Zwei komplementäre Verfahren basierend auf Durchflusszytometrie und Mikroskopie vorgestellt, die die Quantifizierung auf der Ebene einer einzelnen Zelle, die Dynamik der Genexpression durch die Aktivierung eines MAPK-Weg in Hefe induziert ermöglichen.
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Methodenartikel
Zeitliche Quantifizierung der MAPK induzierte Expression in Einzel-Hefezellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Quantifizierung der Genexpression auf Einzelzellebene deckt neuen Regulationsmechanismen bei Messungen auf Bevölkerungsebene durchgeführt verdeckt. Zwei Methoden, die auf Mikroskopie und Durchflusszytometrie werden dargestellt, um zu demonstrieren, wie solche Daten erfasst werden. Die Expression eines fluoreszierenden Reporter bei Aktivierung der hohe Osmolarität Glycerin MAPK in Hefe induziert wird als Beispiel verwendet. Die spezifischen Vorteile der einzelnen Verfahren werden hervorgehoben. Durchflusscytometrie misst eine Vielzahl von Zellen (10.000) und liefert ein direktes Maß für die Dynamik der Protein-Expression unabhängig von der langsamen Reifung Kinetik des fluoreszierenden Proteins. Abbildung von lebenden Zellen durch Mikroskopie ist im Gegensatz zu der Messung der gereiften Form der Reporter in weniger Zellen beschränkt. Jedoch können die Datensätze durch diese Technik erzeugt extrem reich durch die Kombinationen von mehreren Reportern und um die räumliche und zeitliche Informationen seinaus Einzelzellen erhalten. Die Kombination dieser beiden Messmethoden können neue Erkenntnisse über die Regulation der Proteinexpression durch Signalwege zu liefern.
Einleitung
Signalisierung über transduktionskaskaden oft gipfelt in der Expression von Proteinen. Die Charakterisierung des Expressionsprofils ist ein Schlüsselelement für das Verständnis der Funktion der biologischen Wege. Die Identifizierung des Spektrums hochreguliert Proteine und die Dynamik ihrer Aktivierung kann durch verschiedene Techniken wie Mikroarrays, Northern-Blots und Western Blots 1-3 erreicht werden. , Im Durchschnitt jedoch diese Techniken die Antwort einer ganzen Population von Zellen. Um die Feinregulierung der Expression von Proteinen zu verstehen, ist es wünschenswert, Messungen auf Einzelzellebene zu sammeln. Idealerweise sollten diese Messung....
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Protokoll
1. Mikroskopie-Messungen
- Impfen 5 ml synthetisches Medium mit Hefe.
- Zellen wachsen bei 30 ° C über Nacht.
- Messen Sie die OD 600 der Übernachtkultur am nächsten Morgen.
- Verdünnen Nacht-Kultur in 5 ml synthetisches Medium bis DA 600 0,05.
- Wachsen die verdünnte Kultur bei 30 ° C für mindestens 4 Stunden.
- Bereiten Sie 3-fach konzentriert (0,6 M) NaCl-Lösung in synthetischem Medium.
- Vorbereitung einer 1 mg / ml Lösung von Concanavalin A (ConA) in PBS.
- Filtrat ~ 200 ul ConA-Lösung in die gut Rutsche.
- Lassen Sie stehen für 30 min.
- ConA-Lösung entfernen.....
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Ergebnisse
Mikroskopie
Hefe-Zellen, die das Reportergen Expression STL1 p-qV (ySP9 7) zu dem Boden des Bohrlochs-Schlitten angebracht ist und unter das Mikroskop gelegt. Die Zellen wurden während des Verlaufs der Bildgebungssitzung durch Zugabe von Stress Medium direkt in das Bohrloch gefördert. Dies ermöglicht es uns, ein paar Bilder von den Zellen vor Induktion Weg erwerben und folgen Sie ihr Schicksal nach der Stimulation. Im vorliegenden Fall wurden die Zellen für ca. 2 h mit einem.......
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Diskussion
Mikroskopie
Die Behandlung der mit ConA und ist ein wesentlicher Schritt, um eine richtige Abbildung der Zellen sicherzustellen. Da ConA eine geringe Löslichkeit in PBS (5 mg / ml), kann die Filtration der Entfernung von großen Aggregaten, die in der ungefilterten Lösung vorliegen und stören die Bildgebung. Zellen befestigen relativ stark auf die behandelte Oberfläche und die Zugabe der Lösung zu induzieren nicht die Lokalisierung der Zellen stören, was eine kontinuierliche Verfolgung vor und n.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Danksagungen
Die Autoren danken Matthias Peter und seine Gruppe am Institut für Biochemie an der ETH in Zürich, wo diese Verfahren entwickelt worden. Diese Arbeit wurde durch den Schweizerischen Nationalfonds unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Reagenz | |||
| Hefe-Stickstoff-Base | FürMedium | CYN6202 | |
| CSM-Aminosäuremischung | ForMedium | DCS0011 | |
| Concanavalin A | GE Healthcare | 17-0450-01 | |
| Cycloheximid | Fluka Aldrich Sigma | C7698 | Toxisch |
| ySP9 | W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus | ||
| pSP34 | pRS305 pSTL1 (-800 -0) - vierfaches V enus | ||
| Material | |||
| Mikroskop | Nikon | Ti-Eclipse | |
| Steuerungssoftware für Mikroskope | Mikromanager | Ver 1.4.11 | |
| Inkubationskammer | LIS | The Box | |
| Fluoreszenzlicht Quelle | Lumencor | SpectraX | |
| Kamera | Hamamatsu | Flash 4.0 | |
| Durchflusszytometer | BD | FACS calibur | |
| Sonicator Bad | Telesonic | TUC-150 | |
| 8-Well-Objektträger | Thermo Lab-tek | 155409 | |
| 96-Well-Platte | Matrical bioscience | MGB096-1-2-LG | |
| FACS Rohr | BD Falcon | 352054 |
Referenzen
- Gasch, A. P., Spellman, P. T., et al. Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes. Molecular biology of the cell. 11 (12), 4241-4257 (2000).
- de Nadal, E., Zapater, M., Alepuz, P. M., Sumoy, L., Mas, G., Posas, F.
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Nachdrucke und Genehmigungen
