Eine EDV-gestützte Multi-Elektroden-Patch-Clamp-System

Zusammenfassung

Multi-Elektroden-Patch-Clamp-Aufnahmen bilden eine komplexe Aufgabe. Hier zeigen wir, wie durch die Automatisierung vieler Versuchsschritten ist es möglich, den Prozess zur qualitativen Verbesserung der Leistung und der Anzahl der Aufnahmen zu beschleunigen.

Zusammenfassung

Die Patch-Clamp-Technik ist heute die etablierten Verfahren zur Aufzeichnung der elektrischen Aktivität von einzelnen Neuronen, Zellen oder Zell Fächern. Dennoch Erreichen eines stabilen Aufnahmen, auch aus einzelnen Zellen, bleibt ein zeitaufwendiges Verfahren von beträchtlicher Komplexität. Automatisierung von vielen Schritten in Verbindung mit effizienter Informationsanzeige kann sehr helfen Experimentatoren bei der Durchführung einer größeren Anzahl von Aufnahmen mit größerer Zuverlässigkeit und in weniger Zeit. Um großflächige Aufnahmen zu erreichen schlossen wir der effizienteste Ansatz ist nicht vollständig zu automatisieren den Prozess, sondern um die experimentellen Schritte zu vereinfachen und reduzieren die Chancen auf menschliche Fehler während effizient Erfahrung des Experimentators und visuelles Feedback Einbeziehung. Mit diesen Zielen vor Augen haben wir ein computergestütztes System, das alle notwendigen Kontrollen für eine Multi-Elektroden-Patch-Clamp-Experiment in einer einzigen Schnittstelle, einem commerc zentralisiert entwickeltmathematisch verfügbaren Wireless-Gamepad, während der Anzeige Experiment bezogene Informationen und Führungssignale auf dem Computer-Bildschirm. Hier beschreiben wir die verschiedenen Komponenten des Systems, die uns die Zeit zum Erreichen der Aufnahmekonfiguration zu reduzieren und die Chancen für die erfolgreiche Aufnahme einer großen Anzahl von Nervenzellen gleichzeitig zu erhöhen erlaubt.

Einleitung

Die Fähigkeit, mehrere Seiten mit Mikrometer-Präzision aufnehmen und zu stimulieren ist sehr nützlich für experimentell ein besseres Verständnis der neuronalen Systemen. Viele Techniken haben zu diesem Zweck entwickelt worden, aber die submillivolt Beschluss der Patch-Clamp-Technik, die für das Studium unterschwellige Aktivität und einzelnen postsynaptischen Potentiale erreicht keiner erlauben. Hier behandeln wir die Entwicklung eines Zwölf-Elektrode computergestützten Patch-Clamp-System bei gleichzeitiger Aufnahme und Förderung einer großen Anzahl von Einzelzellen mit ausreichender Genauigkeit für die Untersuchung der neuronalen Konnektivität gerichtet. Während viele andere Anwendungen für ein solches System konzipiert werden, eignet es sich besonders gut für die Untersuchung von synaptischer Verbindungen gegeben, dass die Anzahl der möglichen Verbindungen innerhalb einer Gruppe von Neuronen wächst proportional zu dem Quadrat der Anzahl von Neuronen in Frage. Während also ein System mit drei Elektroden ermöglicht die Prüfung derAuftreten von bis zu sechs Verbindungen und meist Aufnahme eines einzigen, Aufzeichnungs zwölf Neuronen ermöglicht das Testen des Auftretens von bis zu 132 Anschlüsse, und oft mehr als ein Dutzend beobachtet (Abbildung 1). Die Beobachtung von Dutzenden von Verbindungen gleichzeitig ist es möglich, die Organisation von kleinen Netzwerken zu analysieren und zu schließen statistische Eigenschaften der Netzwerkstruktur, die nicht anderweitig ¹ untersucht werden können. Darüber hinaus ermöglicht eine präzise Stimulation von zahlreichen Zellen auch die Quantifizierung der Rekrutierung von postsynaptischen Zellen ^2.

Protokoll

1. Vorbereitung der Ausrüstung

1. Steuer Manipulatoren von einem Computer
   1. Schließen Sie jedes Mikromanipulator Controller-Box an einen Computer über serielle Schnittstellen (RS-232).
   2. Implementieren Sie die Befehle für die Positionierung, Abfrage und die Einstellungen vornehmen, um über die serielle Schnittstelle gesendet werden. Angesichts Geschwindigkeit und Hardware-Kompatibilitätsprobleme C / C + + als Programmiersprache empfohlen.
   3. Standardisieren Sie das Bezugssystem der Manipulatoren, so dass Null ist der nächstmögliche Position in Bezug auf die Motoren und positive Bewegung weg von den Motoren gerichtet.
   4. Positionieren des Mikroskops an seiner zentralen Position 2 mm oberhalb der Probe Brennebene (Koordinaten [0, 0, 2000]).
   5. Speicher für jeden Manipulator, der lokalen Koordinaten, die die Spitze einer Pipette, in der Mitte des Sichtfeldes des Mikroskops beobachtet werden können. Dies ist der erste Bezugspunkt für jede Elektrode.
2. VisuaLize Elektrodenpositionen. Es ist sehr nützlich, um die Position einer jeden Elektrode während eines Experiments zu verfolgen. Eine grafische Darstellung ist die intuitive Weise, dies zu erreichen. Zu diesem Zweck werden die Referenzsysteme jeder Elektrode und der des Mikroskops abgeglichen werden müssen. Ein einfacher Weg, dies zu erreichen ist:
   1. Bringt die Spitze einer Elektrode zu der Mitte des Sichtfeldes.
   2. Speichern die Position auf jeder Achse des Manipulators und jede Achse des Mikroskops.
   3. Ausführen mit der x-Achse des Manipulators eine relativ große Bewegung (1 mm).
   4. Suchen Sie die Spitze noch einmal bewegen nur das Mikroskop.
   5. Berechnen Sie die Differenz im Mikroskop Position, seit es zuletzt gemessen. Dies sind die Vorsprünge des Elektrodenachsenbewegung auf das Mikroskop Achsen.
   6. Die Schritte von 2,3 bis 2,5 für die Y-und Z-Achsen der Elektrodenmanipulator. Dies ermöglicht eine Matrix von Vorsprüngen auf dem Mikroskop-Achsen bestimmt werden ( Abbildung 2) auch als Kosinus-Matrix:
      
   7. Invertieren dieser Matrix, die es ermöglichen, die Bewegungen in drei Dimensionen, die durch die Elektrode Manipulator erforderlich, um eine bestimmte Position im Mikroskop Koordinatensystem zu erreichen berechnen:
      
   8. Mit dem ersten Referenzpunkt und der Kosinus-Matrix bestimmen die Position jeder Elektrode in Mikroskop koordiniert.
   9. Grafisch dargestellt, basierend auf dem Objektkoordinaten, die Position jeder Elektrode in regelmäßigen Abständen. Wir entschieden uns für C / C + +-Bibliotheken Zeichnung (GDI +) zu verwenden, um Elektrodenpositionen alle 40 ms zu ziehen.
   10. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.1 - 1.2.7 jedem Manipulator Winkel verändert oder Positionsänderungen von mehreren Millimetern erforderlich sind, zum Beispiel wenn die Art der Elektrode verändert wird.
3. Aktivieren Sie das Speichern der Positionierungns der relevanten Merkmale in das Gewebe, wie z. B. Zellen oder anatomischen Referenzpunkten, die im Mikroskop koordiniert.
4. Erwerben Sie Video-und relevanten Informationen zu überlagern.
   1. Mechanisch die x-Achse der Bewegung des Mikroskops ausgerichtet mit der horizontalen Achse des Mikroskop-Kamera.
   2. Installieren Sie auf dem Computer einen Framegrabber mit Live-Video-und Overlay-Fähigkeit und ein Software Development Kit (SDK).
   3. Implementieren Sie Live-Video-Display-Betrieb mit dem SDK.
   4. Konvertieren das Mikroskop Koordinatensystem der Kamera-Referenzsystem durch die geeignete Übersetzung und Skalierung.
   5. Daraus die relevanten Merkmale in Kamerakoordinaten und die Überlagerung auf dem Live-Video das resultierende Bild in regelmäßigen Abständen von etwa 40 ms (Fig. 3).
5. Regelverstärker.
   1. Verwenden Sie die Software, um die Verstärker Verstärkereinstellungen von der Schnittstelle zu steuern.
6. CoNTROL Oszilloskope.
   1. Schließen Sie die Oszilloskope mit seriellen Schnittstellen mit dem PC.
   2. Bestimmen Sie die Oszilloskop-Skala, Kupplung und zeitliche Auflösung für die verschiedenen Schritte der Patch-Clamp-Verfahren in Voltage-Clamp (zB Elektrode im Bad, Dichtung Bildung, Ganzzell-Konfiguration) und Strom-Klemme.
   3. Senden der geeigneten Oszilloskop Einstellbefehle wenn Verstärker Befehle von der Schnittstelle ausgegeben.
7. Steuer Pipette Druck.
   1. Zusammenstellung eines Drucksteuersystems gemäß 4.
      1. Verwenden Sie eine 12 V / 5 V-Stromversorgung, jede elektronische Komponente entsprechend zu versorgen.
      2. Den Ausgang der Membranpumpe nach einem der Überdruckpuffer (100 ml Behälter).
      3. Den Eingang einer Membranpumpe mit der Unterdruckpuffer (100 ml Behälter).
      4. Verbinden den Pipettenhalter Schlauch mit einem Drucksensor in der pressuWiedersteuersystem und ein pneumatisches Ventil, das an dem Hauptdruckraum verbindet.
      5. Verbinden jeder der Druckpuffer auf ein Ventil mit der Hauptdruckkammer verbunden ist.
      6. Verbinden eines Ventils zwischen der Hauptdruckkammer und der Atmosphäre.
      7. Schließen Sie einen Drucksensor an der Hauptdruckraum.
      8. Schließen Sie einen Drucksensor, der jeden Puffer.
      9. Schließen Sie den Druckkontrollsystem mit einer Datenerfassungskarte.
      10. Verbinden Sie jeden Drucksensor mit einem Analogeingang.
      11. Verbinden jedes Ventil mit einem digitalen Ausgang.
   2. Entfernen Atmosphärendruck durch Öffnen aller Ventile mit Ausnahme der Verbindung zu den Membranpumpen und Subtraktion der gemessene Druck von allen Sensoren kompensiert.
   3. Implementieren Druckkontrolle
      1. Definieren Sie in der Schnittstelle ein Steuerelement zu aktivieren oder zu de-aktivieren positive Druckregelung für jede Pipette.
      2. Definieren Sie eine minimale Überdruck für die Pipettes von etwa 70 mbar.
      3. In regelmäßigen Abständen (alle 0,5 sec) erkennen, wenn Druck in Pipetten unter aktiver Druckregelung unter den eingestellten Schwellenwert.
      4. Nach der Schwellenwertüberschreitung öffnen Sie die Überdruckpuffer in den Hauptdruckraum und dieses Fach in Richtung der Pipette in Frage während der kurzen Perioden (20 ms), bis der Druck in den Pipetten oberhalb der Schwelle ist. Schließen Sie alle anderen Ventile.
      5. De-aktivieren weitere Druckkontrolle als der letzte Ansatz für eine Zelle von Interesse ausgelöst.
   4. Bewerben Unterdruck zur Bildung Dichtung
      1. Schließen Sie alle Ventile und öffnen Sie die Unterdruckpuffer Ventil in Richtung der Hauptdruckraum und dieses Fach in Richtung der Pipette in Frage für die Dauer der Experimentator erfordert, indem sie eine Taste gedrückt wird.
8. Zentralisieren Sie Befehle auf eine Human Interface Device.
   1. Schließen Sie einen handelsüblichen wireless-Gamepad an den PC.
   2. Implementieren Auslesen der Joystick-Status. So verwenden Sie die DirectX-Bibliotheken für C / C + +, um alle 5 ms Anzeigen durchzuführen.
   3. Vergleichen Sie den aktuellen Status mit früheren Status zu erkennen, welche Tasten betätigt wurden, freigegeben oder gedrückt gehalten seit dem letzten Zeitschritt.
   4. Zuweisen von Funktionen zu jeder Taste in dem Gamepad. Ein Beispiel dieser Abbildung ist in Fig. 5 gezeigt.

2. Patch-Clamp-Verfahren

1. Vorbereitung der Hirnschnitten der Region von Interesse.
2. Legen Sie einen Hirnschnitt von Interesse, mit dem interessierenden Bereich in der Mitte des Verschiebebereich des Mikroskops.
3. Zellselektion
   1. Identifizieren Zellen von Interesse, indem Sie mit dem Mikroskop. Bewahren Sie die Position der Zellen auf der Basis des Mikroskops ein Koordinatensystem mit der rechten Maustaste auf das Live-Video-Anzeige auf der Oberseite der Zelle von Interesse.
   Die grafische Oberfläche werden die ausgewählten Zellen sowie die Mikropipetten für einen globalen Überblick und Software anzuzeigen, eine Markierung auf der Zellposition, die auf den Bildern überlagert werden hinzuzufügen. Darüber ein Bild von der Zelle wird für die Zukunft in der Datei 'Zelle #. Jpg' eingefangen.

Namensnennung von Zellen, Pipetten

1. Nach der Auswahl der Zellen von Interesse, weisen Sie die Pipette jede Zelle aufnehmen wird. Die grafische Oberfläche bietet Zuordnung Steuerelemente, die eingestellt werden soll. Visualisieren Sie eine Vorschau auf die endgültige Konfiguration indem Sie die Kontrollkästchen 'Final Positionen Show'.
2. Wählen Sie jede Pipette, für die die endgültige Position Vorschau gewünscht oder überprüfen Sie die "Select All" Kontrollkästchen. Deaktivieren Sie die Anzeige der aktuellen Position zur besseren Visualisierung, wenn nötig.

Bereiten Sie die Pipetten

1. Füllen Sie die Pipetten (6-8 MOhm sind in der Regel am besten, wenn viele Pipetten verwendet werden) with intrazellulären Lösung und laden sie in ihre Inhaber. Legen Sie die headstages in ihren Aufzeichnungen aber nicht schieben Sie sie nach vorne zu vermeiden, berühren Sie das Bad mit der Pipettenspitze.
2. Aktivieren Sie die positive Drucksteuerung und wählen Sie alle Pipetten, um sicherzustellen, dass die Spitzen bleibt sauber. Schieben Sie jede heads an Ort und Stelle.

Auffinden der Pipettenspitzen

1. Positionieren Sie das Mikroskop in eine zentrale Position mit Fokus 3 mm über der Scheibe durch Drücken der Taste bei gedrückter R2-Taste 'A'. Verwenden Sie die entsprechende Position für jeden Manipulator aus dem vorherigen Experiment durch Drücken der Taste L2-Taste gespeichert werden, während A. Halten
   Hinweis: An dieser Stelle sollte es entweder ein unverwechselbares Schatten einer Pipette in Aussicht oder eine kleine Bewegung entlang der Pipette Achse sein sollte, genug, um es in den meisten Fällen zu beobachten. Vergütung für die leichte Unterschiede in Form Pipette muss manuell durchgeführt werden.
2. Bringen Sie die Pipettenspitze in den Fokus. Die Spitze auf dem roten Punkt in der Mitte des Videoanzeige ohne Bewegung des Mikroskops (es sollte noch in Position [0, 0 2000] sein).
3. Informieren Sie die Software, die die Pipette ist in der Mitte der Anzeige durch Drücken der Taste Z, während die Taste C gehalten Nach jeder Pipettenspitze befindet, senden diese Pipette nach hinten, so dass die folgende kann man durch Drücken der Taste L1-Taste, während A. hält befinden

Annäherung an die Zellen

1. Sobald alle Pipettenspitzen haben genau lokalisiert worden und jede Pipette wird mit einer Zelle zugeschrieben, die Pipetten in der Nähe ihrer jeweiligen Zellen automatisch zu positionieren. Einfach mit der rechten Maustaste in der Mitte der Gruppe von Zellen, und wählen Sie die Option 'Cluster' im Popup-Menü. Auf dem Cluster-Optionen-Fenster, die angezeigt wird, wählen Sie alle Pipetten, die Sie in dieser Zeit positionieren möchten, und klicken Sie auf 'Go mit allen Pipetten überprüft. Wiederholen dieses Vorgangs für jedes Cluster von Zellen von Interesse.
2. Perform den Endanflug manuell. Die Position der Pipette in Bezug auf die Zellen unterschiedlich festgelegt werden, aber gewöhnlich ist einfach 200 &mgr; m entfernt von der Zelle in der Achse der Pipette und 200 um darüber in der vertikalen Richtung, die ausreichen, um die Pipettenspitze außerhalb des Gewebes zu halten, ist . Warten Sie, bis die Positionierung der Pipetten ist fertig und das Mikroskop zu bewegen in Richtung einer Pipette durch Drücken der Taste bei gedrückter R1-Taste C.
3. Kalibrieren Sie jede Pipette Position durch die Fokussierung des Mikroskops auf der Spitze überall in der Videoanzeige und Drücken der Taste B bei gedrückter Taste C ein quadratisches Gitter sollte kurz erscheinen, die die identifizierten Position der Pipette. Wenn die Position nicht korrekt ist, positionieren Sie die Spitze auf dem zentralen Punkt der Videoanzeige und drücken Sie die Taste Z gedrückt gehaltener Taste C.

Stellen Sie die Cell-Attached-Konfiguration

1. Bestätigen Sie, dass die Zelle von Interesse für die aktuelle Pipette richtig istmarkiert. Ansonsten bewegen das Mikroskop, um die Zelle von Interesse mit dem zentralen roten Punkt übereinstimmen. Markieren Sie die Zelle mit der Taste Y-Taste bei gedrückter C-Taste drücken, während L2 Taste C halten, um die Pipette 200 um weg von dem ihm zugewiesenen Zelle positionieren, wird das Mikroskop automatisch in die entsprechende Position zu bewegen.
2. Stellen Sie die Pipette Position, damit es den roten Punkt übereinstimmt. Stellen Sie die Pipette durch Drücken der Taste R1-Taste, während X. hält Offset
3. Aktivieren Sie den Testimpuls durch Drücken der Taste bei gedrückter L1-Taste X. Langsam nähern sich der Pipette auf seine Zelle zurückgeführt.
4. Nach Beobachtung der Bildung einer Vertiefung auf der Oberfläche der Membran der Zelle gelten eine kurze Puls der Unterdruck durch Drücken der Taste Y, während die Taste Z halten, damit der aufgebrachte Druck, um die Zelle zu erreichen. Ein Haltepotential von etwa-65mV sei an dieser Stelle durch Drücken der Taste L2, während die Taste X. Holding gegründet

Whole-Cell-Konfiguration

1. Sobald eine Giga-Dichtung für jede Zelle gebildet, beginnen Aufbrechen der Membranen durch Aufbringen von Unterdruck.

Führen Aufnahmen

1. Verwenden Sie die Stimulation / Erfassungssystem, um Ihre Aufnahmen durchzuführen. Gelten Impulse oder Impulsfolgen auf einer Einzelzelle zu einer Zeit und Reaktionen beobachten, auf den übrigen Zellen, um die Verbindung zwischen den aufgenommenen Zellen abzubilden.

Zurücktreten Pipetten

1. Sobald Aufnahmen fertig sind, zurücktreten Pipetten langsam aus dem Gewebe mit der rechten Maustaste auf die Tabelle Radio-Button. Wählen Sie "zurücktreten-> Pipetten 500 um" zu haben, die Pipetten rücken eine kurze Strecke entlang ihrer Achsen. Beachten Sie die Drift in Potential der Zellen (Clearing die Tipps durch die Anwendung einiger positiver Druck kann helfen).
2. Um Pipetten ganzen Weg zurück zurückgehen, stellen Sie die Positionierungsgeschwindigkeit auf 'Fast' und wiederholen Sie den gleichen Vorgang, aber wählen Sie das "Alle"-Option. Entfernen Sie die verbrauchtePipetten durch vorsichtiges Schieben Sie die headstages und Lösen der Pipetten aus den Halterungen. Es ist nützlich, um zu vermeiden, drehen die Inhaber in ihren Höhlen da dies stark mit der Pipettenspitze Position stören.

Ergebnisse

Nach den oben beschriebenen Verfahren ist es gelungen, gleichzeitig ausführen Ganzzell-Aufzeichnung von bis zu zwölf Neuronen nahezu verdoppelt die größte Anzahl von Neuronen gleichzeitig patch-geklemmt so weit. Beispiele für Netzwerke der direkten synaptischen Verbindungen zwischen den pyramidalen Neuronen in Schicht V im somatosensorischen Cortex von Ratten sind in Abbildung 6 gezeigt.

Die Bestimmung der Verbindungswahrscheinlichkeit Profile als eine Funktion der Zwischenk...

Diskussion

Eine unmittelbare Frage stellt sich in der Regel über die Erfolgsquote des Verfahrens, die wir beschrieben. Für hohe Erfolgsraten Vorbereitung ist unerlässlich. Pipetten müssen Spitzenöffnungen, die ausreichend für den aufgenommenen Zellen Wesen sind. Filtern des intrazellulären Lösung verstopfte Pipette zu vermeiden, ist ebenfalls wichtig. Extrem sauber, frisch gezapftes Pipetten sind eine weitere Voraussetzung. Eine Binomialverteilung ist das einfachste Modell, die verwendet werden können, um zu verstehen, wie diese P...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Mikroskop	Olympus	BX51WI	40X Immersionsobjektiv
Manipulatoren	Luigs Neumann	SM-5	Verwendetes serielles Protokoll
Amplifiers	Axon Instruments	MultiClamp 700B	SDK gebraucht
Kamera	Till Photonics	VS 55	BNC Analogausgang
Framegrabber	Datenübersetzung	DT3120	SDK gebraucht
Oszilloskope	Tektronix	TDS 2014	Serielle Kommunikation
Datenerfassung	InstruTECH	ITC 1600
Datenerfassung	National Instruments	PCI-6221	Gebrauchte Bibliothek (.dll)
Druckventil	SMC	SMC070C-6BG-32
Drucksensor	Honeywell	24PCDFA6G
Membran Pumpe	Schego	Optimal