Genetisch kodierte Molecular Probes, um G-Protein-gekoppelte Rezeptoren Studieren

Zusammenfassung

Wir genetisch kodieren die unnatürliche Aminosäure, p-Azido-L-Phenylalanin in verschiedenen gezielten Positionen in GPCRs und zeigen die Vielseitigkeit der Azidogruppe in verschiedenen Anwendungen. Dazu gehören eine gezielte Photo Technologie, um Rückstände in der Ligandenbindungstasche eines GPCR identifizieren und ortsspezifische Modifikation von GPCRs bioorthogonale mit einem Peptid-Epitop-Tag oder fluoreszierende Sonde.

Zusammenfassung

Um strukturelle und dynamische Untersuchungen von G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR)-Signalkomplexe zu erleichtern, sind neue Ansätze erforderlich, um informative Sonden oder Etiketten in exprimierten Rezeptoren, die Rezeptor-Funktion nicht stören, nicht vorstellen. Wir verwendeten Amber-Codon Unterdrückungstechnologie genetisch codieren die unnatürlichen Aminosäure-, p-Azido-L-phenylalanin (AZF) an verschiedenen Positionen in gezielter GPCRs heterolog in Säugerzellen exprimiert. Die Vielseitigkeit der Azidogruppe ist hier in verschiedenen Anwendungen dargestellt, dass GPCRs in ihrer Mutterzellumgebung oder unter Reinigungsmittel gelösten Bedingungen zu studieren. Zuerst zeigen wir eine zellbasierte Zielphototechnik, um die Rückstände in den Liganden-Bindungstasche von GPCR wo ein Tritium-markierten niedermolekularen Liganden mit einem genetisch codierte Aminosäure Azido vernetzt identifizieren. Wir haben dann zeigen, ortsspezifische Modifikation von GPCRs durch die bioorthogonale Staudinger-Ligation Bertozzi Reaktionention, die die Azidogruppe zielt mit Phosphin-Derivate. Wir diskutieren eine allgemeine Strategie zur gezielten Peptid-Epitop-Tagging von exprimierten Membranproteinen in-Kultur und ihrer Erkennung mit Hilfe eines Ganzzell-ELISA-basierten Ansatz. Schließlich zeigen wir, dass AZF-GPCRs selektiv mit fluoreszierenden Sonden markiert werden. Die diskutierten Methoden sind die allgemeinen, in dass sie sich grundsätzlich an jede Aminosäureposition in jedem angewendet werden, ausgedrückt GPCR aktive Signalkomplexe zu verhören.

Einleitung

Heptahelikalen G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) eine Superfamilie von hochdynamischen Membranproteine, die wichtige und vielfältige extrazelluläre Signale zu vermitteln. In der klassischen Paradigma wird Rezeptor-Aktivierung mit Liganden-induzierter Konformationsänderungen gekoppelt. ^{1, 2} Jüngste Fortschritte in der Strukturbiologie von GPCRs haben bedeutende Einblicke in die molekularen Mechanismen der Transmembran-Signalisierung zur Verfügung gestellt. ^3-5 jedoch mit größerer Präzision der chemischen verstehen Funktionsmechanismus und Strukturdynamik von GPCR-Signalisierung wird ein Toolkit Ansätze erforderlich, um informative molekular....

Protokoll

1. Standortspezifische Genetische Einbau von unnatürlichen Aminosäuren in GPCRs

1. Aufrechterhaltung HEK293T-Zellen in DMEM (4,5 g / l Glucose, 2 mM Glutamin), das mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt war, bei 37 ° C in einem 5% CO _{2-Atmosphäre.}
2. Transfektion die Zellen 60-80% Konfluenz in einem 10-cm-Platte mit Lipofectamine Plus-Reagenz gewachsen.
   1. 750 ul DMEM, mit 10 ul Plus-Reagens, 3,5 ug GPCR-cDNA (pMT4. Rho oder pcDNA 3.1. CCR5), der das Amber-Stopcodon an einer gewünschten Position, 3,5 &mgr; g des cDNA-Suppressor-tRNA (pSVB.Yam) und 0,35 ug der mutierten Aminoacyl-tRNA-Synthetase-cDNA für p-Azido-L-phenylalanin

Ergebnisse

Wir beschäftigten die unnatürliche Aminosäure Mutagenese Methode zur ortsspezifisch molekulare Sonden einzuführen in ein GPCR mit der Amber-Codon Unterdrückung Technologie. Das Schema in Abbildung 1 skizziert die wesentlichen Schritte der Methodik und die verschiedenen Anwendungen der Einbeziehung der vielseitige UAA, p-Azido-L-Phenylalanin (AZF) in GPCRs. Die Expression von AZF-GPCRs in Säugerzellen ermöglicht eine gezielte Photoliganden und gezielte Peptid-Epitop-Tagging oder fluoreszierenden.......

Diskussion

Wir beschreiben hier eine robuste Methode zur ortsspezifischen Einbau eines reaktiven Sonde, AZF, in GPCRs und zeigen drei nützliche Anwendungen dieses Werkzeug, um die Struktur und Dynamik von GPCRs zu studieren. Unsere Methode zur ortsspezifisch integrieren UAAs umgeht ein grundsätzliches Problem mit einer alternativen Strategie, die auf chemisch Beschriftung ^{32, 33} oder Anbringen Photovernetzer ³⁴ zu einem einzigen zugänglichen Cystein-Mutante. Obwohl die chemischen Cysteinthiolgruppen Ziel verw.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Plasmid pSVB. Yam			(Ye et al., 2008)
Plasmid pcDNA.RS für azF			(Ye et al., 2009)
Plasmide pMT4.Rho und pcDNA 3.1.CCR5			Enthalten optional das bernsteinfarbene Stoppcodon (TAG) an einer gewünschten Position
HEK 293T-Zellen			Adhärente Zellen
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Gibco	10566
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Gibco	14200
Fötales Kälberserum	Zwillinge Bio-Produkte	100-106
Lipofectamine Plus	Invitrogen	Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015
p-azido-L-phenylalanin	Chem-Impex International	6162
			Tabelle 1. Ortsspezifischer genetischer Einbau von unnatürlichen Aminosäuren in GPCRs-Materialien
Maxima ML-3500S UV-A-Lampe	Spectronics Corporation		azF wird durch 365-nm-Licht aktiviert
Hank's Buffered Salt Solution (HBSS)	Gibco	14065
HEPES	Irvine Scientific	9319
Rinderserumalbumin	Roche	3117405001
Tritium-markierter Ligand			Von einem Mitarbeiter (Grunbeck et al., 2012)
1% (w/v) n-Dodecyl-β-D-Maltosid	Anatrace	D310LA
1D4-Sepharoseharz			1D4 mAb, immobilisiert auf CNBr-aktiviertem Sepharose-2B-Harz
1% (w/v) Natriumdodecylsulfat (SDS)	Fisher Scientific	BP166
NuPAGE Novex 4 - 12% SDS-Gele	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE durchgeführt auf NuPAGE-Gerät
Trans-Blot SD-Gerät	Biorad		Gerät für den halbtrockenen Transfer
Immobilon Polyvinylidendifluorid (PVDF) Membran	Millipore	IPVH00010
Fettfreie Milch	Fisher Scientific	NC9934262
Tween-20	Aldrich	274348
Ecoscint A	National Diagnostics	LS-273	Szintillationsflüssigkeit
Szintillationsfläschchen	Fisher Scientific	333726
LKB Wallac 1209 Rackbeta Flüssigszintillationszähler	Perkin Elmer		Beta-Szintillationszähler
Anti-Rhodopsin 1D4 mAb	National Cell Culture Center	custom
Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugiertes Anti-Maus-IgG	KPL, Inc.	474-1806
SuperSignal West Pico Chemilumineszenz-Substrat	Thermo Scientific	34080
Hyblot CL AR Folie	Denville	E3018
			Tabelle 2. Gezielte Photovernetzungsmaterialien
0,25% Trypsin	Invitrogen	15050065
FLAG-Triarylphosphin	Sigma	GPHOS1
M2 FLAG	mAb Sigma	F1804
anti-CCR5 2D7 mAb	BD Biosciences	555990
Poly-D-Lysin	Sigma	P6407
96-Well-Platte	Costar	3601	Boden, hohe Bindung EIA/RIA
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (Calcium, Magnesium)	Gibco	14040
16% Paraformaldehyd	EMS	28908
HRP-konjugierte	KPL, Inc.	474-1516	;
Anti-Kaninchen-IgG	KPL, Inc.	474-1516	;
Amplex Rot	Invitrogen	A12222
Wasserstoffperoxid	DE Healthcare Products	97-93399
CytoFluor II Fluoreszenz-Multiwell-Platten-Reader	Perseptive Biosystems
			Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials
Fluorescein-phosphine			(Huber et al., submitted 2012)
Nonapeptide (C9 peptide)	AnaSpec	62190	Peptidemime the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310LA
1D4-Sepharoseharz			1D4 mAb, immobilisiert auf CNBr-aktiviertem Sepharose 2B-Harz
NuPAGE Novex 4 - 12% SDS-Gele	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE durchgeführt auf NuPAGE-Gerät
Konfokaler Typhoon 9400 Fluoreszenzscanner	GE Healthcare	eingestellt	Scanner mit 488-nm-Wellenlängenlaser
			Tabelle 4. Fluoreszierende Markierungsmaterialien

, Transparenter