-renewal via tumor protein 53-induced nuclear protein 1. Cell Stem Cell. 7, 694-707 (2011).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13, 153-166 (2008).
- Park, Y. N., et al. Neoangiogenesis and sinusoidal "capillarization" in dysplastic nodules of the liver. Am. J. Surg. Pathol. 22, 656-662 (1998).
- Sigurdson, E. R., Ridge, J. A., Kemeny, N., Daly, J. M. Tumor and liver drug uptake following hepatic artery and portal vein infusion. J. Clin. Oncol. 5, 1836-1840 (1987).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3, 1167-1170 (2008).
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas. Am. J. Pathol. 176, 2-13 (2010).
- Zhang, D. Y., Friedman, S. L.
- Chen, K., Ahmed, S., Adeyi, O., Dick, J. E., Ghanekar, A. Human solid tumor xenografts in immunodeficient mice are vulnerable to lymphomagenesis associated with Epstein-Barr virus. PLoS One. 7, e39294 (2012).
