Wir beschreiben ein Protokoll für die Isolierung und Reinigung von Neutrophilen aus Maus-Knochenmark durch Dichtegradientenzentrifugation und Neutrophilen-Kennzeichnung mit CellTracker Farbstoffe. Dies stellt eine einfache, schnelle, reproduzierbare und kostengünstige Methode zur Gewinnung einer großen Anzahl von Neutrophilen für nachgeschaltete funktionelle Studien oder Adoptiv-Transfer-und Tracking-Experimenten.
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Methodenartikel
Isolierung, Reinigung und Kennzeichnung von Knochenmark der Maus Neutrophile für funktionelle Studien und Experimente adoptiven Transfer
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Neutrophile sind kritische Effektorzellen des angeborenen Immunsystems. Sie werden sich schnell an den Standorten der akuten Entzündung rekrutiert und üben Schutz-oder pathogenen Wirkungen in Abhängigkeit von der entzündlichen Milieu. Dennoch ist trotz der unverzichtbaren Rolle von Neutrophilen in Immunität, detailliertes Verständnis der molekularen Faktoren, die Neutrophilen 'Effektor-und immunpathogenen Effekte in verschiedenen Infektionskrankheiten und entzündlichen Erkrankungen vermitteln noch fehlt, teils wegen ihrer kurzen Halbwertszeit, die Schwierigkeiten mit der Handhabung dieser Zellen und der Mangel an zuverlässigen experimentelle Protokolle für den Erhalt ausreichender Zahl von Neutrophilen für nachgeschaltete funktionelle Studien und adoptiven Transfer Experimente. Daher sind einfache, schnelle, kostengünstige und zuverlässige Methoden sehr wünschenswert für die Ernte eine ausreichende Zahl von Neutrophilen Maus für die Beurteilung Funktionen wie Phagozytose, Tötung, Zytokin-Produktion, Degranulation und Menschenhandel. Zu diesem ZweckWir stellen eine reproduzierbare Dichtegradientenzentrifugation-basiertes Protokoll, das in jedem Labor eine große Anzahl von Neutrophilen im Knochenmark von Mäusen mit hoher Reinheit und Lebensfähigkeit isolieren angepasst werden kann. Darüber hinaus präsentieren wir ein einfaches Protokoll, das CellTracker Farbstoffe verwendet, um die isolierte Neutrophile, die dann in adoptiv Empfängermäuse übertragen werden können und verfolgt in mehreren Geweben für mindestens 4 Stunden nach der Übertragung mittels Durchflusszytometrie zu beschriften. Mit diesem Ansatz können Differential Kennzeichnung von Neutrophilen von Wildtyp-und Gen-defizienten Mäusen mit verschiedenen CellTracker Farbstoffe erfolgreich eingesetzt werden, um wettbewerbsfähig Wiederbesiedlung Studien zur Bewertung der direkte Rolle von spezifischen Genen in Menschenhandel von Neutrophilen aus dem Blut in Zielgewebe in vivo durchführen .
Einleitung
Neutrophile sind die häufigsten Leukozyten in den Menschen. Sie sind die wichtigsten zellulären Bestandteil des angeborenen Immunsystems und als erste Verteidigungslinie gegen eindringende Mikroorganismen. Patienten mit Neutropenie und erworbenen primären Immundefekten, die Neutrophilen Zahlen und / oder Funktion beeinflussen entwickeln lebensbedrohlicher invasiver Bakterien-und Pilzinfektionen, die Bedeutung dieser Zellen in Wirtsabwehr 1. Immune Anerkennung eindringende Pathogene am Ort der Infektion durch ihren verwandten Muster-recognition receptors Ergebnisse in der Induktion einer orchestrierten angeborenen Immunantwort, die Sekretion von Lockstoffe,....
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Protokoll
1. Isolierung von Knochenmarkszellen der Maus
- Euthanize Mäusen unter Verwendung des Organs Tierpflege-Ausschuss genehmigten Protokoll und sprühen das Tier Oberfläche mit 70% Ethanol.
- Einen Einschnitt der Haut in der Mitte des Bauches und entfernen Sie die Haut von dem distalen Teil der Maus, einschließlich der Haut, welche die unteren Extremitäten.
- Schneiden Sie die Muskeln der unteren Extremitäten mit einer Schere und sorgfältig verrücken die Pfanne aus dem Hüftgelenk, bei gleichzeitiger Vermeidung Brechen des Femurkopfes.
- Entfernen Sie die restlichen Muskeln aus dem Oberschenkel und Schienbein mit einem Skalpell und Schere u....
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Ergebnisse
Dieses Protokoll ist für die Ernte von Knochenmarkszellen von Mäusen und die anschließende Trennung von Neutrophilen aus diesen Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation mit handelsüblichen Histopaque Zellseparation Medien optimiert. Neutrophile isoliert mit dieser Methode kann für eine Vielzahl von nachgelagerten funktionelle Studien ex vivo und für adoptiven Transfer Experimente in Mäusen Empfänger verwendet werden.
Die typische Ausbeute der Sammlung von Knochenmarkzellen aus be.......
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Diskussion
Hier präsentieren wir eine zuverlässige, einfach, schnell und wirtschaftlich-Protokoll für die Isolierung einer großen Zahl von Neutrophilen aus dem Knochenmark von Mäusen mit hoher Reinheit und Lebensfähigkeit mit einer Dichtegradientenzentrifugation Ansatz. Wenn dieses Protokoll korrekt durchgeführt wird, kann ~ 6-12 × 10 6 Neutrophile von einer nicht infizierten Maus gewonnen werden und bis zu ~ 30-40 × 10 6 Neutrophilen kann aus einer Maus nach der Infektion 6 isoliert werden. Die is.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessen haben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der Abteilung für Interne Forschung des National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), National Institute of Health (NIH), USA unterstützt.
Alle Mäuse wurden an einer amerikanischen Vereinigung für die Akkreditierung von Laboratory Animal Care-akkreditierten Tierhaus am National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) gepflegt und untergebracht in Übereinstimmung mit den Verfahren in den Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren skizzierten unter der Schirmherrschaft eines Protokolls von der Animal Care und Use Committee des NIAID genehmigt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Reagenzien | |||
| RPMI 1640 1X mit L-Glutamin und 25 mM HEPES | Cellgro | 10-041-CV | |
| Fötales Rinderserum (hitzeinaktiviert) | GemCell | 100500 | |
| Penicillin/Streptomycin (10.000 Einheiten Penicillin / 10.000 mg/ml Streptokokken) | GIBCO | 15140 | |
| 0,5 M EDTA-Qualität | Biological Inc | 351-027-101 | |
| 0,2 % und 1,6 % Natriumchlorid | JT Baker | 3624 | Natriumchloridlösungen, die mit destilliertem Wasser hergestellt und steril filtriert |
| werden Steril filtriertes Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Histopaque 1077 muss auf 18-26 ° gebracht werden; C vor dem Gebrauch |
| Sterilfiltriertes Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Histopaque 1119 muss auf 18-26 &Grad; C vor Gebrauch |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) ohne Calcium und Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethylalkohol (200 Promille) | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| CellTracker Green (CMFDA, 5-Chlormethylfluoresceindiacetat) | Invitrogen | C-7025 | Herstellung von Stammlösungen von 10 mM in DMSO, aliquot und Lagerung bei -80 & deg; C |
| CellTracker Orange (CMTMR, 5-(und 6)-4-Chlormethylbenzoylaminotetramethylrhodamin) | Invitrogen | C-2927 | Stammlösungen von 10 mM in DMSO herstellen, aliquotieren und bei -80 & deg lagern; C |
| Anti-Maus CD45 (Klon 30-F11) | eBioscience | 170451-82 | |
| Anti-Maus Ly6G (Klon 1A8) | BD Pharmingen | 551461 | |
| Anti-Maus Ly6G (Klon 1A8) | BD Pharmingen | 560599 | |
| Anti-Maus CD11b (Klon M1/70) | eBioscience | 47-0112-82 | |
| Anti-Maus CD16/CD32 (Maus BD Fc Block) | BD Pharmingen | 553141 | Verwendung bei 1:100 Verdünnung |
| LIVE/DEAD Fixierbar Blue Dead Cell Stain Kit | Molekulare Sonden | L-23105 | Verwendung bei 1:1000 Verdünnung |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma | 67-68-5 | nbsp; |
| Paraformaldehyd-Lösung, 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| Tabelle 1. Reagenzien für die Isolierung, Markierung und Verfolgung von adoptiv übertragenen Neutrophilen. | |||
| Materials | |||
| C57BL/6 Mäuse | Taconic | ||
| 15 ml Zentrifugenröhrchen | Corning | 430053 | |
| 50 ml Zentrifugenröhrchen | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serologische Pipetten | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serologische Pipetten | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serologische Pipetten | Celltreat | 229205B | |
| Pasteurpipetten (3 ml) | BD Falcon | 357575 | |
| 12 ml Spritzen | Kendall monoject | 512878 | |
| 25 G x 5/8 Zoll Nadeln (Präzisions-Gleitnadeln) | BD | 305122 | |
| 100 mm Zellsiebe | BD Falcon | 352360 | |
| Bakterizide Petrischalen | BD Falcon | 351029 | |
| Combitips Plus Biopur | Eppendorf | 2249608-5 | |
| Instrumente zum Präparieren von Mäusen (Schere, Pinzette, Skalpell) | Instrumente für die biomedizinische Forschung | 10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000 | Instrumente, die vor dem Gebrauch sterilisiert werden |
| Ausrüstung | |||
| Gewebekulturhaube | The Baker Company | SG403 | |
| Kühlzentrifuge | Thermo Fischer Scientific | 75004521 | |
| 37°; C Schüttelwasserbad | Thermo Fischer Scientific | 3166721 | |
| Tabelle 2. Liste der in diesem Protokoll verwendeten Materialien und Ausrüstungen. |
Referenzen
- Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M. E., Babior, B. M., Curnutte, J. T. Neutrophils and host defense. Ann. Intern. Med. 109 (2), 127-142 (1988).
- Rot, A., von Andrian, U. H. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annu. Rev. Immunol. 22
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Nachdrucke und Genehmigungen
