Methodenartikel

Manuelle Isolierung von Fettgewebe gewonnene Stammzellen aus menschlichen Lipoaspirates

DOI:

10.3791/50585

⸱

26. September 2013

 ,  ,  ,  , 
1Cytori Therapeutics Inc, 2Division of Cardiac Surgery, Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 3Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 4Department of Orthopedic Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 5Regenerative Bioengineering and Repair Laboratory, David Geffen School of Medicine at UCLA

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Im Jahr 2001 beschrieben Forscher an der UCLA die Isolierung einer Population von adulten Stammzellen, sogenannte Fettgewebe gewonnene Stammzellen oder ASC, aus dem Fettgewebe. Dieser Artikel beschreibt die Isolierung des ASC aus lipoaspirates mit einem manuellen, enzymatische Verdauung mit Kollagenase-Protokoll.

Zusammenfassung

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Im Jahr 2001, Forscher an der University of California, Los Angeles, beschrieben die Isolierung einer neuen Population von adulten Stammzellen aus Fettgewebe liposuctioned, die sie anfangs genannt Verarbeitete Lipoaspirate Cells oder PLA-Zellen. Seitdem haben diese Stammzellen aus Fettgewebe gewonnenen Stammzellen oder ASC umbenannt und gegangen auf einer der beliebtesten adulten Stammzellen-Populationen in den Bereichen Stammzellforschung und der regenerativen Medizin zu werden. Tausende von Artikeln werden nun die Verwendung von ASC in einer Vielzahl von Tiermodellen regenerative, einschließlich der Knochenregeneration, periphere Nervenreparatur und Herz-Kreislauf-Engineering. Aktuelle Artikel haben begonnen, die Vielzahl von Anwendungen für ASC in der Klinik zu beschreiben. Die in diesem Artikel gezeigten Protokoll beschreibt das grundlegende Verfahren für manuell und enzymatisch ASC Isolierung von großen Mengen von lipoaspirates von kosmetischen Verfahren erhalten. Dieses Protokoll kann leicht nach oben oder unten skaliert werden, um Unterkunftsaß das Volumen der lipoaspirate und kann auf ASC aus dem Fettgewebe durch abdominoplasties ähnlichen Verfahren erhalten zu isolieren.

Einleitung

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Im Jahr 2001 wurde eine mutmaßliche Bevölkerung von multipotenten Stammzellen aus Fettgewebe in der Zeitschrift Tissue Engineering 1 beschrieben. Diese Zellen wurden die Namen Verarbeitete Lipoaspirate-oder PLA-Zellen aufgrund ihrer Ableitung aus verarbeitet lipoaspirate Gewebe durch kosmetische Chirurgie erhalten gegeben. Die in diesem Artikel beschriebenen Isolationsmethode wurde auf bestehende enzymatische Strategien für die Isolierung des Stroma-Kreislauf-Fraktion (SVF) aus dem Fettgewebe 2 basiert. Die SVF wurde als minimal verarbeiteten Population von roten Blutzellen, Fibroblasten, Endothelzellen, glatten Muskelzellen, Perizyten und Präadipozyten, die noch nicht zu einem Gewebekultur-Substrat 2, 3 haften definiert. Kultivierung dieser SVF über die Zeit wird vorgeschlagen, beseitigen viele dieser kontaminierenden Zellpopulationen und führen zu einer haftenden, Fibroblastenpopulation. Diese Fibroblasten wurden in der Literatur für die letzten 40 Jahre nicht als zuvor identifiziert wordenAdipozyten. Allerdings zeigten unsere Forschungsgruppe, dass diese Zellen besaß mesodermalen Multipotenz und als PLA Zellen umbenannt haft SVF Bevölkerung. Nachfolgende Studien von zahlreichen anderen Forschungsgruppen haben auf dieses Potential gegeben, was darauf hindeutet, sowohl endodermale und ektodermalen Potentiale (für eine Übersicht siehe 4). Seit dieser Zeit wurden zahlreiche zusätzliche Bedingungen für diese Zellen in der Literatur erschienen. Um irgendeine Art von Konsens zu schaffen, wurde der Begriff Fettgewebe gewonnene Stammzellen oder ASC in der 2. Jahres IFATS Konferenz angenommen. Als solche wird der Begriff ASC in diesem Artikel verwendet werden.

Die in diesem Artikel beschriebenen Protokoll ist ein relativ einfaches Verfahren, das Standard-Laborausrüstung erfordert und verwendet einfache Reagenzien wie Phosphor-Kochsalzlösung, Standard-Gewebekulturmedien und Reagenzien Kollagenase. Es kann abhängig von der Menge des Ausgangs Fettgewebe Volumen und anschließende c eine große Anzahl von ASCs erzeugenulture Zeit. Jedoch kann die Verarbeitung solcher großen Mengen von Fettgewebe einige physikalische Probleme, die bis zu einem Grad unter Verwendung dieses Protokolls begrenzt werden könnten präsentieren. Darüber hinaus hat dieses Protokoll erfordern sterile Gewebekultureinrichtungen und genehmigt Biosicherheit Hauben, wodurch die Verwendung eines zugelassenen Gewebekultur-Anlage erforderlich. Diese Anforderung kann auch den Nutzen der Bevölkerung zu verringern ASC in der klinischen Anwendung, sofern sie nicht in der guten Herstellungspraxis (GMP) zugelassenen Anlagen zur Isolierung und Ausdehnung von Materialien für den klinischen Einsatz konzipiert isoliert werden. Als Alternative würde automatisierte Systeme, die ASC in einem geschlossenen System im Operationssaal zu isolieren, können diese Schlüsselfrage zu vermeiden und ermöglichen den sofortigen Einsatz von ASC, ohne dass für die anschließende In-vitro-Expansion. Bisher gibt es sechs automatisierten Systemen, die für die Isolation von Zellen aus menschlichem Gewebe sind im Handel erhältlich. Diese Systeme können machen es möglich, ein isolierenerhebliche Anzahl von ASC von großen Mengen an Fettgewebe unmittelbar nach ihrer Ernte. Diese ASC konnte dann in den Patienten für eine Vielzahl von regenerativen Zwecken ohne dass der Patient jemals den Operationssaal verlassen wieder eingeführt werden. Zusätzlich zu diesem Protokoll die manuelle Trennung der ASC beschreibt, ist ein Protokoll für die automatisierte Isolierung von ASC mit dem Celution-System auch in einem Begleitartikel gegeben.

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Protokoll

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Die hier gezeigte Protokoll beschreibt die manuelle Trennung der ASC aus lipoaspirates durch kosmetische Eingriffe mit enzymatische Verdauung und Differenz Zentrifugation erhalten. Dieses Protokoll wurde zunächst in der Zeitschrift Tissue Engineering im Jahr 2001 ein, veröffentlicht in der die resultierenden Zellen wurden verarbeitet Lipoaspirate Cells-oder PLA-Zellen aufgrund ihrer Isolation von lipoaspirates genannt. Allerdings hat der Begriff PLA Zelle nun mit dem Begriff Fettgewebe gewonnene Stammzellen oder ASC, um das Feld eine Art von Übereinstimmung in Bezug auf die Nomenklatur geben ersetzt. Die Zellen durch dieses Protokoll isoliert wurden von vielen gezeigt, dass mesodermalen Potenzial sowohl in vitro als auch in vivo besitzen (für eine Übersicht siehe 4). Darüber hinaus haben die ektodermalen und endodermalen Potentiale der ASC ebenfalls erforscht 4 ist. Die Isolationstechnik ist einfach und unkompliziert und erfordert etwa eine Stunde in Anspruch. Die resultierende Zells werden unter Standardgewebekulturbedingungen kultiviert. Mit Kultur der Zeit wird der ASC Bevölkerung homogener, von Fibroblasten, die sich leicht erweitern und zeigen eine gute Rentabilität über den langfristigen in der Kultur zusammen.

Hinweis: Die folgenden Teile der Ausrüstung, die benötigt werden, werden am Ende dieses Artikels aufgelistet. Alle Glaswaren, Medien und Reagenzien werden durch Autoklavieren sterilisiert oder durch 0,22 um-Filter gefiltert werden. Aseptische Gewebekulturtechniken müssen immer beachtet werden. Um dies zu gewährleisten, sollten alle in der biologischen Sicherheitsschrank gestellt Materialien durch Besprühen mit einer 70% igen Ethanollösung und Abwischen mit Papiertüchern sauber sterilisiert werden.

1. Vor der Ernte, bereiten Sie die folgenden:

  1. Sterile 1X phospho-gepufferter Salzlösung (PBS) zum Waschen der lipoaspirates. Vorbereitung etwa 1 l 1x PBS auf 100 ml lipoaspirate. Autoklavieren des PBS und alleow auf Raumtemperatur abkühlen. Optional kann Antibiotikum / Antimykotikum in einer Endkonzentration von hinzugefügt: 100 IU / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 2,50 &mgr; g / ml Amphotericin B, sobald die PBS abgekühlt.
  2. Sterile von 0,075 bis 0,1% Collagenase Typ IA (von Clostridium histolyticum) für die enzymatische Verdauung der lipoaspirate. Dh Rohöl vs gereinigt - Konzentration wird auf die Qualität und Herkunft des Collagenase ab. Andere Kollagenase Typen verwendet (zB Collagenase Typ II oder IV) bei ähnlichen Konzentrationen werden. Planen in 1x PBS und Sterilfilter mit einer 1000 ml-Filtersystem mit einem 0,22 &mgr; m-Filter (Fig. 1A). Jedoch können sterile Glasflaschen mit Flaschenaufsatzfilter versehen, verwendet werden. Vorbereitung und Verwendung bei Raumtemperatur. Kollagenase-Lösungen können für die kurzfristigen bei 4 ° C gelagert, bis sie benötigt werden. Frieren Sie die Collagenase-Lösung, wie es seine Aktivität verringern.
  3. Sterile Control-Medium (CM) für Kollagenase Inaktivierung und Kultivierung des ASC Bevölkerung. Für 500 ml CM, kombinieren Sie die folgenden: 500 ml DMEM (4,5 g / l Glucose, mit L-Glutamin), 50 ml fetales Rinderserum (hitzeinaktiviert), 5 ml Penicillin / Streptomycin (10.000 IE Penicillin, 10.000 ug / ml Streptomycin). Als Option kann 5 ml Amphotericin B (250 &mgr; g / ml Amphotericin B) zugesetzt werden. Sterilfiltration dieses Mediums ist erforderlich, wenn nicht-sterile Reagenzien verwendet werden. Platzieren des CM in einem 37 ° C Wasserbad 30 Min. vor der Verwendung, um das Medium zu erwärmen.
  4. Sterile Glas-und Plastik zur Isolation. Autoklav einen 1.000 ml-Becherglas und auf Raumtemperatur abkühlen. Darüber hinaus haben die folgenden Kunststoffprodukte bereit: aseptische serologischen Pipetten (5 ml, 10 ml und 25 ml), 50 ml Zentrifugenröhrchen, und Gewebekultur-behandelten Kulturschalen.

2. Isolierung von ASC von Lipoaspirates

Die meisten lipoaspirates in einer Bestrebung Behälter (siehe Fig. 1B) gesammelt und kann aus drei unterschiedlichen Schichten aufgebaut sein: 1) eine obere Schicht von Öl durch die Lyse der reifen Adipozyten, 2) eine mittlere Schicht aus Fettgewebe, und 3) Boden, flüssige untere Phase enthält Kochsalzlösung und verunreinigen Zelltypen, wie rote Blutkörperchen (Erythrozyten). Die obere Ölschicht nicht in signifikanten Mengen vorhanden sein. Falls vorhanden, sollte es angesaugt werden, wie Ölverschmutzung der resultierenden ASC Kultur könnte die Lebensfähigkeit der Kultur beeinflussen. Der Boden untere Phase sollte vor der Verarbeitung entfernt werden, um eine Kontamination der Kulturen mit ASC RBCs minimieren. Dies wird in der Mitte, Fettgewebe Schicht, die dann gewaschen werden und enzymatisch verdaut, um ihre Mobilfunk-, Stroma-Kreislauf-Fraktion (SVF) befreien lassen.

  1. Waschen des lipoaspirate: Öffnen Sie die lipoaspirate Container in der Gewebekultur hood und sorgfältig dekantiert die lipoaspirate in eine sterile 1 L Becherglas. Damit die lipoaspirate Schichten zu trennen, bis das Fettgewebe Schicht auch getrennt (Fig. 1B).
    1. Absaugen der Ölschicht (falls vorhanden) mit einer sterilen Glaspipette und die Bodensalz untere Phase mit einer 10 ml serologische Pipette. Dies wird die überwiegende Mehrheit der verunreinigenden roten Blutzellen und Kochsalzlösung zu entfernen.
    2. Bewerten Sie die Volumen der resultierenden Fettgewebe Schicht und fügen sterilen 1x PBS bei gleichem Volumen. Rühren Sie die absaugen mit der Pipette zum Ansaugen, um die lipoaspirate mit dem PBS mischen verwendet. Lassen Sie die beiden Schichten zu begleichen. Wie oben erwähnt, kann die 1x PBS mit Antibiotika / Antimykotika ergänzt werden.
    3. Saugen Sie die untere Phase mit einer 10 ml serologische Pipette.
    4. Fahren Sie mit dem Fettgewebe Bruch waschen, wie in Schritt 2.1.2 beschrieben. und 2.1.3. bis die Fettschicht hat eine gelb / gold Farbe. Saugen Sie the untere Phase ein letztes Mal, so dass die Fettgewebe-Fraktion in das Becherglas. Um eine ausreichende Entfernung der untere Phase zu gewährleisten, damit die Schichten lipoaspirate 5 min nach dem letzten Waschen und vor dem letzten Aspiration zu begleichen.
  2. Enzymatische Verdauung des lipoaspirate: Vorbereiten sterile Kollagenase 1A Lösung, wie oben in einer Filtereinheit beschrieben. Vorbereitung ein Volumen gleich dem der Fettfraktion und Sterilfilter.
    1. Nach der Filtration des Collagenase-Lösung, entsorgen Sie die obere Filtereinheit vorsichtig gießen gewaschen Fettfraktion in die Collagenase-Lösung und die Flasche fest zu schließen.
    2. Platzieren Sie die Kollagenase / Fettmischung in einem 37 ° C Wasserbad und verdauen bei 37 ° C für 30 min. Schwenken Sie die Kollagenase / Fettmischung alle 5-10 min und legen wieder im Wasserbad. Das Fettgewebe Schicht sollte auf eine "glattere" Aussehen (Figur nehmenE 1B), wie die Verdauung abläuft. Weitere Aufschlusszeiten (dh bis zu 2 Stunden) können verwendet werden, wenn das Fettgewebe Schicht scheint immer noch feste Stücke von Fett in sich haben.
  3. Isolierung von ASC: Legen Sie die Kollagenase verdaut / Fettmischung wieder in den Biosicherheitswerkbank. Seien Sie sicher, dass die Filtereinheit mit 70% Ethanol vor der Platzierung wieder in den Schrank zu sterilisieren.
    1. Je 25 ml-Aliquots der untere Phase, die das SVF in sterile 50 ml Zentrifugenröhrchen.
    2. 25 ml CM in jedes Röhrchen. Damit das CM die Kollagenase durch Inkubation bei Raumtemperatur in dem Schrank für 5 min inaktiviert.
    3. Zentrifugieren für 10 min bei 1.200 × g, um die SVF als Pellet gesammelt.
    4. In der biologischen Sicherheitsschrank, saugen Sie den Überstand aus jedem Röhrchen. Achten Sie darauf, die obere Ölschicht und alle schwimmenden Fettzellen werden mit diesem Überstand abgesaugt ( Abbildung 1B).
    5. Vereinige die SVF Pellets in ein Zentrifugenröhrchen unter Verwendung von 30 ml CM und teilen gleichmäßig über zwei neue 50 ml Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge nach Schritt 2.3.3. und saugen die Überstände aus den zwei SVF-Pellets (in Fig. gezeigt).
      Optional: Wenn RBC-Lyse gewünscht, resuspendieren SVF jedes Pellet in 10 ml einer RBC-Lyse-Puffer (160 mM NH 4 Cl) und Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min. Zentrifuge nach Schritt 2.3.3. und saugen Sie die Überstände, die SVF-Pellets (in der Abbildung dargestellt) ergeben.
    6. Kombinieren der beiden SVF Pellets in einem neues Zentrifugenröhrchen mit 5-10 ml CM (Fig. 1B).
    7. Um herauszufiltern, größere Gewebepartikel, pipettieren resuspendiert SVF Pellet auf einen 100 um Sieb-Filter auf einem neuen 50 ml Zentrifugenröhrchen gegeben und lassen Sie durch Schwerkraft filtern.
    8. Pipette Aliquots der resuspendierten(Und gefiltert) SVF Pellet, das die ASC auf Gewebekultur behandelt Kulturschalen. Nachtrag jedes Gericht mit einem entsprechenden Volumen von CM.
    9. Kultur der Zellen in CM für 3-4 Tage bei 37 ° C, 5% CO 2 ohne Medienwechsel.

Nach dieser ersten Kulturperiode kann das Kulturmedium abgesaugt werden und alle verunreinigenden roten Blutzellen leicht durch Waschen mit sterilem 1 × PBS entfernt. Ersetzen Sie mit CM und Kultur weiterhin die ASC nach Bedarf. Die Art der Gewebekulturschale verwendet wird und wie das resuspendierte Pellet SVF unter diesen Schalen verteilt sich auf die Anzahl der Zellen nach herkömmlichen Gewebekultur gewünschten abhängen.

3. Charakterisierung des ASC Bevölkerung: Durchflusszytometrie und multilineärer Differenzierung

Nach der Isolierung sollte Charakterisierung des ASC Bevölkerung durchgeführt werden. Konventionelle Ansätze dafür sind Fluss Zytometrie, die Zelloberflächenantigen CD-Profil der Zellen zu charakterisieren und in vitro Differenzierung der multilineare Differenzierungsfähigkeit zu bestätigen. Während mehrere Linien in ASC beurteilt werden, dieses Protokoll beschreibt die Differenzierung der ASC in Zellen des adipogene, osteogenen und chondrogenen Linien als Mittel zur Bestätigung multilineage mesodermalen Potenziale 5.

In-vitro-Multi-Linien-Differenzierung von ASC

  1. Osteogene Differenzierung von ASC: Vor der Induktion, bereiten osteogenen Medium (OM) wie folgt: Um eine 500 ml Flasche DMEM (4,5 g / ml Glucose) 25,0 ml FBS (5,0% Endkonzentration) und 5,0 ml Penicillin / Streptomycin (10.000 IU / ml und 10.000 mg / ml Endkonzentration, beziehungsweise). Dazu fügen Sie die folgenden osteogenen Induktionsmittel, um die angegebenen Endkonzentrationen: Dexamethason (0,1 uM endg.), L-Ascorbinsäure-2-Phosphat (50,0 uM final) Und β-Glycerophosphat (10,0 mM final).
    1. Vor der Induktion, der Ernte und der Platte der kultivierten ASC in die gewünschte Gewebekulturschale, so dass eine Konfluenz von ca. 50% erreicht wird. Für jeden experimentellen Schale ausplattiert, die Platte eine zusätzliche Schale für eine nicht-induzierte Kontrolle. Kultur über Nacht in CM.
      Hinweis: 50% Konfluenz wird empfohlen, um für die weitere Verbreitung zu ermöglichen, die im Laufe der Induktion auftreten können
    2. Am Tag der Induktion, entfernen Sie das Medium, und fügen Sie die folgenden Schritte aus: OM auf die gewünschten osteogenen Versuchsbrunnen und CM an den Steuer Brunnen. Das Volumen der verwendeten Medien wird auf die Größe des Gewebekulturschale ab. Für 12-Well-Platten, 1,0 ml Medium pro Vertiefung ausreichend. Für 6-Well-Platten, 2,0 ml Medium pro Vertiefung ausreichend. Für 100-mm-Schalen, sollte 10,0 ml Medium pro Schale verwendet werden.
    3. Kultur die Zellen für mindestens 14 Tage mit Änderungen der entsprechenden Medium alle 3-4Tagen. Sehr osteogenen ASC Populationen können Zeichen der extrazellulären Mineralabscheidung so früh wie 7 Tage Induktion zu zeigen.
    4. Osteogene Differenzierung (dh extrazellulären Mineralabscheidung) unter Verwendung eines von Kossa histologische Färbung für Calciumphosphat bestätigt werden. Dieser Fleck wird ein schwarzbrauner Niederschlag Identifizieren der Anwesenheit von extrazellulären Calciumphosphat (siehe Fig. 2) zu erzeugen.
      Um mit von Kossa Reagenz Fleck:
      1. Entfernen Sie die OM aus den experimentellen Zellen und die CM von den Kontrollzellen
      2. Fix die Zellen für 60 min in 4,0% Paraformaldehyd in 1x PBS hergestellt.
      3. Mit 1x PBS waschen Zellen zweimal.
      4. Inkubieren der Zellen mit 2,0% Silbernitrat (in Wasser) in der Dunkelheit für 30 min.
      5. Entfernen Sie das Silbernitrat, waschen zweimal mit destilliertem Wasser und an der Luft trocknen die Zellen.
      6. Expose die Zellen mit UV-Licht für 60 min, um die cal entwickelnphat Niederschlag.
      7. Mit 1XPBS Waschen Sie die Zellen mehrmals.
      8. Gegenfärbung der Zell mit Hämatoxylin, wenn gewünscht.
  1. Adipogenen Differenzierung von ASC: Vor der Induktion, bereiten adipogenen Mittel (AM) wie folgt: Um eine 500 ml Flasche DMEM (4,5 g / ml Glucose) hinzufügen, 50,0 ml FBS (10,0% Endkonzentration) und 5,0 ml Penicillin / Streptomycin (10.000 IU / ml bis 10.000 &mgr; g / ml Endkonzentration, beziehungsweise). Dazu fügen Sie die folgenden adipogene Induktionsmittel, um die angegebenen Endkonzentrationen: Dexamethason (1,0 uM endg.), 3-Isobutyl-1-Methylxanthin (IBMX - 0,5 mM final), Indometacin (0,2 mM final) und Insulin (10,0 uM final ).
    1. Vor der Induktion, der Ernte und der Platte der kultivierten ASC in die gewünschte Gewebekulturschale, so dass eine Konfluenz von ca. 80% erreicht wird. Für jeden experimentellen Schale plattiert, Platte einen Zusatzal Schale für eine nicht-induzierte Kontrolle. . Kultur über Nacht in CM Hinweis: adipogenen Differenzierung der ASC zu sein scheint effizienter mit erhöhten Konfluenz.
    2. Am Tag der Induktion, entfernen Sie das Medium, und fügen Sie die folgenden: AM auf die gewünschten osteogenen Versuchsbrunnen und CM an den Steuer Brunnen. Das Volumen der verwendeten Medien wird auf die Größe des Gewebekulturschale ab. Für 12-Well-Platten ist 1.0.ml Medium pro Mulde ausreichend. Für 6-Well-Platten, 2,0 ml Medium pro Vertiefung ausreichend. Für 100-mm-Schalen, sollte 10,0 ml Medium pro Schale verwendet werden.
    3. Kultur die Zellen für mindestens 14 Tage mit Änderungen der entsprechenden Medium alle 3-4 Tage. Sehr adipogene ASC Populationen können Zeichen der Lipid Vakuolenbildung so früh wie 7 Tage Induktion zu zeigen.
    4. ASC zogen adipogene Differenzierung wird mehrere Lipid-Vakuolen, die leicht unter dem Lichtmikroskop sichtbar gemacht werden können, zu entwickeln. Zusätzlich kann adipogenen Differenzierungmit einem Oil Red O histologische Fleck, die in diesen Vakuolen ansammeln wird (siehe Abbildung 2) bestätigt werden.
      Um mit Oil Red O Fleck:
      1. Entfernen Sie die Medien aus den Versuchs-und Kontrollzellen und lösen für 60 min mit einer 10% formalen Kalzium Fixiermittel. Um dieses Fixiermittel vorzubereiten, kombinieren die folgende: 1,0 g CaCl 2, 25,0 ml 16% Paraformaldehyd (4,0% endg.) und 75,0 ml destilliertem Wasser.
      2. Mit 1x PBS Waschen Sie die Zellen zweimal.
      3. Mit 70% Ethanol Waschen Sie die Zellen kurz.
      4. Inkubieren der Zellen bei Raumtemperatur für 5 min mit Oil Red O-Lösung. Um die Oil Red O-Lösung löst hierzu 2,0 g Oil Red O-Pulver in 50,0 ml 70% Ethanol und 50,0 ml Aceton.
      5. Mit Leitungswasser waschen Sie die Zellen mit 70% Ethanol und dann.
      6. Visualisieren Sie die Zellen bald nach Färbung durch Ausbleichen der Färbung mit der Zeit.
  1. Chondrogene Differenzierung von ASCs: chondrogene Differenzierung wird durch ein High-Density-Kultur-Technik als "Mikromassenkultur" bezeichnet erreicht. Vor Kultur, bereiten Chondrogene Medium (CHM) wie folgt: Um eine 500 ml Flasche DMEM (4,5 g / ml Glucose) 5,0 ml FBS (1% Endkonzentration) und 5,0 ml Penicillin / Streptomycin (10.000 IE / ml und 10.000 &mgr; g / ml Endkonzentration, beziehungsweise). Dazu fügen Sie die folgenden chondrogene Induktion Mittel, um die angegebenen Endkonzentrationen: L-Ascorbinsäure-2-Phosphat (50,0 pg / ml final), Insulin (6,25 ug / ml final), Transferrin (6,25 ug / ml final) und TGF &bgr; 1 (10,0 ng / ml).
    1. Ernte der ASCs und Zentrifuge für 5 min bei 1.200 × g, um die Zellen zu pelletieren. Zählen der Zellen, um die Dichte der Zellsuspension zu bestimmen.
    2. Um die Micromass-Pellets herzustellen, bereiten zwei Zellsuspensionen: eine in ChM bei einer Dichte von 1 x 10 7 Zelle hergestellt experimentellen Suspensions / ml und eine in cm bei einer Dichte von 1 x 10 7 Zellen / ml hergestellt Kontrollsuspension.
      1. Platzieren 10,0 ul "Tröpfchen" der Zellsuspension in einzelne Vertiefungen einer Multi-Well-Platte. Ermöglichen, für 2-3 Stunden bei 37 ° C anhaften
      2. Vorsichtig überlagern die plattierten Tröpfchen entweder mit ChM oder CM man aufpassen, nicht, um die Zellen zu distanzieren.
      3. Kultur die Zellen für bis zu 14 Tage im ChM oder CM mit Veränderungen in Medium alle 3-4 Tage. Zellen in ChM kultiviert wird in dieser Zeit zu kondensieren, um eine mit hoher Dichte Micropellets mit wenig bis gar keine Zellen in einer Monoschicht umgibt. Kontrollzellen gezüchtet werden diesen kondensieren, und viele werden als Monoschicht gefunden werden.
      4. Um Chondrogenese bestätigen, korrigieren die Pellets für 15 min in 4,0% Paraformaldehyd (in 1x PBS) bei Raumtemperatur. Fleck auf die Anwesenheit von sulfatierten Proteoglykanen Verwendung eines histologischen Alcianblau-Färbung.
        Um Flecken mit Alcianblau:
        1. Waschen Sie die paraformaldehyde fest Pellets einmal in 1x PBS.
        2. Inkubieren der Pellets in 0,1 N HCl (pH 1,0) für 5 min auf ihre pH-Wert abzusenken.
        3. Entfernen Sie die HCl und fügen 1% Alcianblau Reagenz (in 0,1 N HCl, pH 1,0) hergestellt. Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur.
        4. Entfernen Sie die Alcianblau Reagenz und waschen Sie die Pellets mit 0,1 N HCl (pH 1,0), um überschüssigen Farbstoff zu entfernen.
        5. Zusätzliche Waschanlagen mit Leitungswasser verwendet werden, um Hintergrundfärbung zu reduzieren.
        6. Als Alternative können die Micropellets geerntet werden über Nacht in 10% Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und die Abschnitte für Alcianblau angefärbt.

4. Durchflusszytometrische Charakterisierung von ASC

Charakterisierung der Zelloberflächenantigen CD-Profil kann durch konventionelle Durchflusszytometrie erfolgen.

  1. Vorbereitung der ASC für die Durchflusszytometrie: VorAnalyse, bereiten eine Durchflusszytometrie Buffer (FCB) wie folgt zusammen: 1,0% BSA, 2,0% FBS und 0,025% Saponin in PBS 1x vorbereitet.
    1. Ernten Sie die ASC und Zentrifugieren der Zellen für 5 min bei 1.200 xg, um ein Pellet zu produzieren.
    2. Resuspendieren der Zellen in sterile 1XPBS und zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer. Bestimmung der Zelldichte der Suspension.
    3. Teilen Sie die Suspension bis in Aliquots von 5 x 10 5 Zellen Gesamt-und Zentrifuge pelletieren.
    4. Entfernen Sie den Überstand PBS und fixieren die Zellen für 60 min bei -20 ° C mit einem Überschuss von eiskaltem 70% Ethanol. Falls erforderlich, können diese Zellen in diesem 70%-igem Ethanol in einem -20 ° C-Gefrierschrank gelagert, bis sie benötigt werden.
    5. Nach der Fixierung, sorgfältig absaugen Ethanol und vorsichtig waschen das Pellet zweimal mit einem Überschuss von FCB. Zum Waschen:
      1. In einem Überschuß des FCB und sanft das Pellet.
      2. Zentrifugieren für 5 min bei 1.200 xg, um die Zellen zu sammeln einsa Pellets.
      3. Vorsichtig absaugen FCB Stand.
      4. Wiederholen.
    6. Entfernen des endgültigen FCB Waschüberstand aus jedem Aliquot und Resuspension in 100 &mgr; l des FCB. Fügen Sie die gewünschten Fluorochrom-konjugierte primäre Antikörper mit vom Hersteller empfohlenen Verdünnung. Die Zellen auf Eis inkubieren mit dem Antikörper 30 min.
      Hinweis: Wenn Fluorochrom-konjugierte primäre Antikörper nicht verfügbar sind, können nicht-konjugierte primäre Antikörper verwendet werden.
    7. Für jedes Fluorochrom (zB FITC, PE), Inkubation eines Aliquots der Zellen mit 100 ml enthält FCB Isotyp-IgG als Negativkontrolle.
    8. Inkubieren eines Aliquots in 100 ml FCB enthält keine Antikörper als zusätzliche Kontrolle.
    9. Zwei Mal waschen jedem Aliquot Zelle mit FCB wie in Schritt 4.1.5 beschrieben. Nach dem letzten Wasch resuspendieren Aliquots in 100 ml des FCB und fahren Sie mit Flussanalyse.
      Hinweis: Wenn nicht konjugierten Primärantikörper wurden verwendet: Danach Waschschritt bebrüten die Aliquots auf Eis für 20 min mit dem FCB ergänzt mit der entsprechenden Fluorochrom-konjugierten sekundären Antikörper mit vom Hersteller empfohlenen Verdünnung. Waschen zweimal wie in Schritt 4.1.5 beschrieben.
  2. Flussanalyse von ASC: Für Flow-Analyse, sollte ein Minimum von 10.000 Ereignisse gezählt werden. Ungefärbt und Isotyp-Kontrollen sollten verwendet werden, um Tore durch Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC) eingestellt werden. Zu diesem Zweck sollte die keine Antikörper Kontrollen (dh ungefärbt) von Schritt 4.1.8 um Schmutz und tote ASCs beseitigen verwendet werden. Die Isotyp-IgG Kontrollen von Schritt 4.1.7. sollte verwendet werden, um Bereiche der positive Fluoreszenz einzurichten.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Protokoll Umriss oben beschrieben, eine manuelle, enzymatische Verfahren zur Isolierung eines SVF aus einem großen Volumen lipoaspirate Probe. Innerhalb dieses SVF gibt zahlreiche Zellpopulationen, einschließlich der ASC. Zahlreiche Studien schlagen vor, dass die Kultivierung dieses SVF unter Standard-Zellkulturbedingungen für eine haft Fibroblasten-Bevölkerung, die hauptsächlich aus der ASC-Typ zusammengesetzt werden soll. In Übereinstimmung damit haben wir gezeigt, mittels Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenz...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fettgewebe für die Isolierung von ASC kann in vielen Formen: von festen Stücken von Gewebe durch Resektion oder Fettabsaugen, um kleinere Stücke entweder durch Extraktion oder Spritze Saug-assistierte Fettabsaugung (Liposuktion dh) erhalten wird. Ob mehr SVF Zellen (und damit ASC) aus resezierten oder Fettgewebe abgesaugt Proben erhalten werden, ist unklar, wie widersprüchliche Studien vorgestellt wurden 16, 17. Es ist möglich, dass entweder Form von Fettgewebe ist mehr als geeignet für die Isolierun...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren dieser Handschrift sind Miterfinder auf einem Patent von The Regents der Universität von Kalifornien und Cytori Therapeutics lizenziert gehört.

Danksagungen

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Die Autoren möchten zu erkennen und zu danken, diese zusätzliche Mitarbeiter in der Forschung, die zur Entwicklung der beschriebenen Protokoll und seine Isolierung von ASC, einschließlich beigetragen: Dr. H. Peter Lorenz, MD, Dr. Hiroshi Muzuno, MD, Dr. Jerry Huang, MD Dr. Adam Katz, MD, Dr. William Futrell, MD, Dr. Rong Zhang, DDS, PhD, Dr. Larissa Rodriguez, MD, Dr. Alfonso Zeni, PhD, und Dr. John Fraser, PhD. Die vorgestellten Ergebnisse wurden finanziert, zum Teil durch Forschungsstipendien von den National Institutes of Health, einschließlich der NIAMS und NIDCR Institute.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
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Reagenz
DMEM (Dulbecco’ s Modifikation von Eagle’ MediatechCellgro10-013-CVmit 4,5 g/ml Glukose, L-Glutamin, Natriumpyruvat
Penicillin/StreptomycinMediatech Cellgro30-002-CI10.000 I.E./ml Penicillin/10.000 μ g/ml Streptomycin
Amphotericin BMediatech Cellgro30-003-CF250 μ g/ml Amphotericin B
10X PBS (Phospho-gepufferte Kochsalzlösung)Mediatech Cellgro25-053-CIohne Calcium, ohne Magnesium
Trypsin/EDTAMediatech Cellgro20-031-CV0,25 % Trypsin/2,21 mM EDTA
Kollagenase Typ IA (aus Clostridium histolyticum)SigmaC2674Rohpräparat; < 125 Kollagenaufschlusseinheiten/mg festes
FBS (fötales Rinderserum) hitzeinaktivierteGemini Bioproducts100106USDA-Quelle, hitzeinaktivierte
10 ml serologische PipettenGenesee Scientific12-104
25 ml serologische PipettenGenesee Scientific12-106
50 ml Zentrifugenröhrchen aus PolypropylenGenesee Scientific21-106
100 mm GewebekulturschalenGenesee Scientific25-202
150 mm GewebekulturschalenGenesee Scientific25-203
500 ml Stericup FiltereinheitenMilliporeSCGPU05REPES-Membran, 0,22 μ m pore
ZellsiebeFisherBrand22-363-549100 μ m Nylonnetz
Dexamethason - wasserlöslichSigmaD-2915
L-Ascorbinsäure 2-phosphatSigmaA-8960
β-Glycerophosphat Dinatriumsalz SigmaG-9422auch bekannt als Glycerophosphat
InsulinSigmaI-6634hergestellt aus Rinderpankreas
, IndomethacinSigmaI-7378
Apo-TransferrinSigmaT-4382
TGFβ 1Forschung und Entwicklung D Systems240-B-002rekombinantes
humanes Öl RotO SigmaO-0625
AlcianBlue SigmaA-5268
SilbernitratSigmaS-0319
SalzsäureFisher ScientificA144
ParaformaldehydFisher Scientific30525-89-4als 16 % Lagerbestand geliefert
[Kopfzeile]
Equipment Needed
Klasse II A/B BiosicherheitshaubeThermo Scientificstellt sicher, dass die Haube über Vakuumleitungen für die Aspiration verfügt
TischzentrifugeHermle LabnetZ383Ausschwingrotor für 50 ml Röhrchen erforderlich, geeignet für 1200xg
Wasserbad Fisher Scientific IsotempS52602Q5-10L Kapazität, geeignet für 37C
Automatisierte PipettenhilfenDrummond Pipettenhilfe XL4-000-105
CO2 InkubatorThermo ScientificForma 310mit direkter Hitze oder Wassermantel

Referenzen

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