Summary
우리는 마이크로 스케일 세포 자극 실험에 자동 세포 배양 및 심문 플랫폼을 개발했습니다. 플랫폼은 양성 세포의 작은 인구를 자극 분자 분석을위한 해물을 복구하는 간단한 다목적 및 정밀한 컨트롤을 제공합니다. 플랫폼은 물론 귀중한 세포 및 / 또는 시약을 사용하는 연구에 적합합니다.
Abstract
문화의 세포 (체외 분석)의 연구는 복잡한 생물학적 시스템에 중요한 통찰력을 제공하고 있습니다. 생체 분석을위한 기존의 방법과 장비가 잘 밀리미터 규모의 볼륨 (≥ 0.1 ml)에 세포 (≥ 10 5) 다수의 연구 적합합니다. 그러나, 관심 및 / 또는 그들의 문화, 자극, 또는 처리에 필요한 시약 세포의 소비를 줄이기 위해 문화 크기를 확장 할 필요하거나 바람직되는 많은 경우가 있습니다. 불행하게도, 기존의 접근 방식은 마이크로 스케일 문화의 정확하고 재현성 조작을 지원하지 않으며, 현재 사용 가능한 미세 유체 기반의 자동화 된 시스템이 너무 복잡하고 대부분의 실험실에 의해 일상적인 사용을위한 전문입니다. 마이크로 스케일의 볼륨 -이 문제를 해결하기 위해, 우리는 자동화 된 문화, 자극, 세포의 작은 인구 (2,000 세포 100)의 복구를 위해 간단하고 다양한 기술 플랫폼을 개발했습니다S (1 - 20 μL). 이 플랫폼은 마이크로 스케일 문화를 확립, 유지 및 자극하는 내 fibronectin의 코팅 microcapillaries ( "세포 관류 실")의 집합으로 구성되어 "전송"microcapillaries ( "중앙 허브에 장착 된 디지털 마이크로 유체 (DMF) 장치 ")하고 재관류 챔버에서 루트 세포 및 시약되는, 힘의 재관류 챔버와 중앙 허브 사이의 자료 전송 고정밀 주사기 펌프, 어떤, 재료의 전송 제어 기능을 제공하는 전자 인터페이스입니다 조정과 미리 정해진 스크립트를 통해 자동화. 예를 들어, 우리는 박테리아와 도전에 면역 세포에 이끌려 전사 반응의 연구를 촉진하는 플랫폼을 사용했다. 플랫폼의 사용은 우리가, 세포 및 시약의 소비를 줄이는 실험 - 투 - 실험 변동을 최소화 할 수있게하고, 다시 직접 손에 노동. 그것이 부여하는 장점뿐만 아니라 접근성과 다양성, 오 부여UR 플랫폼은 실험실과 응용 프로그램의 다양한 사용을 발견하고 제한된 수량에서 사용할 수있는 세포와 자극의 분석을 용이하게 특히 유용합니다.
Introduction
(체외 분석) 문화 유지 세포의 연구는 복잡한 생물학적 시스템과 인간의 건강을 지배하는 기본 원리와 분자 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 제공하고 있습니다. 문화, 자극, 그리고 페트리 요리의 microtiter 플레이트를 활용 분석을위한 세포의 수집을위한 기존의 방법은 밀리미터 규모의 문화 볼륨의 셀 (≥ 10 5) (≥ 0.1 ml)에 많은 인구 연구를 위해 설계되었습니다. 그러나, 세포의 제한된 양을 사용할 수있는 많은 경우 (예 : 일차 전지), 또는 세포의 작은 집단 (예를 들면 인구를 통해 휴대 전화의 변동성을 줄이기 위해) 바람직한, 또는 필요한 시약 얻기 어렵다 또는 엄청나게 비싼 (예 : 정제 된 세포 분비 인자). 이러한 문제를 성공적으로 배양 크기를 아래로 조정에 의해 해결 될 수있는 모든 소비를 줄이는 이점이 있습니다시약은 체외 분석 1,2에 필요합니다. 불행하게도, 기존의 장비와 방법은 마이크로 스케일의 문화와 3-11이 너무 복잡하고 대부분의 실험실에 의해 일상적인 사용을위한 전문화되어 현재 사용할 수있는 미세 유체 기반의 자동화 된 시스템의 정확하고 재현성 조작을 지원하지 않습니다.
마이크로 스케일 볼륨에서 (1 - 20 μL) -이 보고서에서, 우리는 자동으로 문화, 자극, 세포의 작은 인구 (2,000 세포 100)의 복구를위한 간단하고 다양한 기술 플랫폼의 조립 및 사용을 설명합니다. 피브로넥틴 코팅 microcapillaries는 ( "세포 관류 실"모듈) 마이크로 스케일 문화의 확립, 유지 보수 및 자극에 대한 사이트 역할의 집합, 그리고 디지털 마이크로 유체 (DMF : 플랫폼 아키텍처 (그림 1) 모듈 식 디자인 "전송"microcapillaries ( "중앙 허브"모듈) 14,15 노선 세포 장착) 12,13 장치과하고 재관류 챔버에서 시약. DMF는 사용자가 개별적으로 동시에 여러 방울을 해결하고 장치 하드웨어를 변경하지 않고 조작을 (예 : 재구성 샘플 처리 기차)를 변경하거나 다시 주문 할 수 있습니다. 그 엄청난 유연성 세포 배양 16, 17, 효소 분석 18,19, 면역 20,21, DNA 분석 22,23, 단백질 처리, 24,25 등 다양한 애플리케이션의 핵심 기술로 최근의 출현에 분명하다 임상 검체 처리. 26,27 우리의 중앙 허브는 DMF 장치에 내재 된 유연성을 활용, 더욱 전문화 된 주변 장치의 조작의 일부를 (예를 들어, 세포 배양) 수행 할 기회를 제공 microcapillary 인터페이스의 추가를 통해 향상 오히려 DMF 장치 자체에보다 모듈. 이런 방식으로 처리 열차의 구획화는 괞 찮아의 설계를 단순화TForm 클래스 아키텍처 (모든 처리 단계를 수행 할 수 DMF 장치를 구축 할 필요 없음) 새로운 함수로의 진화를 촉진는 (단순히 필요에 따라 새로운 주변 장치 모듈을 통합)가 필요합니다. 중앙 허브에서 세포 및 시약의 수송은 DMF 장치 13,28 내에 전극을 순차적으로 활성화에 의해 생성 된 힘 전기 습윤에 의해 구동됩니다;에서 전송로 및 재관류 챔버 내에서 고정밀 주사기에 의해 생성 된 압력 변화에 의해 제공됩니다 펌프. 이러한 유체 움직임의 모든 간단한 전자 인터페이스를 통해 제어되고 미리 정해진 스크립트를 사용하여 자동화되어 있습니다.
대표적인 예로서, 우리는 박테리아의 반칙으로 (그림 2)에 따라 면역 세포에 이끌려 전사 반응의 연구를위한 플랫폼을 사용하는 방법을 보여줍니다. 플랫폼에서 이러한 실험을 수행하는 것은 우리가 세포의 작은 숫자 (experimen 당 ~ 1,000 작동 할 수있게탈 조건), 실험 - 투 - 실험 다양성, 보존 시약 및 노동 손에 다시 직접을 최소화합니다. 그것이 부여하는 장점뿐만 아니라 접근성과 다양성을 감안할 때,이 플랫폼은 실험실과 응용 프로그램의 다양한 사용을 발견하고 제한된 수량에서 사용할 수있는 세포와 자극의 분석을 용이하게 특히 유용합니다.
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Protocol
이 일반적인 프로토콜은 연구의 폭 넓은 다양한 플랫폼의 응용 프로그램을 지원하도록 설계되어,이 보고서에서 설명하는 대표적인 연구로 특정 측면은 괄호 밖으로 분리되어 그림 2 프로토콜을 사용하여 수행 대표적인 연구 결과를 보여줍니다.. 프로토콜에서 모든 "지시"명령은 미리 정해진 스크립트를 사용하여 자동화되어 있습니다. 2 단계는 1 단계 (단계 1.7 및 1.8시 등)와 병렬로 수행 할 수도 있습니다, 그 단계 2.1은 종종 무시됩니다 (패턴 / 코팅 DMF 장치 플레이트를 세척하고 재사용 할 수 있기 때문에, 단계 5.2 참조) .
1. 세포 관류 챔버를 조립하고 채우기
- 코트 살균 (멸균) microcapillaries (융합 된 실리카 15cm 길이; 679 μm의 외경, 534 μm의 ID)의 내부 표면 살균 피브로넥틴 용액 (50 ㎍ / ㎖의 30 μl를) 그릴 주사기 펌프를 지시하여 피브로넥틴과 함께, 각에microcapillary,, (37 2 시간 동안 ° C) 잠복기 솔루션을 철회 할 수있는 주사기 펌프를 지시하고, microcapillaries 건조 (6 시간 실온 (RT))시키는.
- CapTite 피팅 (6 재관류 챔버, 8 포트 주사기 펌프)를 사용하여 폴리 카보 네이트 튜브 (500 μm의 외경, 100 μm의 ID) 및 멀티 포트 주사기 펌프 튜브에 각 피브로넥틴 코팅 microcapillary (재관류 챔버)를 연결합니다.
- 테이프를 사용하여 원하는 온도로 설정 열 블록 (37 ° C) 각 재관류 챔버의 본체를 고정합니다.
- 저수지의 재관류 챔버의 열린 끝 (물론 microcentifuge 튜브 또는의 microtiter 플레이트) 신선한 성장 매체에 정지를 포함하는 세포 (P388D.1 쥐 대 식세포) (RPMI 1640, 10 % FBS, 500 단위 / ML 페니실린, 500 μg 빠져 / 원하는 농도 (10 6 세포 / ML)에서 ML 스트렙토 마이신).
- 충분히 AI 다음 각 재관류 챔버에 세포를 (10 μL, 10 4 세포) 그릴 주사기 펌프를 지시R은 열 블록에 고정 섹션에 액체 플러그 (~ 4.5 cm)를 이동합니다.
- 세포 관류 실의 fibronectin의 코팅 내부 표면 (- 2 시간 37 ° C 1)을 준수 할 수 있습니다. 한편, 세포 저수지에서 신선한 성장 매체를 포함하는 새로운 저수지 재관류 챔버의 열린 끝을 전송할 수 있습니다.
- 준수 기간 후에, 낭비 새로운 배지 (10 μL)을 철회하고, 준수를 통해 새로운 액체 플러그 (새로운 배지)를 위치하기에 충분한 공기를 따라 액체 플러그 (에어컨 미디어 및 무소속의 세포)를 보낼 주사기 펌프를 지시 세포.
- 세포 인구가 (- ~ 1,000 세포 / 챔버의 마이크로 스케일의 문화 생성 인구의 24 시간 16) 충분히 평형 및 확장 될 때까지 일정한 간격 (매 2 시간)에서 매체 교환 (즉, 단계를 반복 1.7) 수행을 계속합니다.
2. DMF 장치를 조작하고 허브 아키텍처를 조립
- 이 간격, 작동 전극의 크기 (2.5 mm 2)와 함께 물방울 볼륨 (2.5 μL를 정의 금속 압축 프레임을 사용하여 판 사이 400 μm의 간격을 유지 오목과 폴리머 캐스트 14,30으로 DMF 플레이트를 고정 전극 당). DMF 어셈블리가 단순한 수단 (24)에 의해 수행 할 수 있습니다.
- 삽입 테프론 코팅 전송 microcapillaries (360 μm의 외경, 100 μm의 아이디, 3.5-4.0 ㎝ 길이) DMF 플레이트 사이의 공간에, 그 동족 작동 전극의 가장자리로 확장하는 각각의 위치.
- 반대 EN에각 전송 microcapillary 부착 CapTite 피팅 라.
- ITO 전극에 전압을 공급하는 전원 커넥터를 갖습니다. 전극 활성 시퀀스는 미리 정해진 스크립트를 실행하는 컴퓨터 제어 전자 인터페이스를 사용하여 자동화되어 있습니다.
- 옵션 : 물방울의 추적을 용이하게하기 위해 전하 결합 소자 (CCD) 카메라 (DCR-HC96 (소니, 일본))가 장착 된 현미경의 번역 단계 (SZ-6145TR (올림푸스, 일본))에 조립 DMF 허브로 이동 . 31
3. DMF 허브로 재관류 챔버를 연결하고 세포 집단을 자극
- 중간 저수지에서 재관류 챔버의 열린 끝을 (단계 1.6 참조)를 제거하고 DMF 허브의 전송 microcapillaries (단계 2.4 참조)의 끝 부분에 부착 된 CapTite 피팅에 삽입.
- 낭비 재관류 챔버의 액체 플러그 (에어컨 미디어)를 보낼 주사기 펌프를 지시합니다.
- 이달온 - 보드 저수지에서 (E. 대장균은 0.1 % 플루로 닉 F127 W / V 신선한 배지에서 100 ㎍ / ㎖에서 BioParticles) 자극을 그리고 각 전송 microcapillary에 적절한 크기 (10 μL)의 비말을 제공하기 위해 DMF 허브를 ruct . 온 - 보드 저수지는 원통 모양 구획 (1.5 × 1.5 cm 각)으로 구성되어 있으며 튜브를 통해 DMF 허브에 연결되어 있습니다.
- 자극이 전달 microcapillaries에 연결 그려 재관류 챔버의 세포 집단에 플러그를 배치하기에 충분한 공기를 따라 주사기 펌프를 지시합니다.
- 자극과 세포를 (- 4 시간 37 ° C 1) 품어. 선택 사항 : 정기적으로 신선한 자극 (즉, 단계를 반복 3.2-3.4)에 대한 환율.
4. 자극을 종료 및 분석을위한 세포 용 해물을 복구
- 옵션 : 포스트 자극 기간이 필요한 경우 (즉, 단계를 반복합니다 3.2 새로운 매체에 대한 자극 함유 액체 플러그를 교환 - 3.4) 자극에 대한 새로운 매체를 대체하고, 배양하고 필요에 따라 교환을 계속한다.
- 환율 세척 버퍼 (전주곡 직접 용해 모듈의 버퍼 B) (즉, 단계를 반복 3.2-3.4, 자극에 대한 세척 버퍼를 대체)에 대한 재관류 챔버의 액체 플러그, 그리고 (5 분)이 필요 품어.
- 교환 용해 용액의 액체 플러그 (버퍼 세척) (전주곡 직접 용해 모듈의 버퍼 0.1 % 플루로 닉은 F127 W / V와 함께) (즉, 단계를 반복 3.2-3.4, 자극에 대한 용해 용액을 대체) 및 배양이 필요 (5 분) .
- DMF 허브에 액체 플러그 (세포 용 해물)를 보낼 주사기 펌프를 지시합니다.
- DMF 허브를 분해, DMF 장치 (이것은 물방울 혼합을 초래할 수 있으므로, 옆 판을 기울 않도록주의를 사용하여)의 상판을 제거하고 오프 플랫폼 분석을 위해 Pipetman이나 주사기를 사용하여 해물 (유전자 발현 프로파일을 수집 qPCR의를 통해).
5. 클린 플랫폼 하드웨어다시 사용
- RT에서 10 분 동안 10 %의 표백제에 전송 microcapillaries 및 CapTite 피팅 (물에 v / v)의 몰두, 질소 가스를 이용하여 증류수, 드라이 잘 헹구십시오.
- RT에서 10 분 동안 10 %의 표백제 DMF 장치 플레이트를 담가, 이소프로판올 잘 씻어은 탈 이온수 다음, 건조하여 질소 가스를 10 분 동안 160 ° C에서 베이킹에 의해 따랐다.
- 주사기 펌프의 폴리 카보 네이트 튜브 및 DMF 디바이스의 폴리머 캐스트 및 압축 프레임, 세척하지 않고 다시 사용할 수 있습니다. 재관류 챔버 microcapillaries은 각 실험 후 삭제됩니다.
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Representative Results
자동화 플랫폼의 데모로, 우리는 박테리아 도전 면역 세포의 작은 인구는 마이크로 규모의 문화에서 성장했다하는 연구를 수행하는 데 사용되며 (그림 2 프로 염증 반응의 오프 플랫폼 분석을 위해 용해 ).
여섯 세포 관류 챔버의 각 성장 매체의 10 μL에 현탁 10 4 면역 세포 (P388D.1 생쥐 대 식세포) 씨앗을 품고 있었다. 준수 기간 (37 ℃에서 2 시간 동안 C)와 중간 교환 후 ~ 500 세포는 복제 마이크로 문화 분석 (세포가 킬레이트 치료를 통해 발표 및 계산을 통해 측정 된 각 챔버 (그림 3A)의 내부 표면에 붙어 남아 hemacytometer와 가벼운 현미경을 통해). 2 시간 간격으로 배지 교환 16 시간, 37 ° C에서 추가 배양은 챔버 당 ~ 1,000 세포 (그림 3B) (로 측정 일에 세포 인구를 확대위에서 설명한대로 복제 마이크로 문화)의 거친 분석. 여섯 재관류 챔버 네에서 세포 인구는 E.에 도전했다 대장균 박테리아 (pHrodo의 BioParticles)은 성장 배지에서 재현 탁, 20의 감염의 다중성 (MOI) (즉,이 인구의 각 셀이 평균 20 BioParticles에 도전했다)에 전달했다. 나머지 두 챔버에서 세포 인구는 모의 문제 (만 즉 성장 매체)를 받았다. 1 시간 (두 박테리아 도전 문화) 또는 4 시간 (두 박테리아 도전하고, 두, 문화를 모의 도전) 37 ° C에서 배양 한 후, 세포를 세척 용해하고, 해물는 DMF 허브에서 발견되었다. 케모카인 MIP-1β (CCL4)와 RANTES (CCL5), 유도 cyclooxygenase COX-2 (PTGS2) 및 사이토 카인 TNFα (TNF : 기존의 벤치 스케일 방법은 해물에서 cDNA를 준비하고, 염증 매개체에 대한 성적 수준을 측정하는 데 사용 된 ).
그림 4는 세 개의 독립적 복제 실험의 결과를 요약 한 것입니다. 우리는 면역 세포 (파란색 막대) 성장과 기존 문화에 도전 세포에서 이끌어 것과 본질적으로 동일했다 직업 선동적인 전사 반응을 거치 성장과 마이크로 스케일 문화 (빨간 막대)에 도전 나타났습니다. 또한, 온 - 플랫폼 (마이크로 스케일) 실험 적은 변동성 (같은 더 작은 오차 막대로 표시) 보여 세포 및 시약의 소량 (표 1) 소비.
그림 1. 마이크로 스케일 세포 자극 실험을위한 자동화 플랫폼의 사진.
그림 2. 마이크로 스케일 문화 박테리아와 도전 면역 세포의 전사 프로파일 : 대표 플랫폼 활성화 실험의 개요.
그림 3. 면역 세포의 사진은 쥐과 식세포 (P388D.1 세포주) 10 6 세포 / ㎖의 농도에서 성장 배지에서 재현 탁 하였다. 마이크로 스케일의 관류 상공 회의소에서 배양하고, 10 μL가 (10 4 세포) 씨 피브로넥틴하는 데 사용 (재관류 챔버) microcapillary 코팅. 시야 사진은 CCD 카메라 (Qimaging)가 장착 MVX10 현미경 (올림푸스)를 사용하여 촬영 하였다. 인구의 크기를 측정하기 위해 복제 마이크로 스케일 문화의 세포는 세포 스트리퍼를 사용하여 재관류 챔버의 표면에서 방출 판 블루를 사용하여 염색하고 hemacytometer과 광학 현미경을 사용하여 계산 하였다. A.이 B.는 (37 ° C에서 배양와 중간 교류마다 2 시간), 인구는 ~ 1,000 세포로 확장했다.
그림 4. 면역 세포의 전사 프로파일은 마이크로 스케일의 재관류 챔버 대 기존의 용기에서 배양하고 자극. 쥐과 식세포 (P388D.1 세포주) 10 6 세포 / ㎖의 농도에서 성장 배지에서 재현 탁 하였다. 기존의 문화에 대해, 50 μL를 (5 × 10 4 세포) 96 - 웰의 microtiter 플레이트 잘 성장 매체의 씨앗 150 μL로 하였다, 마이크로 스케일 문화, 10 μL (10 4 세포)에 대한이 종자에 사용 하였다 피브로넥틴 코팅 microcapil라리 (재관류 챔버). 16 시간 동안 37 ° C에서 배양 한 후, 세포 (마이크로 스케일 문화 당 ~ 5 × 10 4 기존의 문화 당, ~ 10 세) E.에 도전했다 20의 감염의 다중성 (MOI) (즉, 문화의 모든 세포 20 BioParticles입니다)에서 대장균 박테리아 (pHrodo의 BioParticles), 음성 대조군 (가짜 장애인)의 문화는 새로운 미디어를 받았다. 37 더 배양 한 후 ° 1 또는 4 시간 동안 C, 세포를 씻어 전주곡 직접 용해 모듈에서 시약을 사용하여 용해 하였다. 해물 RNA가 증폭하여 cDNA를 박수 PicoSL WTA, Agencourt RNAClean XP를 사용하여 정제 큰 (≥ 200 NT)의 cDNA 제품 및 MIP-1β (CCL4)에 대한 성적 수준을 측정하는의 TaqMan의 qPCR 분석의 템플릿으로 사용이 제품으로 변환 RANTES (CCL5), COX-2 (PTGS2) 및 TNFα (TNF)뿐만 아니라, GAPDH (해물 사이의 cDNA 수준의 정상화). 각각의 qPCR 분석은 세중의에서 수행하고, 결과를 평균 하였다. 개채널 실험은 독립적으로 세 번 복제되었습니다. 바 기존의 문화에서 성적 수준이 평균 배 증가 (파란색) 또는 음성 대조군 (모형 도전) 문화에 비해 세균 도전 마이크로 스케일의 문화 (빨강)를 나타낸다; 오차 막대는 세 가지 실험을 통해 표준 편차를 나타냅니다.
| 요구 사항 | 기존의 실험 | 마이크로 스케일 실험 |
| 세포 | 3,000,000 | 60,000 |
| 성장 매체 | 2.4 ML | 0.7 ML |
| BioParticles | 200 μg | 4 μg |
| 세척 및 용해 시약 | 300 μl를 각 | 60 μl를 각 |
표 1. 기존의 대 마이크로 스케일 세포 자극 실험에 대한 요구 사항의. 번호는 대표 생쥐 대 식세포 (P388D.1 세포주) 여섯 기존의 (96 - 웰의 microtiter 플레이트)에서 재배 된이 보고서에서 설명한 실험 (그림 2), 대 마이크로 스케일 (재관류 챔버) 문화에서 그려 , E.와 도전 MOI 20에서 대장균 박테리아 (pHrodo의 BioParticles) 및 qPCR의 분석을 위해 용해.
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Discussion
우리는 마이크로 규모의 세포 배양과 자극 실험을위한 간단하고 다양한 자동화 플랫폼을 개발했습니다. 문화 크기는 더 작은 직경의 microcapillaries의 사용을 통해 줄일 수 있으며, 플랫폼은 우리가 작은 문화 볼륨 및 세포 인구 (- - 20 μL, 100 2000 세포 챔버 당 1 개)를 사용하여 작업 할 수 있습니다. 이러한 규모에서 작업 루틴 연구의 비용을 절감하고 귀중한 시약 및 / 또는 세포의 사용을 필요로 가능한 연구를합니다. 플랫폼 실행 실험은 세포와 체액이 자동화 플랫폼에서 처리되는 정밀도와 재현성 아마도 때문에 적은 변동성을 보여줍니다.
플랫폼의 현재 구성은 파종, 평형 및 재관류 챔버 세포 인구의 확장을 위해 오프 보드 저수지 (의 microcentrifuge 튜브 또는의 microtiter 플레이트 우물)에서 세포와 미디어를 그립니다. 이 사이의 불일치를 해결하는 간단한 방법입니다성장 매체 요구 사항 (예를 들어, 위에서 설명한 대표적인 실험에서 소비 된 700 μL)와 DMF 장치의 용량은 저수지 (24 μL 각) 보드입니다. 그러나이 구성은 두 개의 저수지 (단계 1.6) 사이를 전환 DMF 허브 (단계 3.1)로 재관류 챔버를 연결하는 중간 실험 수동 개입을 필요로한다. 미래의 구성은 중앙 실험 수동 개입이 필요하므로 제거, DMF 허브를 통해 모든 자료의 라우팅을 가능하게 할, 온 - 보드 저수지 (예를 들어, 1 ML) 대용량 포함될 수 있습니다.
우리의 실험은 플랫폼에 세포의 단기 (<24 시간) 문화에만 필요합니다. 우리는 플랫폼에서 세포 생존 능력은 적어도 24 시간 (데이터가 표시되지 않음)에 대한 기존의 문화에 버금가는 것을 확인했습니다. 그러나, 우리는 아직 시간이 더 긴 기간 동안 플랫폼에서 문화를 유지하기 위해 시도하지 않았습니다. 증발 주요 관심사가 아니기 때문에 플랫폼재관류 챔버 및 성장 매체 저수지는 부분적으로 폐쇄 시스템이며, 세포를 덮고있는 액체 플러그가 쉽게 배지 교환을 통해 보충됩니다. 반면에, 장기 문화 산도를 유지하기 위해 그것을 5 성장 매체 저수지를 수용 할 필요가있다 - CO 2 중탄산염 기반의 pH 버퍼를 포함하지 않는 10 %의 CO 2 분위기 나 성장 매체로 전환 . 또한, 적극적으로 나누어 세포의 장기 배양 자랄 지점으로 인구를 확장 할 것이다 (재관류 챔버 내의 모든 가능한 표면 즉, 범위), (릴리스 세척 희석 재 시드) 세포의과 Passaging이 수반되는 . 기타 미세 정권 3,5,6,9,17이 성취하고 현재 구성에서 플랫폼은 필요한 조작을 모두 수행 할 수 있어야합니다. 요약하면, 우리는 겸손 수정 (주로 오히려 하드웨어보다 프로토콜에 대한) 우리의 플랫폼은 C해야한다고 예상장기 포유 동물 세포 배양을 지원 apable. 기존의 방법은 시간과 노동 집약적이기 때문에 이것은 특히 밝은 미래 방향에 보일 것입니다, 우리의 자동화 플랫폼의 레퍼토리에 장기적인 문화 기능을 추가하면 더 이상의 사용자가보다 생산적 노동을 다시 지시 할 수있다.
우리는 지금까지 몇 가지 세포 유형 (예, 생쥐 대식 세포주 인 RAW264.7, 쥐 골수 유래 대 식세포 (BMDM))를 테스트했지만, 플랫폼은 거의 모든 자기편 세포 유형을 수용 할 수 있어야한다. 경우에 따라서는 피브로넥틴에서 다른 세포 외 기질 구성 요소 (또는 구성 요소의 혼합물)에 재관류 챔버 코팅을 변경하거나 성장 매체를 변경해야 할 수도 있지만, 이러한 수정이 쉽게 이루어집니다. 비 부착 세포 유형에 대한 작업은 더 많은 도전이 될 수 있지만, 셀 테 더링 전략은 유사한 맥락 32-34에 성공했다. 그것은 승자민련은 여러 종류의 세포로 구성된 혼합 문화를 만들 수있다; 실제로 플랫폼은 세포와 체액을 처리되는 정밀도는 혼합 문화의 건설이 높은 재현성 확인해야합니다.
자극과 관련하여, 수성 액체 플러그 내에서 전송 될 수있는 거의 모든 물질은 우리의 플랫폼 5,13,16,35와 호환되어야합니다. 시간이 지남에 따라 가라 할 수 크거나 조밀 한 입자의 경우는 주기적으로 저수지에서 그들을 resuspend을 할 필요가있다, 과거에, 우리는 높은 밀도 캐리어 오일 36의 사용을 통해이 문제를 해결 또는 간단한 교반 한 시스템 (데이터 표시되지 않음), 우리의 플랫폼에서 구현하기 쉬워야 솔루션을 제공합니다.
지금까지 플랫폼에서 배양 자극 세포의 우리의 특성은 주로 특징적인 염증 반응의 QRT-PCR 분석에 초점을 맞추고있다. t의 다음 단계, 종합적인 분석과 같은그는 세포 인구의 사체는 (DNA 마이크로 어레이 또는 세대 시퀀싱 (SGS) (즉, RNA-시퀀서 37,38)를 통해) 잘 입지 조건을 제공합니다, cDNA의 준비 단계의 겸손 수정으로, 우리의 플랫폼과 프로토콜 글로벌 지원을 충분히 할 수 있어야한다 전사 프로파일 연구. 마찬가지로, 단백질 수준에서 세포 인구 응답의 분석 (ELISA, 면역 침전, 질량 분석, 또는 단백질 마이크로 어레이를 통해) 해물 준비 단계 만 수정해야합니다. 플랫폼은 또한 세포 반응의 영상 기반의 분석을 지원합니다. 세포는 재관류 챔버 (예를 들어, 그림 3)에서 이미지를 만들 수 있으며, 재관류 챔버 모듈 (반올림보다는) 평면 표면 microcapillaries의 사용은 이러한 유형의 분석을 용이하게한다. 또한, 세포는 이전에 재관류 챔버 및 / 또는 그들로부터 릴리스 이후의 시드로, DMF 허브 14,15에 군데 할 수 있습니다. 출시 세포는 또한의 떨어져 이미징 할 수 있습니다플랫폼입니다. 지금까지, 우리는 자극 (예를 들어 BioParticles) 서로 (데이터 표시되지 않음). 자신의 형태, 생존, 증식 속도 및 물리적 상호 작용을 분석하기 위해 이러한 모든 단계에서 이미지 셀에 빛과 형광 현미경을 사용했습니다 현미경은 (형광 염료의 사용을 통해 평가) 대사 내용의 분석을 가능하게한다, 전사 활동 (기자 구조의 사용을 통해 평가) 및 단백질 수준 / 지역화 (기자 구조, 형광 단백질 융합 구조 및 / 또는 면역 세포의 사용을 통해 평가 ). 출시 세포 유동 세포 계측법을뿐만 아니라 사용하여 분석 할 수 있습니다. 이러한 분석의 대부분은 현재 구성에서 플랫폼에 완전히 수행 할 수있는, 다른 DMF에 연결을 통해 플랫폼에 (예를 들어 참조 36,39-41 참조) 전문 미세 유체 기반의 모듈 오프 플랫폼 분석 또는 통합을 필요로 허브. 함께 찍은, 그것은 가능성이 t 것모자 우리의 플랫폼은 그렇지 않은 경우 매우 복잡하고 고가의 로봇 시스템의 사용을 통해 달성 될 수있다 세포의 작은 인구의 다차원 분석을 가능하게 가치있는 증명합니다.
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Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 DMF 장치와 DMF 허브의 설계 및 개발에 대한 그들의 공헌에 대한 로널드 F. Renzi의 마이클 S. BARTSCH 감사합니다. 이 연구는 완전히 디아 국립 연구소의 연구실 감독 연구 개발 프로그램에 의해 지원되었다. 샌디 계약 DE-AC04-94AL85000에서 에너지의 국립 핵 보안 관리의 미국학과에 대한 Sandia 공사, 록히드 마틴사의 자회사에 의해 관리 및 운영 멀티 프로그램 실험실이다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Prelude Direct Lysis Module | NuGEN | 1400-24 | |
| Trypan Blue (0.4% w/v) | GIBCO | 15250-061 | |
| Cell Stripper | Cellgro | 25-056-C1 | |
| Ovation PicoSL WTA | NuGEN | 3310-048 | |
| Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter Genomics | A63987 | |
| pHrodo BioParticles | Invitrogen | P35361 | |
| CCL4 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443111_m1 | |
| CCL5 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm01302428_m1 | |
| PTGS2 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00478374_m1 | |
| TNF TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443258_m1 | |
| GAPDH TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm99999915_g1 | |
| Pluronic F127 | Sigma Chemical | 2594628 | |
| Fluorinert FC-40 | Sigma Chemical | 51142-49-5 | |
| Parylene C dimer | Specialty Coating Systems | 28804-46-8 | |
| Teflon-AF | DuPont | AF1600 | |
| Polyimide tape | ULINE | S-11928 | |
| Indium tin oxide (ITO) coated glass substrates | Delta Technologies | CB-40IN-1107 | |
| DMF hub Teflon-coated fused-silica microcapillaries | Polymicro Technologies | TSU100375 | |
| Perfusion chamber microcapillaries | Polymicro Technologies | TSP530700 | |
| Tubing and microcapillary fittings | Sandia National Laboratories | ||
| Polycarbonate tubing | Paradigm Optics | CTPC100-500-5 | |
| 8-port precision syringe pump equipped with 30 mm (500 μl capacity) syringes | Hamilton Company | 54848-01 | |
| Parylene-C vapor deposition instrument | Specialty Coating Systems | PDS 2010 Labcoter 2 | |
| High-voltage function generator | Trek | 615A-1 615-3 | |
| MVX10 microscope | Olympus | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) | |
| QIClick digital CCD camera | QImaging | QIClick-F-CLR-12 | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) |
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