Im Jahr 2001 beschrieben Forscher an der UCLA die Isolierung einer Population von adulten Stammzellen, sogenannte Fettgewebe gewonnene Stammzellen oder ASC, aus dem Fettgewebe. Dieser Artikel beschreibt die Isolierung des ASC aus lipoaspirates mit einem manuellen, enzymatische Verdauung mit Kollagenase-Protokoll.
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Methodenartikel
Manuelle Isolierung von Fettgewebe gewonnene Stammzellen aus menschlichen Lipoaspirates
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Im Jahr 2001, Forscher an der University of California, Los Angeles, beschrieben die Isolierung einer neuen Population von adulten Stammzellen aus Fettgewebe liposuctioned, die sie anfangs genannt Verarbeitete Lipoaspirate Cells oder PLA-Zellen. Seitdem haben diese Stammzellen aus Fettgewebe gewonnenen Stammzellen oder ASC umbenannt und gegangen auf einer der beliebtesten adulten Stammzellen-Populationen in den Bereichen Stammzellforschung und der regenerativen Medizin zu werden. Tausende von Artikeln werden nun die Verwendung von ASC in einer Vielzahl von Tiermodellen regenerative, einschließlich der Knochenregeneration, periphere Nervenreparatur und Herz-Kreislauf-Engineering. Aktuelle Artikel haben begonnen, die Vielzahl von Anwendungen für ASC in der Klinik zu beschreiben. Die in diesem Artikel gezeigten Protokoll beschreibt das grundlegende Verfahren für manuell und enzymatisch ASC Isolierung von großen Mengen von lipoaspirates von kosmetischen Verfahren erhalten. Dieses Protokoll kann leicht nach oben oder unten skaliert werden, um Unterkunftsaß das Volumen der lipoaspirate und kann auf ASC aus dem Fettgewebe durch abdominoplasties ähnlichen Verfahren erhalten zu isolieren.
Einleitung
Im Jahr 2001 wurde eine mutmaßliche Bevölkerung von multipotenten Stammzellen aus Fettgewebe in der Zeitschrift Tissue Engineering 1 beschrieben. Diese Zellen wurden die Namen Verarbeitete Lipoaspirate-oder PLA-Zellen aufgrund ihrer Ableitung aus verarbeitet lipoaspirate Gewebe durch kosmetische Chirurgie erhalten gegeben. Die in diesem Artikel beschriebenen Isolationsmethode wurde auf bestehende enzymatische Strategien für die Isolierung des Stroma-Kreislauf-Fraktion (SVF) aus dem Fettgewebe 2 basiert. Die SVF wurde als minimal verarbeiteten Population von roten Blutzellen, Fibroblasten, Endothelzellen, glatten Muskelzellen, Perizyten und Präad....
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Protokoll
Die hier gezeigte Protokoll beschreibt die manuelle Trennung der ASC aus lipoaspirates durch kosmetische Eingriffe mit enzymatische Verdauung und Differenz Zentrifugation erhalten. Dieses Protokoll wurde zunächst in der Zeitschrift Tissue Engineering im Jahr 2001 ein, veröffentlicht in der die resultierenden Zellen wurden verarbeitet Lipoaspirate Cells-oder PLA-Zellen aufgrund ihrer Isolation von lipoaspirates genannt. Allerdings hat der Begriff PLA Zelle nun mit dem Begriff Fettgewebe gewonnene Stammzellen oder ASC, um das Feld eine Art von Übereinstimmung in Bezug auf die Nomenklatur geben ersetzt. Die Zellen durch dieses Protokoll isoli....
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Ergebnisse
Das Protokoll Umriss oben beschrieben, eine manuelle, enzymatische Verfahren zur Isolierung eines SVF aus einem großen Volumen lipoaspirate Probe. Innerhalb dieses SVF gibt zahlreiche Zellpopulationen, einschließlich der ASC. Zahlreiche Studien schlagen vor, dass die Kultivierung dieses SVF unter Standard-Zellkulturbedingungen für eine haft Fibroblasten-Bevölkerung, die hauptsächlich aus der ASC-Typ zusammengesetzt werden soll. In Übereinstimmung damit haben wir gezeigt, mittels Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenz.......
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Diskussion
Fettgewebe für die Isolierung von ASC kann in vielen Formen: von festen Stücken von Gewebe durch Resektion oder Fettabsaugen, um kleinere Stücke entweder durch Extraktion oder Spritze Saug-assistierte Fettabsaugung (Liposuktion dh) erhalten wird. Ob mehr SVF Zellen (und damit ASC) aus resezierten oder Fettgewebe abgesaugt Proben erhalten werden, ist unklar, wie widersprüchliche Studien vorgestellt wurden 16, 17. Es ist möglich, dass entweder Form von Fettgewebe ist mehr als geeignet für die Isolierun.......
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Offenlegungen
Die Autoren dieser Handschrift sind Miterfinder auf einem Patent von The Regents der Universität von Kalifornien und Cytori Therapeutics lizenziert gehört.
Danksagungen
Die Autoren möchten zu erkennen und zu danken, diese zusätzliche Mitarbeiter in der Forschung, die zur Entwicklung der beschriebenen Protokoll und seine Isolierung von ASC, einschließlich beigetragen: Dr. H. Peter Lorenz, MD, Dr. Hiroshi Muzuno, MD, Dr. Jerry Huang, MD Dr. Adam Katz, MD, Dr. William Futrell, MD, Dr. Rong Zhang, DDS, PhD, Dr. Larissa Rodriguez, MD, Dr. Alfonso Zeni, PhD, und Dr. John Fraser, PhD. Die vorgestellten Ergebnisse wurden finanziert, zum Teil durch Forschungsstipendien von den National Institutes of Health, einschließlich der NIAMS und NIDCR Institute.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Reagenz | |||
| DMEM (Dulbecco’ s Modifikation von Eagle’ Mediatech | Cellgro | 10-013-CV | mit 4,5 g/ml Glukose, L-Glutamin, Natriumpyruvat |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech Cellgro | 30-002-CI | 10.000 I.E./ml Penicillin/10.000 μ g/ml Streptomycin |
| Amphotericin B | Mediatech Cellgro | 30-003-CF | 250 μ g/ml Amphotericin B |
| 10X PBS (Phospho-gepufferte Kochsalzlösung) | Mediatech Cellgro | 25-053-CI | ohne Calcium, ohne Magnesium |
| Trypsin/EDTA | Mediatech Cellgro | 20-031-CV | 0,25 % Trypsin/2,21 mM EDTA |
| Kollagenase Typ IA (aus Clostridium histolyticum) | Sigma | C2674 | Rohpräparat; < 125 Kollagenaufschlusseinheiten/mg festes |
| FBS (fötales Rinderserum) hitzeinaktivierte | Gemini Bioproducts | 100106 | USDA-Quelle, hitzeinaktivierte |
| 10 ml serologische Pipetten | Genesee Scientific | 12-104 | |
| 25 ml serologische Pipetten | Genesee Scientific | 12-106 | |
| 50 ml Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen | Genesee Scientific | 21-106 | |
| 100 mm Gewebekulturschalen | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 150 mm Gewebekulturschalen | Genesee Scientific | 25-203 | |
| 500 ml Stericup Filtereinheiten | Millipore | SCGPU05RE | PES-Membran, 0,22 μ m pore |
| Zellsiebe | FisherBrand | 22-363-549 | 100 μ m Nylonnetz |
| Dexamethason - wasserlöslich | Sigma | D-2915 | |
| L-Ascorbinsäure 2-phosphat | Sigma | A-8960 | |
| β-Glycerophosphat Dinatriumsalz | Sigma | G-9422 | auch bekannt als Glycerophosphat |
| Insulin | Sigma | I-6634 | hergestellt aus Rinderpankreas |
| , Indomethacin | Sigma | I-7378 | |
| Apo-Transferrin | Sigma | T-4382 | |
| TGFβ 1 | Forschung und Entwicklung D Systems | 240-B-002 | rekombinantes |
| humanes Öl Rot | O Sigma | O-0625 | |
| Alcian | Blue Sigma | A-5268 | |
| Silbernitrat | Sigma | S-0319 | |
| Salzsäure | Fisher Scientific | A144 | |
| Paraformaldehyd | Fisher Scientific | 30525-89-4 | als 16 % Lagerbestand geliefert |
| [Kopfzeile] | |||
| Equipment Needed | |||
| Klasse II A/B Biosicherheitshaube | Thermo Scientific | stellt sicher, dass die Haube über Vakuumleitungen für die Aspiration verfügt | |
| Tischzentrifuge | Hermle Labnet | Z383 | Ausschwingrotor für 50 ml Röhrchen erforderlich, geeignet für 1200xg |
| Wasserbad | Fisher Scientific Isotemp | S52602Q | 5-10L Kapazität, geeignet für 37C |
| Automatisierte Pipettenhilfen | Drummond Pipettenhilfe XL | 4-000-105 | |
| CO2 Inkubator | Thermo Scientific | Forma 310 | mit direkter Hitze oder Wassermantel |
Referenzen
- Zuk, P. A., et al. Multi-lineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-226 (2001).
- Rodbell, M. Metabolism of isolated fat cells. J. Biol. Chem. 239, 375-380 (1964).
- Poznanski, W. ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
