Isolierung, Reinigung und Kennzeichnung von Knochenmark der Maus Neutrophile für funktionelle Studien und Experimente adoptiven Transfer

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll für die Isolierung und Reinigung von Neutrophilen aus Maus-Knochenmark durch Dichtegradientenzentrifugation und Neutrophilen-Kennzeichnung mit CellTracker Farbstoffe. Dies stellt eine einfache, schnelle, reproduzierbare und kostengünstige Methode zur Gewinnung einer großen Anzahl von Neutrophilen für nachgeschaltete funktionelle Studien oder Adoptiv-Transfer-und Tracking-Experimenten.

Zusammenfassung

Neutrophile sind kritische Effektorzellen des angeborenen Immunsystems. Sie werden sich schnell an den Standorten der akuten Entzündung rekrutiert und üben Schutz-oder pathogenen Wirkungen in Abhängigkeit von der entzündlichen Milieu. Dennoch ist trotz der unverzichtbaren Rolle von Neutrophilen in Immunität, detailliertes Verständnis der molekularen Faktoren, die Neutrophilen 'Effektor-und immunpathogenen Effekte in verschiedenen Infektionskrankheiten und entzündlichen Erkrankungen vermitteln noch fehlt, teils wegen ihrer kurzen Halbwertszeit, die Schwierigkeiten mit der Handhabung dieser Zellen und der Mangel an zuverlässigen experimentelle Protokolle für den Erhalt ausreichender Zahl von Neutrophilen für nachgeschaltete funktionelle Studien und adoptiven Transfer Experimente. Daher sind einfache, schnelle, kostengünstige und zuverlässige Methoden sehr wünschenswert für die Ernte eine ausreichende Zahl von Neutrophilen Maus für die Beurteilung Funktionen wie Phagozytose, Tötung, Zytokin-Produktion, Degranulation und Menschenhandel. Zu diesem ZweckWir stellen eine reproduzierbare Dichtegradientenzentrifugation-basiertes Protokoll, das in jedem Labor eine große Anzahl von Neutrophilen im Knochenmark von Mäusen mit hoher Reinheit und Lebensfähigkeit isolieren angepasst werden kann. Darüber hinaus präsentieren wir ein einfaches Protokoll, das CellTracker Farbstoffe verwendet, um die isolierte Neutrophile, die dann in adoptiv Empfängermäuse übertragen werden können und verfolgt in mehreren Geweben für mindestens 4 Stunden nach der Übertragung mittels Durchflusszytometrie zu beschriften. Mit diesem Ansatz können Differential Kennzeichnung von Neutrophilen von Wildtyp-und Gen-defizienten Mäusen mit verschiedenen CellTracker Farbstoffe erfolgreich eingesetzt werden, um wettbewerbsfähig Wiederbesiedlung Studien zur Bewertung der direkte Rolle von spezifischen Genen in Menschenhandel von Neutrophilen aus dem Blut in Zielgewebe in vivo durchführen .

Einleitung

Neutrophile sind die häufigsten Leukozyten in den Menschen. Sie sind die wichtigsten zellulären Bestandteil des angeborenen Immunsystems und als erste Verteidigungslinie gegen eindringende Mikroorganismen. Patienten mit Neutropenie und erworbenen primären Immundefekten, die Neutrophilen Zahlen und / oder Funktion beeinflussen entwickeln lebensbedrohlicher invasiver Bakterien-und Pilzinfektionen, die Bedeutung dieser Zellen in Wirtsabwehr ^1. Immune Anerkennung eindringende Pathogene am Ort der Infektion durch ihren verwandten Muster-recognition receptors Ergebnisse in der Induktion einer orchestrierten angeborenen Immunantwort, die Sekretion von Lockstoffe, die eine chemotaktische Gradienten in der Lage Recruiting Neutrophilen aus der Blutbahn in das entzündete Gewebe ² Leads zu generieren . Nach Neutrophilen Ort der Infektion geben, sie aktiviert werden, führt das zu Zytokin-und Chemokin-Produktion, pathogen-Aufnahme, und die Tötung durch oxidative und nicht-oxidative michchanismen ^3. Neben ihrer allgemein anerkannten Rolle in der angeborenen Immunität, haben Neutrophilen auch vor kurzem gezeigt, dass eine wichtige Rolle als Initiatoren der effektiven adaptive Immunantworten ⁴ spielen. Auf der anderen Seite, abgesehen von ihrer protektiven Immunität in Rollen kann auch Neutrophile vermitteln Gewebeverletzung und Immunpathologie durch übermäßige Akkumulation und / oder Aktivierung an entzündeten Stellen, wie sie in einer Vielzahl von Infektions-und Autoimmunerkrankungen ^5-7 gezeigt.

Trotz der unverzichtbaren Rolle der Neutrophilen bei der Montage wirksam angeborenen Immunantwort und ihre pleiotropen Effektor-Funktionen in mehreren Infektionskrankheiten und Entzündungen, technische Schwierigkeiten mit der Handhabung dieser Zellen und der Mangel an zuverlässigen experimentelle Protokolle hat die Forschung mit neutrophilen Granulozyten in den letzten Jahrzehnten behindert. Daher sollte die Verwendung von reproduzierbaren Tests zur Isolierung von Neutrophilen weitere Forschung auf Neutrophilen-vermittelte Immunologie erleichterngischen Funktionen ex vivo und in vivo. Bisher wurden verschiedene Verfahren zur Isolierung von Neutrophilen wie Dichtegradientenzentrifugation von menschlichem Blut und Maus Blut oder Knochenmark ^8,9, positive oder negative immunomagnetische Anreicherung von Neutrophilen Maus Blut oder Knochenmark ^10,11 beschrieben wurde, und das Ernten von Neutrophilen aus der Peritonealhöhle von Mäusen nach intraperitonealer Injektion von Thioglycolat oder andere entzündungshemmende Mittel ^12. Obwohl Neutrophilen kann leicht in großen Stückzahlen aus menschlichem Blut isoliert werden, ist diese Methode nicht optimal in den Mäusen infolge des geringen Volumens Mäuseblut die Isolierung von Neutrophilen ausreichend für funktionelle Studien oder adoptiven Transfer Experimente ¹³ ausschließt. Darüber hinaus, obwohl die Ausbeute an Thioglycolat-induzierte Zellen aus der Bauchhöhle größer ist verglichen mit der Maus Blut variiert die Reinheit von Neutrophilen in den entzündlichen Peritoneallavage zwischen60-90%, und die isolierten Neutrophilen zeigen einen aktivierten Phänotyp. Somit erfasst die Zellen unter Verwendung dieses Verfahren nur zur Durchführung funktionelle Untersuchungen aktivierten verwendet werden, nicht aber von nicht stimulierten Neutrophilen, die Maus Bauchhöhle wenigen Neutrophilen im stationären Zustand ^12. Stattdessen wird das Knochenmark ein bequemer Reservoir für die Ernte eine große Zahl von entweder stimulierten oder aktivierten Neutrophilen ^11,14, die dann stromabwärts funktionellen Studien wie Phagozytose Tötung und Degranulation oder für die adoptive Transfer in Empfänger-Mäuse verwendet werden.

Hier beschreiben wir eine einfache und schnelle (~ 2 Stunden)-Protokoll, das eine hohe Ausbeute liefert (~ 6-12 × 10 ⁶ Neutrophile / infizierten Maus oder bis zu 30-40 × 10 ⁶ Neutrophile / infizierten Maus) reines (80 -95%) Neutrophilen mit> 95% Rentabilität aus dem Knochenmark. Diese Methode verwendet handelsübliche Histopaque, die Dichtegradienten Zelle getrennt sindRation Medien aus Ficoll und Natriumdiatrizoat, an Neutrophile aus dem Knochenmark von Mäusen zu trennen. Dieses Verfahren ergibt wesentlich größere Anzahl von Neutrophilen pro Maus im Vergleich zu Blut oder Bauchhöhle, kann es verwendet werden, um Neutrophile von Mäusen sowohl im stationären Zustand oder nach der Infektion gesammelt werden, und es ist einfacher zu Schicht im Vergleich zu der Dichtegradientenzentrifugation Verfahren die diskontinuierliche verwendet Percoll Gradienten, bestehend aus 55% / 65% / 75% Percoll in PBS ^9. Darüber hinaus werden die Zeit und die Ressourcen, die zur reinen Neutrophilen sammeln signifikant im Vergleich zu Neutrophilen Trennung mittels Fluorescence-Activated Cell Sorting verringert. Da auch dieses Verfahren nicht auf einer immunomagnetischen Anreicherungsschritt ist es kostengünstiger und vermeidet die Exposition von Zellen gegenüber der magnetischen Spalte und Antikörper, dh verringert die Wahrscheinlichkeit der Aktivierung von Neutrophilen.

Zusätzlich zur Durchführung funktionelle Studien an isolierten neutrophils ex vivo und adoptiven Transfer von Zellen in Empfängermäuse, dieses Protokoll beschreibt auch ein Verfahren zur Kennzeichnung von isolierten Neutrophilen mit verschiedenen CellTracker Farbstoffe. Differential Kennzeichnung von Neutrophilen von Mäusen verschiedener genetischer Hintergründe können im Leistungssport Wiederbesiedlung Studien für die Verfolgung der übertragenen Neutrophilen im Gewebe des Empfängers Mäusen mittels Durchflusszytometrie, die mechanistischen Einblick in die direkte Rolle bestimmter Gene kann in Menschenhandel von Neutrophilen aus dem Blut angepasst werden Ziel in entzündeten Organen ^6.

Protokoll

1. Isolierung von Knochenmarkszellen der Maus

1. Euthanize Mäusen unter Verwendung des Organs Tierpflege-Ausschuss genehmigten Protokoll und sprühen das Tier Oberfläche mit 70% Ethanol.
2. Einen Einschnitt der Haut in der Mitte des Bauches und entfernen Sie die Haut von dem distalen Teil der Maus, einschließlich der Haut, welche die unteren Extremitäten.
3. Schneiden Sie die Muskeln der unteren Extremitäten mit einer Schere und sorgfältig verrücken die Pfanne aus dem Hüftgelenk, bei gleichzeitiger Vermeidung Brechen des Femurkopfes.
4. Entfernen Sie die restlichen Muskeln aus dem Oberschenkel und Schienbein mit einem Skalpell und Schere und trennen Sie die Oberschenkelknochen von der Tibia im Kniegelenk Ausübung Sorgfalt nicht brechen die Knochen endet. Legen Sie die Knochen in eine Petrischale mit eiskaltem RPMI 1640 1X mit 10% FBS und 1% Penicillin / Streptomycin.
5. Fahren Sie mit den folgenden Schritten unter einer Gewebekultur Kapuze. Nehmen Sie zusätzliche Vorsichtsmaßnahme strengen sterilen Techniken zu halten, um zu vermeiden neutrophil Aktivierung.
6. Spülen Sie jede Knochen mit 70% Ethanol (in einer Petrischale) durch drei nachfolgenden Wäschen in eiskaltem sterilem PBS (in Petrischalen) abzuspülen das Ethanol von der Oberfläche der Knochen gefolgt.
7. Innerhalb einer sauberen sterilen Petrischale, schneiden Sie die Epiphysen der Knochen und halten Sie sie beiseite.
8. Verwenden Sie eine 25-Gauge-Nadel und eine 12-ml-Spritze mit RPMI mit 10% FBS und 2 mM EDTA ergänzt gefüllt und bündig die Knochenmarkzellen von beiden Enden der Knochen Wellen auf einem 50 ml Falcon-Röhrchen mit Schraubverschluss mit 100 um ausgestattet filtern. Um effizient zu entfernen alle Zellen, kratzen die innere Oberfläche des Knochens unter Verwendung des 25-Gauge-Nadel.

HINWEIS: Blanchieren der Knochen zeigt, dass die Zellen wurden ausreichend abgeschabt.

HINWEIS: Verwenden Sie ca. 10 ml Medium, um einen Oberschenkelknochen / Paar Schienbein zu spülen. Hinzufügen von EDTA zu dem Medium ist wichtig, um zu verhindern Verklumpung der Zellen.

9. Schneiden Sie die Knochen Epiphysenin kleinen 0,5-1 mm ³ Stück mit einem Skalpell und zerschlagen sie durch die 100 um-Filter mit dem Back-End einer 2,5 ml Eppendorf Combitip plus Biopur Pipettenspitze.
10. Zentrifuge bei 1.400 rpm für 7 min bei 4 ° C.
11. Lyse der roten Blutkörperchen durch das Zellpellet in 20 ml 0,2% NaCl für etwa 20 Sekunden, gefolgt von der Zugabe von 20 ml 1,6% NaCl. (Critical: Überschreiten Sie nicht 20-30 sec von hypotonen Lyse Knochenmark Zelltod zu vermeiden Der Einsatz von hypotonen NaCl zur Lyse über ACK Lysepuffer wird empfohlen, da die letzteren hat das Potenzial, um die Neutrophilen zu aktivieren.).
12. Zentrifuge für 7 min bei 1.400 rpm bei 4 ° C zu sammeln die Zellen.
13. Waschen der Zellen mit RPMI 1640 1x mit 10% FBS und 2 mM EDTA supplementiert und Zentrifuge in Schritt 1.12.
14. Die Ausbeute von Knochenmarkzellen mit dieser Methode ist etwa 60 bis 80.000.000 pro infizierten 8-12 Wochen alte C57BL / 6 Maus.

2. Trennung von Neutrophilendurch Dichtegradientenzentrifugation

1. Zählen Sie die Knochenmarkszellen und resuspendieren in 1 ml eiskaltem sterilem PBS.
2. 3 ml Histopaque 1119 (Dichte, 1.119 g / ml) in einem 15-ml konischen Röhrchen.
3. Overlay 3 ml Histopaque 1077 (Dichte 1,077 g / ml) auf die 3 ml Histopaque 1119.

HINWEIS: Histopaque 1119 und 1077 Histopaque sollte auf 18-26 ° C erwärmt werden vor der Verwendung.

Critical Schritt: Bereiten Gradienten unmittelbar vor der Verwendung als Vorbereitung der Gradient im Voraus in Diffusion zwischen den beiden Schichten und suboptimale Neutrophilen Reinheit und Erholung führen.

Critical Schritt: Überlagerung Histopaque 1077 über 1119 muss langsam erfolgen, um zu vermeiden, das Mischen der beiden Dichten, die Trennung von Zellen während der Zentrifugation wird ausgeschlossen.

4. Overlay das Knochenmark Zellsuspension auf der Oberseite des Histopaque 1077.

Critical Schritt: OverlAying das Knochenmark Zellsuspension über Histopaque 1077 muss langsam erfolgen, um zu verhindern, daß die Schnittstelle zwischen den Zellen und Histopaque 1077.

Hinweis: Das Resuspendieren Knochenmarkzellen von einem nicht infizierten Maus in 1 ml PBS ergibt Neutrophilen Reinheit von> 90%. Allerdings Bündelung viele Knochenmarkproben beeinträchtigt Neutrophilen Reinheit, beispielsweise Resuspendieren 300 x 10 ⁶ Zellen in 3 ml PBS verringert die neutrophile Reinheit von> 90% auf ca. 80%. Daher sollten Ermittler führen Pilotversuche, um die idealen Zellzahl / Volumen Bedingungen für ihre spezifische Experimente identifizieren

5. Zentrifuge für 30 min bei 2.000 rpm bei 25 ° C ohne Bremse.

Hinweis: Zentrifugation der Gradienten bei Raumtemperatur ist kritisch und notwendig für eine effektive Trennung der Neutrophilen.

6. Sammeln der Neutrophilen an der Grenzfläche des Histopaque 1119 und 1077 HISTOPAQUE Schichten.
7. Waschen Sie die gesammelten Neutrophilen zweimal mit RPMI 1640 1X mit 10% FBS und 1% Penicillin / Streptomycin und Zentrifuge bei 1.400 rpm für 7 min bei 4 ° C ergänzt
8. Zählen Sie die Neutrophilen und bestimmen ihre Lebensfähigkeit.

HINWEIS: Neutrophile sind typischerweise> 95% lebensfähig und> 90% rein, wie durch FACS-Analyse bestimmt. Die typische Ausbeute von Neutrophilen aus dem Knochenmark (dh 2 Femur und Tibia 2 Knochen) von einem nicht infizierten 8-12 Wochen alte C57BL / 6 Maus ~ 6-12.000.000 Zellen. Diese Zahl ist wesentlich größer als Neutrophilen aus dem Knochenmark von infizierten Tieren geerntet. Daher wurden ~ 30-40000000 Neutrophilen / Maus erholt, als Candida-infizierten Mäusen für Zellernte ⁶ verwendet wurden.

3. Markierung von Neutrophilen Mit CellTracker Dyes

1. Resuspendieren der Neutrophilen bei 5 x 10 ⁶ Zellen / ml in PBS vorgewärmt auf 37 ° C.
2. Fügen Sie einen CellTracker Farbstoff bei einer abschließenden concentration von 5 um.

HINWEIS: CellTracker Green (CMFDA (5-Chlormethylfluorescein Diacetate) und CellTracker Orange (CMTMR (5 - (und-6)-4-Amino Chloromethyl Benzoyl Tetramethylrhodamine) wurde in diesem Protokoll verwendet werden, um unterschiedlich beschriften Neutrophilen von Wildtyp-und Gen-defizienten Mäusen.

HINWEIS: Bereiten Sie eine Stammlösung von 10 mM CellTracker Grüne und CellTracker Orange Aliquot, und bei -80 ° C bis zu dem Tag des Experiments.

3. Inkubieren Neutrophilen mit 5 uM des entsprechenden CellTracker Farbstoff für 10 min bei 37 ° C in einem Schüttelwasserbad bei Dunkelheit.
4. Waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem RPMI 1640 1X mit 10% FBS und 1% Penicillin / Streptomycin.

HINWEIS: Efficient Waschen der Zellen nach der Markierung mit dem Schritt CellTracker Farbstoff ist wichtig, Farbstoff Kreuzkontamination vor dem Mischen unterschiedlich markierten Neutrophilen für Tiefen vermeidentream wettbewerbsfähig Wiederbesiedlung Studien.

4. Adoptiven Transfer von Neutrophilen in Mice and Analysis der übertragenen Neutrophile mittels Durchflusszytometrie

1. Resuspendieren Neutrophilen in eiskaltem PBS in einer Konzentration von 25 x 10 ⁶ Zellen / ml und injizieren 200 ul der Suspension in die laterale Schwanzvene so, dass 5 x 10 ⁶ Neutrophile pro Maus übertragen werden. Aus Wettbewerbsgründen Wiederbesiedlung Neutrophilen Studien, mischen Wildtyp-und Gen-defizienten Neutrophilen im Verhältnis 1:1 und injizieren insgesamt 5 x 10 ⁶ Neutrophile pro Maus wie oben.

HINWEIS: Mindestens bis zu 10 x 10 ⁶ Neutrophilen kann adoptiv pro Maus ohne offensichtliche Toxizität sofort zu den Tieren übertragen.

2. Zu verschiedenen Zeiten nach adoptiven Transfer (z. B. 1, 2, 3 oder 4 Stunden nach der Übertragung), einschläfern Mäusen und Ernte Blut und / oder Knochenmark und / oder anderen Zielorgan (e) von Interesse.
3. Bereiten single Zellsuspensionen aus diesen Geweben für die quantitative und qualitative Analyse der adoptiv übertragen markierten Neutrophilen mit veröffentlichten Protokollen ^6,15.
4. Nach Live / Dead-Färbung und Lebensfähigkeit Fc Blockade, Label-Zellen mit CD45 (Klon 30-F11), Ly6G (Klon 1A8) und CD11b (Klon M1/70) und Tor auf Live-CD45 ⁺ CD11b ^{+ +} Ly6G Neutrophilen. Neutrophile in diesem Tor umfassen nativen neutrophilen Granulozyten des Empfängers Maus sowie die adoptiv übertragen markierten Neutrophilen, die FITC ⁺ (wenn mit CellTracker Grün markiert) oder PE ⁺ (wenn mit den Cell Tracker orange markiert) sind.

HINWEIS: Neutrophile können in Blut, Knochenmark und Nieren von Candida-infizierten Mäusen für mindestens 4 Stunden nach der Übertragung verfolgt werden.

Hinweis: Befestigung mit 2% Paraformaldehyd in PBS nicht nachteilig auf die mittlere Fluoreszenzintensität der Neutrophilen mit CellTracker Gr markierteneen oder CellTracker orange für mindestens 48 Stunden.

Ergebnisse

Dieses Protokoll ist für die Ernte von Knochenmarkszellen von Mäusen und die anschließende Trennung von Neutrophilen aus diesen Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation mit handelsüblichen Histopaque Zellseparation Medien optimiert. Neutrophile isoliert mit dieser Methode kann für eine Vielzahl von nachgelagerten funktionelle Studien ex vivo und für adoptiven Transfer Experimente in Mäusen Empfänger verwendet werden.

Die typische Ausbeute der Sammlung von Knochenmarkzellen aus be...

Diskussion

Hier präsentieren wir eine zuverlässige, einfach, schnell und wirtschaftlich-Protokoll für die Isolierung einer großen Zahl von Neutrophilen aus dem Knochenmark von Mäusen mit hoher Reinheit und Lebensfähigkeit mit einer Dichtegradientenzentrifugation Ansatz. Wenn dieses Protokoll korrekt durchgeführt wird, kann ~ 6-12 × 10 ⁶ Neutrophile von einer nicht infizierten Maus gewonnen werden und bis zu ~ 30-40 × 10 ⁶ Neutrophilen kann aus einer Maus nach der Infektion ⁶ isoliert werden. Die is...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
			Reagenzien
RPMI 1640 1X mit L-Glutamin und 25 mM HEPES	Cellgro	10-041-CV
Fötales Rinderserum (hitzeinaktiviert)	GemCell	100500
Penicillin/Streptomycin (10.000 Einheiten Penicillin / 10.000 mg/ml Streptokokken)	GIBCO	15140
0,5 M EDTA-Qualität	Biological Inc	351-027-101
0,2 % und 1,6 % Natriumchlorid	JT Baker	3624	Natriumchloridlösungen, die mit destilliertem Wasser hergestellt und steril filtriert
werden Steril filtriertes Histopaque 1077	Sigma	10771	Histopaque 1077 muss auf 18-26 ° gebracht werden; C vor dem Gebrauch
Sterilfiltriertes Histopaque 1119	Sigma	11191	Histopaque 1119 muss auf 18-26 &Grad; C vor Gebrauch
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) ohne Calcium und Magnesium	Cellgro	210-40-CV
Ethylalkohol (200 Promille)	The Warner Graham Company	64-17-5
CellTracker Green (CMFDA, 5-Chlormethylfluoresceindiacetat)	Invitrogen	C-7025	Herstellung von Stammlösungen von 10 mM in DMSO, aliquot und Lagerung bei -80 & deg; C
CellTracker Orange (CMTMR, 5-(und 6)-4-Chlormethylbenzoylaminotetramethylrhodamin)	Invitrogen	C-2927	Stammlösungen von 10 mM in DMSO herstellen, aliquotieren und bei -80 & deg lagern; C
Anti-Maus CD45 (Klon 30-F11)	eBioscience	170451-82
Anti-Maus Ly6G (Klon 1A8)	BD Pharmingen	551461
Anti-Maus Ly6G (Klon 1A8)	BD Pharmingen	560599
Anti-Maus CD11b (Klon M1/70)	eBioscience	47-0112-82
Anti-Maus CD16/CD32 (Maus BD Fc Block)	BD Pharmingen	553141	Verwendung bei 1:100 Verdünnung
LIVE/DEAD Fixierbar Blue Dead Cell Stain Kit	Molekulare Sonden	L-23105	Verwendung bei 1:1000 Verdünnung
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Sigma	67-68-5	nbsp;
Paraformaldehyd-Lösung, 4% in PBS	USB Corporation	19943
			Tabelle 1. Reagenzien für die Isolierung, Markierung und Verfolgung von adoptiv übertragenen Neutrophilen.
			Materials
C57BL/6 Mäuse	Taconic
15 ml Zentrifugenröhrchen	Corning	430053
50 ml Zentrifugenröhrchen	BD Falcon	352070
25 ml serologische Pipetten	Celltreat	229225B
10 ml serologische Pipetten	Celltreat	229210B
5 ml serologische Pipetten	Celltreat	229205B
Pasteurpipetten (3 ml)	BD Falcon	357575
12 ml Spritzen	Kendall monoject	512878
25 G x 5/8 Zoll Nadeln (Präzisions-Gleitnadeln)	BD	305122
100 mm Zellsiebe	BD Falcon	352360
Bakterizide Petrischalen	BD Falcon	351029
Combitips Plus Biopur	Eppendorf	2249608-5
Instrumente zum Präparieren von Mäusen (Schere, Pinzette, Skalpell)	Instrumente für die biomedizinische Forschung	10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000	Instrumente, die vor dem Gebrauch sterilisiert werden
			Ausrüstung
Gewebekulturhaube	The Baker Company	SG403
Kühlzentrifuge	Thermo Fischer Scientific	75004521
37°; C Schüttelwasserbad	Thermo Fischer Scientific	3166721
			Tabelle 2. Liste der in diesem Protokoll verwendeten Materialien und Ausrüstungen.