Methodenartikel

Gleichzeitige Quantifizierung zellulärer und extrazellulärer Bestandteile von Biofilmen

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DOI:

10.3791/50639

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10. Dezember 2013

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1Department of Dental Materials, College of Dentistry, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Biostatistics and Epidemiology, College of Public Health, University of Oklahoma Health Sciences Center, 3Department of Biological Sciences, School of Mathematics and Natural Sciences, The Copperbelt University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Es wird ein Protokoll für die gleichzeitige Quantifizierung und den Vergleich von drei zellulären und extrazellulären Komponenten innerhalb von Biofilmen vorgestellt. Die Methodik umfasst den Einsatz von konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie, Biofilm-Strukturanalyse- und Visualisierungssoftware sowie statistischer Analysesoftware.

Zusammenfassung

Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung von Biofilmen. Nur sehr wenige Untersuchungen haben die gleichzeitige Verteilung von mehr als zwei Komponenten innerhalb von Biofilmen erfolgreich quantifiziert, weil: 1) die Auswahl von Fluoreszenzfarbstoffen mit minimaler spektraler Überlappung kompliziert ist und 2) die Quantifizierung mehrerer Fluorochrome ein multifaktorielles Problem darstellt. ziele: Bericht über eine Methodik zur Quantifizierung und zum Vergleich gleichzeitiger 3-dimensionaler Verteilungen von drei zellulären/extrazellulären Komponenten von Biofilmen, die auf relevanten Substraten gezüchtet wurden. Methodik: Die Methode besteht aus unterschiedlichen, miteinander verbundenen Schritten, die das Biofilmwachstum, die Färbung, die CLSM-Bildgebung, die Biofilmstrukturanalyse und -visualisierung sowie die statistische Analyse von Strukturparametern umfassen. Biofilme von Streptococcus mutans (Stamm UA159) wurden 48 Stunden lang auf sterilen Proben von Point 4 und TPH3 Harzkompositen gezüchtet. Die Proben wurden anschließend 60 Sekunden lang entweder in Mundspülungen mit Biotène PBF (BIO) oder Listerine Total Care (LTO) oder Wasser getaucht (Kontrollgruppe; n=5/Gruppe). Biofilme wurden mit Fluorochromen für extrazelluläre polymere Substanzen, Proteine und Nukleinsäuren gefärbt, bevor die Bildgebung mit CLSM erfolgte. Die mit der Bildanalysesoftware ISA3D berechneten strukturellen Parameter des Biofilms waren das Biovolumen und die mittlere Biofilmdicke. Gemischte Modelle: Statistische Analysen verglichen strukturelle Parameter zwischen Mundspül- und Kontrollgruppe (SAS-Software; α=0,05). Die Volocity-Software ermöglichte die Visualisierung von 3D-Verteilungen von überlagerten Biofilmkomponenten (Fluorochromen). Befund: Mundwasser BIO erzeugte Biofilmstrukturen, die sich signifikant von der Kontrolle (p<0,05) auf beiden Harzkompositen unterschieden, während LTO bei keinem der beiden Produkte Unterschiede (p>0,05) hervorrief. Schlüsse: Diese Methodik quantifizierte und verglich effizient und erfolgreich die gleichzeitigen 3D-Verteilungen von drei Hauptkomponenten innerhalb von S. mutans-Biofilmen auf relevanten Substraten und überwand damit zwei Herausforderungen bei der gleichzeitigen Bewertung von Biofilmkomponenten. Diese Methode kann auch verwendet werden, um die Wirksamkeit von antibakteriellen/Antifouling-Mitteln gegen mehrere Biofilmkomponenten zu bestimmen, wie anhand von Mundspülungen gezeigt wird. Darüber hinaus hat diese Methode eine breite Anwendung, da sie den Vergleich von 3D-Strukturen/Architektur von Biofilmen in einer Vielzahl von Disziplinen ermöglicht.

Einleitung

Biofilme sind strukturierte mikrobielle Gemeinschaften, die in einer selbst produzierten extrazellulären Matrix eingekapselt und an biologische oder inerte Oberflächen gebunden sind1. Biofilme stellen eine gemeinsame Lebensweise vieler Bakterien dar und bilden sich, indem sie schrittweise von frei schwebenden (planktonischen) Zellen zu komplexen Multispezies-Gemeinschaften übergehen. Die inhärente Resistenz von Biofilmen gegen antimikrobielle Wirkstoffe ist die Ursache für viele anhaltende und chronische bakterielle Infektionen1,2, wie orale Biofilme (Zahnbelag) zeigen. Kariogene Mikroorganismen wie Mutans-Streptokokken verarbeiten Saccharose und andere Kohlenhydrate, um eine extrazelluläre Matrix zu bilden und Säuren zu erzeugen, die die Zahnstruktur demineralisieren und Karies verursachen können. Die meisten Biofilmmatrizen sind Biopolymere, die aus zellulären und extrazellulären Komponenten wie Exopolysacchariden (EPS), Proteinen und Nukleinsäurenbestehen 3,4.

Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM), die am weitesten verbreitete Technik für die Fluoreszenzbildgebung, hat die optische Bildgebung in der Biologie radikal verändert, da sie in der Lage ist, 3D-Bilder von hydratisierten biologischen Strukturen ohne Fixierung zu sammeln5,6,7. Bei dieser zerstörungsfreien Technik werden Bilder von Dünnschliffen innerhalb eines interessierenden Bereichs auf der Probe so gesammelt, dass der Beitrag von unscharfem Licht entfernt wird. Die Qualität und Auflösung der mit CLSM aufgenommenen Bilder geht über das hinaus, was mit der Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie möglich ist. Ein großer Nachteil von CLSM besteht darin, dass das Scannen von Bildern langsamer erfolgt als bei Weitfeldmikroskopietechniken, bei denen ganze Bilder gleichzeitig erfasst werden5. Mit einer wachsenden Auswahl an Fluorochromen, Lasern und Filtern hat sich CLSM jedoch zu einer der vorherrschenden Techniken für die multispektrale Bildgebung entwickelt5,7.

Frühere Studien haben gezeigt, dass CLSM ein nützliches Werkzeug ist, um die Struktur oder Architektur von Biofilmen zu untersuchen, indem ein oder zwei fluoreszierende Tags oder Färbungen verwendet werden, um ein besseres Verständnis der Verteilung von EPS und Zellen innerhalb von Biofilmen und insbesondere innerhalb der extrazellulären Matrixzu erhalten 7,8. Theoretisch ist die Fluoreszenzfärbung/-markierung mehrerer Komponenten wünschenswert, um die detaillierte Struktur und Kolokalisation von zellulären und extrazellulären Komponenten innerhalb von Biofilmen zu untersuchen. Die gleichzeitige Analyse verschiedener Komponenten innerhalb von Biofilmen kann jedoch eine Herausforderung darstellen, weil: 1) die Auswahl von Fluoreszenzfarbstoffen mit minimaler spektraler Überlappung kompliziert ist und 2) die Quantifizierung mehrerer Fluorochrome ein multifaktorielles Problem darstellt. Die Kolokalisation mit mehreren Fluorochromen erfordert die Verwendung hochspezifischer Färbungen mit minimaler spektraler Interferenz, um Durchschlageffekte zu vermeiden, die auftreten, wenn zwei Fluorochrome eine signifikante Überlappung in ihrem spektralen Peak aufweisen, wodurch eines stärker angeregt wird als das andere9. Im Idealfall würden Fluorochrome mit Anregungsspektren, die sich nicht überlappen, die besten Ergebnisse liefern, jedoch ist es sehr schwierig, Flecken zu finden, die dieses Kriterium erfüllen. Stattdessen wird die Auswahl der Färbungen durch die Auswahl von Fluorochromen optimiert, deren Emissionsspektren eine minimale Überlappung aufweisen, so dass die Färbungen einzeln innerhalb eines begrenzten Betrachtungswellenlängenbandes9 betrachtet werden können.

Überlagerung von Fluoreszenzbildern ist wahrscheinlich die am weitesten verbreitete Methode zur Bewertung der gleichzeitigen Verteilung von Fluorochromen. Die Kolokalisation der verschiedenen Komponenten erscheint als Überlappung verschiedener Farben durch mehrere Kanäle, die von den untersuchten Fluorochromen erzeugt werden10. Die Werkzeuge zur Anzeige von Mehrkanal-Fluoreszenzbildern als zusammengeführte Farbbilder sind in den meisten CLSM-Softwares und biologischen Bildanalyse-Softwares verfügbar. Obwohl die Überlagerung von Bildern für die räumliche Bewertung der Kolokalisierung nützlich ist, können die Bilder nur durch visuelle Analyse qualitativ untersucht werden. Dies liefert nur eine begrenzte Menge an Informationen, da diese Darstellungen im Allgemeinen nicht hilfreich sind, um die Kolokalisation unter verschiedenen experimentellen Bedingungen zu quantifizieren, noch bestimmen, ob die Kolokalisation die zufällige Koinzidenzübersteigt 11. Mit quantitativen Methoden wurde bisher die 3-dimensionale Struktur von Biofilmen und Biofilmbestandteilen mit quantitativen Methoden analysiert, und noch weniger quantifizierten die Wirkung von antibakteriellen Behandlungen oder Antifouling-Maßnahmen auf Biofilmkomponenten.

Das Ziel dieser Studie war es, eine Methodik zur Quantifizierung und zum Vergleich der gleichzeitigen 3-dimensionalen Verteilungen von drei zellulären und extrazellulären Komponenten von Biofilmen zu erstellen. Die Methode besteht aus unterschiedlichen, aber miteinander verbundenen Schritten, die das Biofilmwachstum, die Färbung, die CLSM-Bildgebung von Biofilmen, die Biofilmstrukturanalyse und -visualisierung sowie die statistische Analyse von Strukturparametern umfassen. Der Biofilmwachstumsassay ermöglicht das Biofilmwachstum auf relevanten Substraten und erzeugt Biofilmstrukturen, die reproduzierbar sind. Die Kombination aus neuartiger simultaner Färbung von EPS, Proteinen und Nukleinsäurekomponenten mit der Messung von 3D-Biofilm-Strukturparametern führt zu quantifizierbaren Verteilungen von Komponenten innerhalb von Biofilmen. Die statistische Analyse der strukturellen Parameter des Biofilms ermöglicht die Bewertung von Biofilmen unter bestimmten experimentellen Bedingungen (z.B. nach Behandlung mit Mundspülungen), wie im nächsten Abschnitt beschrieben wird.

Protokoll

1. Herstellung von Medien und Reagenzien

  1. 300 ml Kulturmedium für die Übernachtkultur herstellen (THY; 3 % Todd-Hewitt-Brühe, gemäß Herstellerangaben zubereitet und mit 0,3 % Hefeextrakt in ultrareinem Wasser ergänzt) und autoklavieren. Bei Raumtemperatur bis zu 2 Monate lagern.
  2. 1 L THY-Agar herstellen (3 % Todd-Hewitt-Brühe, 0,3 % Hefeextrakt und 1,5 % Agar in ultrareinem Wasser), autoklavieren und auf 60 °C abkühlen lassen, bevor es in Petrischalen gegossen wird. Bei 4 °C bis zu 3 Monate lagern.
  3. 150 ml Biofilmmedium herstellen (0,5× TY, ergänzt mit 10 mM Saccharose; 1,5 % Tryptone, 0,5 % Hefeextrakt und 10 mM Saccharose in ultrareinem Wasser) und filtrieren, um steril zu machen. Bei Raumtemperatur bis zu 1 Monat lagern.
  4. 1 L Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS; 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 und 0,24 g KH2PO4 in ultrareinem Wasser) herstellen und autoklavieren. Bei Raumtemperatur mehrere Monate lagern.
  5. 600 ml 10 mM Tris-HCl-Puffer, ergänzt mit 10 mM CaCl2 in ultrareinem Wasser (TC-Puffer; pH 7,2), herstellen und autoklavieren. Bei Raumtemperatur mehrere Monate lagern.
  6. 1 L ultrareines Wasser autoklavieren. Bei Raumtemperatur mehrere Monate lagern.

2. Herstellung der Proben

  1. Stellen Sie scheibenförmige Proben aus Point 4 (PF) und TPH her3 (TP) Dental-Composite in zwei Aufbauten in einer maßgefertigten Edelstahlform. Jeder Aufbau wird 40 Sekunden lang mit einer LED-Lichtaushärtungseinheit ausgehärtet. Die beiden Produkte weisen leicht unterschiedliche Zusammensetzungen und Füllstoffgehalte auf und erzeugen dadurch unterschiedliche Oberflächentopographien, auf denen die Biofilme angezüchtet werden.
    1. Proben relevanter Substrate können unter Verwendung etablierter Protokolle aus anderen Fachgebieten anstelle von Schritt 2.1 hergestellt werden.
  2. Bearbeiten und polieren Sie die Proben bis zu einer akzeptablen endgültigen Oberflächenbeschaffenheit, z. B. mithilfe eines halbautomatischen Schleif- und Poliergeräts. Spülen Sie die polierten Proben mit ultrareinem Wasser ab und trocknen Sie sie mit Druckluft.
  3. Sterilisieren Sie die Proben mit Ethylenoxidgas oder einer alternativen Sterilisationsmethode.

3. Biofilmbildung

  1. Inokulieren Sie eine einzelne Kolonie von S. mutans in 4 ml Übernachtkulturmedium (Schritt 1.1). Inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei 37 °C für 16–18 Stunden. Die optische Dichte (OD600) der Kultur sollte ≥0,9 betragen.
    1. Es ist am besten, eine Kolonie von Plattenkulturen zu verwenden, die zweimal von einem ursprünglichen Stamm durchgeimpft wurden, da dies zu einer konsistenteren Biofilmbildung führt.
  2. Stellen Sie eine 1:100-Verdünnung der Übernachtkultur (Schritt 1.1) in 10 ml Biofilmwachstumsmedium (Schritt 1.3) her.
  3. Überführen Sie sterile Kunststoffkompositproben (z. B. PF, TP) in sterile 12-Loch-Platten.
  4. Geben Sie 2,5 ml verdünntes Kulturmedium (Schritt 3.2) in die Vertiefungen für die Behandlungs- (Mundwasser) und Kontrollgruppen. Fügen Sie 2,5 ml steriles, unbeimpftes Biofilmwachstumsmedium zu den Sterilitätskontrollvertiefungen hinzu.
  5. Züchten Sie die Biofilme unter mikroaerophilen Bedingungen. Stellen Sie die Platten auf einen Schüttler bei 100 U/min in einen Inkubator bei 37 °C für 24 Stunden.
  6. Nach 24 Stunden saugen Sie das Medium unter aseptischen Bedingungen aus allen Vertiefungen ab und waschen Sie zweimal mit steriler PBS (Schritt 1.4; 2,5 ml/Vertiefung), wobei Sie die PBS nach jedem Waschgang abziehen. Ersetzen Sie jeweils 2,5 ml frisches Biofilmwachstumsmedium in jeder Vertiefung und inkubieren Sie weitere 24 Stunden unter identischen Bedingungen wie im vorherigen Schritt, sodass die gesamte Biofilmwachstumszeit 48 Stunden beträgt.
  7. Alternativ zu den oben genannten Schritten könnten Biofilme anderer Spezies auf Substraten mithilfe etablierter Protokolle gezüchtet werden.

4. Antibakterielle/Mundspül-Behandlungen

  1. Entfernen Sie das Medium, nachdem das Biofilmwachstum abgeschlossen ist.
  2. Geben Sie 2,5 ml Biotène PBF (BIO) oder Listerine Total Care (LTO) Mundspülung oder eine andere Behandlungsmodalität in die Vertiefungen der Behandlungsgruppen und fügen Sie 2,5 ml sterilem ultrareinem Wasser in die Vertiefung der Kontrollgruppe hinzu. Tauchen Sie die Proben für 60 Sekunden unter Rühren auf einem Rütteltablett bei 150 U/min ein, gemäß den Herstelleranweisungen, und saugen Sie anschließend sofort sowohl die Mundspülung als auch das ultrareine Wasser aus den Vertiefungen ab.
  3. Spülen Sie die Proben fünfmal mit jeweils 15 Sekunden Spüldauer mit sterilerm ultrareinem Wasser auf dem Rütteltablett bei 150 U/min, wobei das Wasser nach jedem Spülschritt abgesaugt wird.
  4. Alternativ zu den oben genannten Schritten könnten andere antibakterielle Wirkstoffe mithilfe etablierter Protokolle getestet werden.

5. Färbung

  1. Bereiten Sie die Farbstoffverdünnungen für die Biofilmanalyse vor.
    1. Bereiten Sie eine 5 mg/ml-Stammlösung von Concanavalin A, Alexa Fluor 647-Konjugat (AF), in 0,1 M Natriumbicarbonat, pH 8,3, vor. Lagern Sie diese bei -20 °C in Einweg-Aliquoten für mehrere Monate, da wiederholtes Einfrieren und Auftauen nicht empfohlen wird. Verdünnen Sie anhand dieser AF-Stammlösung eine 250 μg/ml-Lösung in TC-Puffer.
    2. Verdünnen Sie die vom Hersteller bereitgestellte 5 mM Syto 9-Stammlösung (SY) zu einer 10 μM-Lösung in TC-Puffer. Die verbleibende SY-Stammlösung ist bei -20 °C mehrere Monate lang haltbar.
    3. Verdünnen Sie die vom Hersteller bereitgestellte 5.000fach konzentrierte Sypro Red-Stammlösung (SR) zu einer 10fach konzentrierten Lösung in sterilem, ultrareinem Wasser. Die verbleibende SR-Stammlösung ist bei -20 °C mehrere Monate lang haltbar.
  2. Waschen Sie alle Biofilme zweimal mit TC-Puffer (2,5 ml/Vertiefung), indem Sie die Platte von Hand schwenken, und lassen Sie den zweiten Waschschritt 30 min bei Raumtemperatur einwirken. Absaugen.
  3. Geben Sie je 50 μl AF-Farbstofflösung auf jede Biofilmprobe. Färben Sie 30 min bei Raumtemperatur unter Lichtschutz. Waschen Sie zweimal mit TC-Puffer (2,5 ml/Vertiefung) und saugen Sie nach jedem Waschgang ab.
  4. Fügen Sie anschließend je 50 μl SY-Farbstofflösung auf jede Biofilmprobe hinzu. Färben Sie 30 min bei Raumtemperatur unter Lichtschutz. Waschen Sie zweimal mit sterilem, ultrareinem Wasser (2,5 ml/Vertiefung) und saugen Sie nach jedem Waschgang ab.
  5. Schließlich geben Sie je 50 μl SR-Farbstofflösung auf jede Biofilmprobe. Färben Sie 30 min bei Raumtemperatur unter Lichtschutz. Waschen Sie dreimal mit sterilem, ultrareinem Wasser (2,5 ml/Vertiefung) und saugen Sie nach jedem Waschgang ab.
  6. Überführen Sie die Proben in eine 6-Loch-Platte, wobei jede Probe in 6 ml steriles, ultrareines Wasser pro Vertiefung gegeben wird, um die konfokale Mikroskopie zu erleichtern.

6. Bildgebung mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie

  1. Erwerben Sie Bilder jedes Bestandteils (Färbung) innerhalb von Biofilmen der Behandlungs- und Kontrollgruppen mithilfe eines konfokalen Laserscanningmikroskops mit den in Tabelle 1 gezeigten Einstellungen. In dieser Studie wurde ein 63X-Tauchobjektiv mit einer numerischen Apertur von 0,9 und einer Arbeitsdistanz von 2,2 mm verwendet.
    Übersichtstabelle zur Biofilmfärbung; Laserwellenlängen (nm) und Emissionsbänder (nm) für EPS, Nukleinsäuren, Proteine
    Tabelle 1. Einstellungen des konfokalen Laserscanningmikroskops.

  1. Stellen Sie die Scan-Größe auf 250 μm x 250 μm und eine minimale Pixelauflösung von 512 x 512 ein, um CLSM-Bilder mit einer für die quantitative Analyse ausreichenden Auflösung aufzunehmen.
  2. Verwenden Sie den SY-Farbstoff, um die oberen und unteren Punkte des Biofilm-Bildstapels festzulegen, und wählen Sie dann eine für die quantitative Analyse geeignete z-Schrittweite (0,6 μm in dieser Studie). Optimieren Sie vor der Aufnahme eines Scans die Bild- und Farbstoffparameter (d. h. PMT-Spannung und Offset) mithilfe der QLUT-Option. Eine Farb-Wertetabelle wurde verwendet, um jedem Farbstoff Pseudofarben zuzuweisen (grün für SY, rot für SR und blau für AF), um die einzelnen Biofilm-Komponenten in der 3D-Rekonstruktion besser unterscheidbar zu machen.
  3. Nehmen Sie CLSM-Bilder bei 400 Hz mit sequenziellem Scannen im „zwischen Stapeln“-Modus auf, um die Erfassung von Bildern mehrerer Farbstoffe innerhalb desselben Biofilms zu optimieren.

7. Strukturanalyse von Biofilmen

  1. Analysieren Sie die mit der CLSM (konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie) aufgenommenen Bilder von Biofilmen mithilfe einer Bildanalyse-Software. Die folgenden Schritte beschreiben die Verwendung der ISA3D-Software12 zur Berechnung der strukturellen Parameter der aufgenommenen Biofilmbilder.
    1. Kopieren Sie die CLSM-Bilddateien jedes Biofilms in den Ordner „Images“, wie in der Software-Anleitung beschrieben. Achten Sie darauf, die von der Software geforderte Benennungskonvention für CLSM-Dateien einzuhalten. Die Software ermöglicht die Analyse von Dateien in Unterordnern im Batch-Modus, wodurch die gleichzeitige Analyse von Biofilmen aus Behandlungs- und Kontrollgruppen in einem Durchgang erleichtert wird.
    2. Geben Sie die Dimensionen der CLSM-Bilder entlang der x-, y- und z-Achse in die Felder dxy und dz des Hauptdialogfelds ein. Wählen Sie die Schwellwert- und Distanzabbildungs-Einstellungen gemäß der Software-Anleitung (im vorliegenden Fall wurden Otsu und Quasi-Euklidisch verwendet). Geben Sie einen geeigneten Namen für die Ergebnisdatei ein und führen Sie das Programm aus. Eine Ergebnisdatei wird im ISA-Ordner erstellt.
    3. Öffnen Sie die Ergebnisdatei, um die Werte für zwanzig 3D-strukturelle Parameter12 abzurufen, wie beispielsweise die Biovolumen- und mittlere Biofilmdicke (in dieser Studie gemessen), die die dreidimensionale Verteilung jeder Komponente (Färbung) innerhalb des Biofilms quantifizieren.

8. Visualisierung der Biofilmmorphologie

  1. Erstellen Sie eine Rekonstruktion überlagerter Komponenten (Färbungen) innerhalb jedes Biofilms mithilfe einer Bildanalyse-Software. Die folgenden Schritte beschreiben die Verwendung der Volocity-Software zur Erstellung von 3D-Rekonstruktionen.
    1. Erstellen Sie eine Bibliothek für jeden Biofilm, indem Sie die CLSM-Bilddateien gemäß der Anleitung in die Software kopieren.
    2. Verwenden Sie die Menüoption „3D Renderer“, um aus den CLSM-Bildern jedes Biofilms ein rekonstruiertes 3D-Bild zu erzeugen (für diese Studie wurde das Format HR Opacity verwendet).
    3. Drehen Sie das 3D-Bild, um alle Biofilme bezüglich der x-, y- und z-Koordinatenachsen einheitlich auszurichten. Machen Sie eine Aufnahme der korrekt ausgerichteten Biofilm-Rekonstruktion und exportieren Sie diese dann im TIFF-, JPEG- oder einem anderen geeigneten Format.
  2. Führen Sie eine visuelle Analyse der gleichzeitigen Verteilung von EPS, Proteinen und nukleinsäurehaltigen Bestandteilen innerhalb der Biofilme auf den rekonstruierten Bildern durch.
  3. Verwenden Sie den Pearson-Korrelationskoeffizienten und den Überlappungskoeffizienten nach Manders, um eine Kollokalisierungsanalyse mehrerer Biofilm-Komponenten durchzuführen (eine Kollokalisierung wurde in dieser Studie nicht gemessen).

9. Statistische Analyse

  1. Verwenden Sie separate gemischte Modelle für statistische Analysen, um die Mittelwerte struktureller Parameter zwischen der Mundspülgruppe und der Kontrollgruppe zu vergleichen (α = 0,05). Für diese Studie wurde die SAS-Software zur Durchführung der statistischen Analyse verwendet.

Ergebnisse

Repräsentative Ergebnisse für die Behandlungen (Mundspülungen) und die unbehandelte Kontrollgruppe sind in Tabelle 2 sowie in Abbildung 1 und Abbildung 2 dargestellt. Tabelle 2 zeigt die Mittelwerte und Standardabweichungen der biofilmstrukturellen Parameter Biovolumen (μm3) und mittlere Biofilmdicke (μm), die mit der ISA3D-Software berechnet wurden. Strukturelle Parameter von Biofilmen, die mit Mundspülungen behandelt wurden und sich signifikant von denen der Biofilme in der Kontrollgruppe unterschieden (p<0,05), sind durch rot hervorgehobene Mittelwerte und Standardabweichungen gekennzeichnet. Die Ergebnisse der statistischen Analysen mit gemischten Modellen zeigten, dass die Mundspülung BIO auf beiden Kompositharzen Biofilmstrukturen hervorrief, die sich signifikant von der Kontrolle unterschieden (p<0,05), während die Mundspülung LTO bei keinem der beiden Komposite signifikante Unterschiede verursachte (p>0,05). Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass die verbleibenden zellulären und extrazellulären Biofilmkomponenten nach den beiden Behandlungen mit Mundspülungen unterschiedlich waren. Es sollte außerdem beachtet werden, dass die auf den beiden Substraten (PF und TP) gezüchteten S. mutans-Biofilme sich hinsichtlich ihrer 3D-Struktur unterschieden, obwohl sie unter ähnlichen Bedingungen kultiviert wurden und beide Substrate mit ähnlichen Schleifmitteln poliert worden waren.

Die gleichzeitige Verteilung von EPS, Proteinen und Nukleinsäuren innerhalb von Biofilmen kann mittels 3D-Rekonstruktionen visualisiert werden, die mit der Volocity-Software erstellt wurden. Abbildung 1 und 2 zeigen repräsentative Rekonstruktionen von Biofilmen der Kontrollgruppe, die auf PF- bzw. TP-Harzkompositen gewachsen sind. Die blaue Färbung stellt EPS in S. mutans-Biofilmen dar, die grüne Färbung zeigt Nukleinsäuren und die rote Färbung markiert Proteine. Der dazwischen liegende Raum kann von Wasser oder anderen nicht fluoreszenzmarkierten Bestandteilen des Biofilms eingenommen sein.

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Abbildung 1. Eine repräsentative 3D-Rekonstruktion eines S. mutans-Biofilms, der auf einem PF-Harzkomposit in der Kontrollgruppe (nicht mit Mundwasser behandelt) gewachsen ist. Die gleichzeitige Überlagerung der drei Färbungen innerhalb eines einzelnen Biofilms ermöglicht die simultane Visualisierung der Bestandteile EPS (blaue Färbung), Nukleinsäure (grüne Färbung) und Protein (rote Färbung) in S. mutans-Biofilmen. (1 Einheit = 24 μm). Hier klicken, um die Abbildung vergrößert anzuzeigen.

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Abbildung 2. Eine repräsentative 3D-Rekonstruktion eines S. mutans-Biofilms, der auf einem TP-Harzkomposit in der Kontrollgruppe (nicht mit Mundwasser behandelt) gewachsen ist. Die gleichzeitige Überlagerung der drei Färbungen innerhalb eines einzelnen Biofilms ermöglicht die simultane Visualisierung der Bestandteile EPS (blaue Färbung), Nukleinsäure (grüne Färbung) und Protein (rote Färbung) in S. mutans-Biofilmen. (1 Einheit = 24 μm). Klicken Sie hier, um die Abbildung in größerer Ansicht anzusehen.

KunststoffkompositPunkt 4TPH3
MundspülungKomponenteBV (μm3)MT (μm)BV (μm3)MT (μm)
Biotène PBFNukleinsäuren279.517±53.2919,32±2,80195.033±42.0147,45±3,70
EPS344.902±56.38635,22±17,19197.840±62.3519,83±7,26
Proteine298.796±62.86854,21±21,65216.033±66.65424,33±39,64
Listerine Total CareNukleinsäuren355.707±110.44426,45±14,21273.296±47.32313,43±2,89
EPS494.099±180.59264,90±26,68329.150±47.14534,35±30,32
Proteine348.416±161.31658,68±47,28303.150±54.70534,18±41,46
Kontrolle (nicht behandelt)Nukleinsäuren388.375±42.15251,15±40,66327.809±39.40017,08±1,65
EPS660.448±173.19791,37±74,84363.850±67.61228,33±15,07
Proteine517.274±119.475127,96±73,84353.161±56.51821,17±4,41

Tabelle 2. Mittelwerte und Standardabweichungen des Biovolumens (BV) und der mittleren Biofilmdicke (MT) von Biofilmen, die mit BIO oder LTO behandelt wurden, sowie unbehandelter Biofilme (Kontrollgruppe). Strukturparameter von Biofilmen, die mit Mundspülungen behandelt wurden und sich signifikant von denen der Kontrollgruppe unterschieden (p<0,05), sind durch rot hervorgehobene Mittelwerte und Standardabweichungen gekennzeichnet.

Diskussion

Die Aufnahme von CLSM-Bildern muss in der Art und Weise und dem Format erfolgen, die für die Quantifizierung von Biofilmen und für die Kolokalisationsanalyse erforderlich sind, so dass die Verteilung der Signalintensität in jedem Bild eine zuverlässige Darstellung der Verteilung jedes Fluorochroms im Biofilmstapel ist. Die Signalintensität sollte vom Rauschen und vom Hintergrund10,11 unterscheidbar sein, nicht durch Autofluoreszenz vom Substrat beeinflusst werden und aufgrund der spektralen Interferenz zwischen den verwendeten Fluorochromen11 ein minimales Durchscheinen aufweisen. Rauschen ist eine unvermeidliche Einschränkung der Fluoreszenzmikroskopie11, und die Bildqualität kann manchmal aus technischen oder logistischen Gründen eingeschränkt sein. Die Identifizierung von Fluorochromen mit minimaler spektraler Überlappung ist entscheidend für den Erfolg dieser Methode, kann aber kompliziert sein. Darüber hinaus stellt die Quantifizierung mehrerer Fluorochrome ein multifaktorielles Problem dar. Daher ist es nicht verwunderlich, dass es nur sehr wenigen Untersuchungen gelungen ist, die gleichzeitige Verteilung von mehr als zwei Komponenten innerhalb der Strukturen von Biofilmen zu quantifizieren.

Das Ziel dieser Studie war es, eine Methodik zu entwickeln, die aus unterschiedlichen, aber miteinander verbundenen Schritten zur Quantifizierung und zum Vergleich der gleichzeitigen 3-dimensionalen Verteilungen von drei zellulären und extrazellulären Komponenten innerhalb von Biofilmen besteht. Der beschriebene Biofilmwachstumsassay ermöglicht das Biofilmwachstum auf relevanten Substraten und erzeugt Biofilmstrukturen, die reproduzierbar sind, wie die in Tabelle 1 berichteten Ergebnisse zeigen. Die Kombination aus neuartiger simultaner Färbung von EPS, Proteinen und Nukleinsäurekomponenten mit der Messung von 3D-Biofilm-Strukturparametern führt zu quantifizierbaren Verteilungen von Komponenten innerhalb von Biofilmen. Eine qualitative visuelle Analyse der gleichzeitigen Verteilung von EPS, Proteinen und Nukleinsäuren innerhalb der Biofilme ist durch die Rekonstruktion von überlagerten Färbungen innerhalb jedes Biofilms möglich. Die ISA3D-Software12 enthält zusätzlich zu den traditionell gemessenen Parametern wie Porosität und Biofilmdicke mehrere einzigartige Strukturparameter wie fraktale Dimension, Homogenität und Biofilmrauheitskoeffizient, um die Quantifizierung der 3D-Strukturen von Biofilmen zu verbessern. Die statistische Analyse der strukturellen Parameter des Biofilms ermöglicht relevante Vergleiche von Biofilmen unter spezifischen experimentellen Bedingungen, wie z.B. antibakterielle/antifoulingende Wirksamkeit (z.B. nach Behandlung mit Mundspülungen) oder über die Zeit (zeitliche Effekte).

Mit dieser Methodik wurden die gleichzeitigen 3D-Verteilungen von drei Hauptkomponenten innerhalb von S. mutans-Biofilmen , die auf relevanten Substraten gezüchtet wurden, effizient und erfolgreich quantifiziert und verglichen, wodurch zwei Herausforderungen bei der gleichzeitigen Bewertung von Biofilmkomponenten überwunden wurden. Diese Methode kann auch verwendet werden, um die Wirksamkeit von antibakteriellen Behandlungen oder Antifouling-Maßnahmen gegen mehrere Biofilmkomponenten zu bestimmen, wie in dieser Studie anhand von Mundspülungen gezeigt wurde. Darüber hinaus kann der Großteil der oben beschriebenen Protokolle durch Protokolle für die Herstellung relevanter Substrate und Biofilmwachstumsassays relevanter Mikroorganismen ersetzt werden. Daher hat diese Methode eine breite Anwendung, da sie den Vergleich von 3D-Strukturen/-Architektur von in vitro und in vivo Biofilmen in einer Vielzahl von Disziplinen ermöglicht, einschließlich der Medizin, Zahnmedizin, Geologie und Meereswissenschaften.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben. Die Produktion und der kostenlose Zugang zu diesem Artikel werden von Leica Microsystems gesponsert.

Danksagungen

Die Finanzierung dieser Studie wurde durch den Zuschuss 1R15DE019566-01A1 der National Institutes of Health/NIDCR bereitgestellt. Dr. Jim Henthorn (OUHSC Flow and Image Cytometry Laboratory) ist für seine technische Unterstützung bei der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie bekannt. Dr. Fernando Esteban Florez (Abteilung für Dentalmaterialien) dankt für seine technische Unterstützung während der Dreharbeiten zu diesem Video.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Bacto AgarBecton, Dickinson and Company214010
Bacto Todd Hewitt BrothBecton, Dickinson and Company249240
Hefeextrakt, granuliertEMD Millipore1.03753.0500
Bacto TryptonBecton, Dickinson and Company211705
OmniPur SaccharoseEMD Millipore8510
Kaliumchlorid, ACS-Reagenz, 99,0-100,5%Sigma-AldrichP3911-500G
Kaliumphosphat, einbasisch, ≥ 99,0%, ACS-ReagenzSigma-AldrichP0662-500G
NatriumchloridSigma-AldrichS9888-500G
Natriumphosphat, monobasisch, MonohydratEMD MilliporeSX0710-1
Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 99,8+%, ACS-ReagenzSigma-Aldrich252859-500G
Concanavalin A, Alexa Fluor 647 KonjugatInvitrogenC21421
Syto 9InvitrogenS34854
Sypro RedInvitrogenS12012 oder S6653
Biotè ne PBF MundspülungGlaxoSmithKlineN/A
Listerine Total CareMcNeil-PPC, Inc.N/A

Referenzen

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