Gleichzeitige Quantifizierung zellulärer und extrazellulärer Bestandteile von Biofilmen

Summary

Es wird ein Protokoll für die gleichzeitige Quantifizierung und den Vergleich von drei zellulären und extrazellulären Komponenten innerhalb von Biofilmen vorgestellt. Die Methodik umfasst den Einsatz von konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie, Biofilm-Strukturanalyse- und Visualisierungssoftware sowie statistischer Analysesoftware.

Abstract

Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung von Biofilmen. Nur sehr wenige Untersuchungen haben die gleichzeitige Verteilung von mehr als zwei Komponenten innerhalb von Biofilmen erfolgreich quantifiziert, weil: 1) die Auswahl von Fluoreszenzfarbstoffen mit minimaler spektraler Überlappung kompliziert ist und 2) die Quantifizierung mehrerer Fluorochrome ein multifaktorielles Problem darstellt. ziele: Bericht über eine Methodik zur Quantifizierung und zum Vergleich gleichzeitiger 3-dimensionaler Verteilungen von drei zellulären/extrazellulären Komponenten von Biofilmen, die auf relevanten Substraten gezüchtet wurden. Methodik: Die Methode besteht aus unterschiedlichen, miteinander verbundenen Schritten, die das Biofilmwachstum, die Färbung, die CLSM-Bildgebung, die Biofilmstrukturanalyse und -visualisierung sowie die statistische Analyse von Strukturparametern umfassen. Biofilme von Streptococcus mutans (Stamm UA159) wurden 48 Stunden lang auf sterilen Proben von Point 4 und TPH³ Harzkompositen gezüchtet. Die Proben wurden anschließend 60 Sekunden lang entweder in Mundspülungen mit Biotène PBF (BIO) oder Listerine Total Care (LTO) oder Wasser getaucht (Kontrollgruppe; n=5/Gruppe). Biofilme wurden mit Fluorochromen für extrazelluläre polymere Substanzen, Proteine und Nukleinsäuren gefärbt, bevor die Bildgebung mit CLSM erfolgte. Die mit der Bildanalysesoftware ISA3D berechneten strukturellen Parameter des Biofilms waren das Biovolumen und die mittlere Biofilmdicke. Gemischte Modelle: Statistische Analysen verglichen strukturelle Parameter zwischen Mundspül- und Kontrollgruppe (SAS-Software; α=0,05). Die Volocity-Software ermöglichte die Visualisierung von 3D-Verteilungen von überlagerten Biofilmkomponenten (Fluorochromen). Befund: Mundwasser BIO erzeugte Biofilmstrukturen, die sich signifikant von der Kontrolle (p<0,05) auf beiden Harzkompositen unterschieden, während LTO bei keinem der beiden Produkte Unterschiede (p>0,05) hervorrief. Schlüsse: Diese Methodik quantifizierte und verglich effizient und erfolgreich die gleichzeitigen 3D-Verteilungen von drei Hauptkomponenten innerhalb von S. mutans-Biofilmen auf relevanten Substraten und überwand damit zwei Herausforderungen bei der gleichzeitigen Bewertung von Biofilmkomponenten. Diese Methode kann auch verwendet werden, um die Wirksamkeit von antibakteriellen/Antifouling-Mitteln gegen mehrere Biofilmkomponenten zu bestimmen, wie anhand von Mundspülungen gezeigt wird. Darüber hinaus hat diese Methode eine breite Anwendung, da sie den Vergleich von 3D-Strukturen/Architektur von Biofilmen in einer Vielzahl von Disziplinen ermöglicht.

Introduction

Biofilme sind strukturierte mikrobielle Gemeinschaften, die in einer selbst produzierten extrazellulären Matrix eingekapselt und an biologische oder inerte Oberflächen gebunden sind¹. Biofilme stellen eine gemeinsame Lebensweise vieler Bakterien dar und bilden sich, indem sie schrittweise von frei schwebenden (planktonischen) Zellen zu komplexen Multispezies-Gemeinschaften übergehen. Die inhärente Resistenz von Biofilmen gegen antimikrobielle Wirkstoffe ist die Ursache für viele anhaltende und chronische bakterielle Infektionen^1,2, wie orale Biofilme (Zahnbelag) zeigen. Kariogene Mikroorganismen wie Mutans-Streptokokken verarbeiten Saccharose und andere Kohlenhydrate, um eine extrazelluläre Matrix zu bilden und Säuren zu erzeugen, die die Zahnstruktur demineralisieren und Karies verursachen können. Die meisten Biofilmmatrizen sind Biopolymere, die aus zellulären und extrazellulären Komponenten wie Exopolysacchariden (EPS), Proteinen und Nukleinsäuren^{bestehen 3,4}.

Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM), die am weitesten verbreitete Technik für die Fluoreszenzbildgebung, hat die optische Bildgebung in der Biologie radikal verändert, da sie in der Lage ist, 3D-Bilder von hydratisierten biologischen Strukturen ohne Fixierung zu sammeln^5,6,7. Bei dieser zerstörungsfreien Technik werden Bilder von Dünnschliffen innerhalb eines interessierenden Bereichs auf der Probe so gesammelt, dass der Beitrag von unscharfem Licht entfernt wird. Die Qualität und Auflösung der mit CLSM aufgenommenen Bilder geht über das hinaus, was mit der Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie möglich ist. Ein großer Nachteil von CLSM besteht darin, dass das Scannen von Bildern langsamer erfolgt als bei Weitfeldmikroskopietechniken, bei denen ganze Bilder gleichzeitig erfasst werden⁵. Mit einer wachsenden Auswahl an Fluorochromen, Lasern und Filtern hat sich CLSM jedoch zu einer der vorherrschenden Techniken für die multispektrale Bildgebung entwickelt^5,7.

Frühere Studien haben gezeigt, dass CLSM ein nützliches Werkzeug ist, um die Struktur oder Architektur von Biofilmen zu untersuchen, indem ein oder zwei fluoreszierende Tags oder Färbungen verwendet werden, um ein besseres Verständnis der Verteilung von EPS und Zellen innerhalb von Biofilmen und insbesondere innerhalb der extrazellulären Matrix^{zu erhalten 7,8}. Theoretisch ist die Fluoreszenzfärbung/-markierung mehrerer Komponenten wünschenswert, um die detaillierte Struktur und Kolokalisation von zellulären und extrazellulären Komponenten innerhalb von Biofilmen zu untersuchen. Die gleichzeitige Analyse verschiedener Komponenten innerhalb von Biofilmen kann jedoch eine Herausforderung darstellen, weil: 1) die Auswahl von Fluoreszenzfarbstoffen mit minimaler spektraler Überlappung kompliziert ist und 2) die Quantifizierung mehrerer Fluorochrome ein multifaktorielles Problem darstellt. Die Kolokalisation mit mehreren Fluorochromen erfordert die Verwendung hochspezifischer Färbungen mit minimaler spektraler Interferenz, um Durchschlageffekte zu vermeiden, die auftreten, wenn zwei Fluorochrome eine signifikante Überlappung in ihrem spektralen Peak aufweisen, wodurch eines stärker angeregt wird als das andere⁹. Im Idealfall würden Fluorochrome mit Anregungsspektren, die sich nicht überlappen, die besten Ergebnisse liefern, jedoch ist es sehr schwierig, Flecken zu finden, die dieses Kriterium erfüllen. Stattdessen wird die Auswahl der Färbungen durch die Auswahl von Fluorochromen optimiert, deren Emissionsspektren eine minimale Überlappung aufweisen, so dass die Färbungen einzeln innerhalb eines begrenzten Betrachtungswellenlängenbandes⁹ betrachtet werden können.

Überlagerung von Fluoreszenzbildern ist wahrscheinlich die am weitesten verbreitete Methode zur Bewertung der gleichzeitigen Verteilung von Fluorochromen. Die Kolokalisation der verschiedenen Komponenten erscheint als Überlappung verschiedener Farben durch mehrere Kanäle, die von den untersuchten Fluorochromen erzeugt werden¹⁰. Die Werkzeuge zur Anzeige von Mehrkanal-Fluoreszenzbildern als zusammengeführte Farbbilder sind in den meisten CLSM-Softwares und biologischen Bildanalyse-Softwares verfügbar. Obwohl die Überlagerung von Bildern für die räumliche Bewertung der Kolokalisierung nützlich ist, können die Bilder nur durch visuelle Analyse qualitativ untersucht werden. Dies liefert nur eine begrenzte Menge an Informationen, da diese Darstellungen im Allgemeinen nicht hilfreich sind, um die Kolokalisation unter verschiedenen experimentellen Bedingungen zu quantifizieren, noch bestimmen, ob die Kolokalisation die zufällige Koinzidenz^{übersteigt 11}. Mit quantitativen Methoden wurde bisher die 3-dimensionale Struktur von Biofilmen und Biofilmbestandteilen mit quantitativen Methoden analysiert, und noch weniger quantifizierten die Wirkung von antibakteriellen Behandlungen oder Antifouling-Maßnahmen auf Biofilmkomponenten.

Das Ziel dieser Studie war es, eine Methodik zur Quantifizierung und zum Vergleich der gleichzeitigen 3-dimensionalen Verteilungen von drei zellulären und extrazellulären Komponenten von Biofilmen zu erstellen. Die Methode besteht aus unterschiedlichen, aber miteinander verbundenen Schritten, die das Biofilmwachstum, die Färbung, die CLSM-Bildgebung von Biofilmen, die Biofilmstrukturanalyse und -visualisierung sowie die statistische Analyse von Strukturparametern umfassen. Der Biofilmwachstumsassay ermöglicht das Biofilmwachstum auf relevanten Substraten und erzeugt Biofilmstrukturen, die reproduzierbar sind. Die Kombination aus neuartiger simultaner Färbung von EPS, Proteinen und Nukleinsäurekomponenten mit der Messung von 3D-Biofilm-Strukturparametern führt zu quantifizierbaren Verteilungen von Komponenten innerhalb von Biofilmen. Die statistische Analyse der strukturellen Parameter des Biofilms ermöglicht die Bewertung von Biofilmen unter bestimmten experimentellen Bedingungen (z.B. nach Behandlung mit Mundspülungen), wie im nächsten Abschnitt beschrieben wird.

Protocol

1. Vorbereitung von Medien und Reagenzien

1. 300 ml Übernacht-Nährmedium (THY; 3 % Todd Hewitt Bouillon, zubereitet nach Herstellerangaben, ergänzt mit 0,3 % Hefeextrakt in Reinstwasser) herstellen und autoklavieren. Bei Raumtemperatur bis zu 2 Monate lagern.
2. 1 l THY-Agar (3 % Todd-Hewitt-Brühe, 0,3 % Hefeextrakt und 1,5 % Agar in Reinstwasser) herstellen, autoklavieren und auf 60 °C abkühlen lassen, bevor es in Petrischalen gegossen wird. Bei 4 °C bis zu 3 Monate lagern.
3. Stellen Sie 150 ml Biofilm-Wachstumsmedium (0,5X TY, ergänzt mit 10 mM Saccharose; 1,5 % Trypton, 0,5 % Hefeextrakt und 10 mM Saccharose in Reinstwasser) her und sterilisieren Sie es. Bei Raumtemperatur bis zu 1 Monat lagern.
4. 1 l phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS; 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na₂HPO₄ und 0,24 g KH₂PO₄ in Reinstwasser) herstellen und autoklavieren. Mehrere Monate bei Raumtemperatur lagern.
5. 600 ml 10 mM Tris HCl-Puffer, ergänzt mit 10 mM CaCl₂, in Reinstwasser (TC-Puffer; pH 7,2) herstellen und autoklavieren. Mehrere Monate bei Raumtemperatur lagern.
6. Autoklavieren Sie 1 L Reinstwasser. Mehrere Monate bei Raumtemperatur lagern.

2. Herstellung von Proben

1. Stellen Sie scheibenförmige Proben von Dentalharz-Kompositen Point 4 (PF) und TPH³ (TP) in einer speziell angefertigten Edelstahlform in zwei Schritten her. Jedes Inkrement wird mit einer LED-Lichthärtungseinheit 40 Sekunden lang lichtgehärtet. Die beiden Produkte haben leicht unterschiedliche Zusammensetzungen und Füllstoffgehalte und erzeugen dadurch unterschiedliche Oberflächentopographien, auf denen die Biofilme gezüchtet werden.
   1. Proben relevanter Substrate könnten mit etablierten Protokollen aus anderen Disziplinen anstelle von Schritt 2.1 hergestellt werden.
2. Finishen und polieren Sie Proben auf eine akzeptable endgültige Oberflächengüte, z. B. mit Hilfe einer halbautomatischen Schleifmaschine-Poliermaschine. Spülen Sie polierte Proben mit Reinstwasser ab und trocknen Sie sie mit Druckluft.
3. Sterilisieren Sie die Proben mit Ethylenoxidgas oder einer alternativen Sterilisationsmethode.

3. Wachstum von Biofilmen

1. Eine einzelne Kolonie von S. mutans wird in 4 ml Übernacht-Nährmedium eingeimpft (Schritt 1.1). Über Nacht bei 37 °C für 16-18 Stunden inkubieren. Die optische Dichte (OD₆₀₀) der Kultur sollte ≥0,9 betragen.
   1. Es ist am besten, ein Volk aus Plattenkulturen zu verwenden, die 2x aus einem ursprünglichen Stamm durchgegangen sind, da dies zu einem gleichmäßigeren Biofilmwachstum führt.
2. Erstellen Sie eine Verdünnung im Verhältnis 1:100 mit der Übernachtkultur (Schritt 1.1) in 10 ml Biofilm-Wachstumsmedium (Schritt 1.3).
3. Übertragen Sie sterile Harzkompositproben (z. B. PF, TP) auf sterile 12-Well-Platten.
4. 2,5 ml verdünntes Kulturmedium (Schritt 3.2) zur Behandlung (Mundwasser) und in die Kontrollgruppen in die Vertiefungen geben. Geben Sie 2,5 ml steriles, unbeimpftes Biofilm-Wachstumsmedium in die Sterilitätskontroll-Wells.
5. Züchten Sie die Biofilme unter mikroaerophilen Bedingungen. Die Platten bei 100 U/min in einen Inkubator bei 37 °C für 24 Stunden in einen Schüttler stellen.
6. Nach 24 Stunden das Medium aseptisch aus allen Vertiefungen aspirieren und zweimal mit sterilem PBS waschen (Schritt 1,4; 2,5 ml/Well), wobei das PBS nach jedem Waschen aspiriert wird. Füllen Sie 2,5 ml frisches Biofilm-Wachstumsmedium in jeder Vertiefung auf und inkubieren Sie weitere 24 Stunden unter identischen Bedingungen wie im vorherigen Schritt, um eine Gesamtwachstumszeit des Biofilms von 48 Stunden zu erhalten.
7. Anstelle der oben genannten Schritte könnten Biofilme anderer Arten unter Verwendung etablierter Protokolle auf Substraten gezüchtet werden.

4. Antibakterielle/Mundwasserbehandlungen

1. Aspirieren Sie das Medium, nachdem das Biofilmwachstum abgeschlossen ist.
2. Geben Sie 2,5 ml Biotène PBF (BIO) oder Listerine Total Care (LTO) Mundwasser oder eine andere Behandlungsmethode in die Vertiefungen für die Behandlungsgruppen und geben Sie 2,5 ml steriles Reinstwasser in die Vertiefung der Kontrollgruppe. Tauchen Sie die Proben gemäß den Anweisungen des Herstellers 60 Sekunden lang ein, während Sie die Platten auf einem Orbitalschüttler bei 150 U/min bewegen. Saugen Sie sofort sowohl das Mundwasser als auch das Reinstwasser aus den Brunnen ab.
3. Waschen Sie die Proben 5x für 15 Sekunden pro Waschgang mit sterilem Reinstwasser auf dem Orbitalschüttler bei 150 U/min und saugen Sie nach jedem Waschschritt Wasser an.
4. Anstelle der oben genannten Schritte könnten andere antibakterielle Wirkstoffe unter Verwendung etablierter Protokolle getestet werden.

5. Färben

1. Bereiten Sie die Fleckenverdünnungen für die Biofilmanalyse vor.
   1. Bereiten Sie eine 5 mg/ml Stammlösung von Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Konjugat (AF) in 0,1 M Natriumbicarbonat pH 8,3 vor. Bei -20 °C in Einmal-Aliquoten mehrere Monate lagern, da vom Einfrieren und Auftauen abgeraten wird. Unter Verwendung dieser AF-Stammlösung wird eine Verdünnung von 250 μg/ml in TC-Puffer hergestellt.
   2. Bereiten Sie eine Verdünnung von 10 μM mit der vom Hersteller bereitgestellten 5 mM Syto 9-Stammlösung (SY) in TC-Puffer vor. Die restliche SY-Stammlösung mehrere Monate bei -20 °C lagern.
   3. Bereiten Sie eine 10-fache Verdünnung mit der vom Hersteller bereitgestellten 5.000-fachen Sypro Red Stammlösung (SR) in sterilem Reinstwasser vor. Lagern Sie die restliche SR-Stammlösung mehrere Monate lang bei -20 °C.
2. Waschen Sie alle Biofilme 2x mit TC-Puffer (2,5 ml/Well) mit einer Handschwenkbewegung, so dass die zweite Wäsche 30 Minuten bei Raumtemperatur in der Platte verbleibt. Aspirieren.
3. Geben Sie einen 50-μl-Tropfen AF-Färbung auf jede Biofilmprobe. 30 min bei Raumtemperatur lichtgeschützt beizen. 2x mit TC-Puffer (2,5 ml/Well) waschen und nach jeder Wäsche aspirieren.
4. Anschließend einen 50 μl Tropfen SY-Fleck auf jede Biofilmprobe auftragen. 30 min bei Raumtemperatur lichtgeschützt beizen. 2x mit sterilem Reinstwasser (2,5 ml/Well) waschen, nach jeder Wäsche absaugen
5. Geben Sie abschließend einen 50-μl-Tropfen SR-Färbung auf jede Biofilmprobe. 30 min bei Raumtemperatur lichtgeschützt beizen. 3x mit sterilem Reinstwasser (2,5 ml/Well) waschen und nach jedem Waschgang aspirieren.
6. Übertragen Sie die Proben auf eine 6-Well-Platte und legen Sie eine Probe pro Well in 6 ml steriles Reinstwasser, um die konfokale Mikroskopie zu erleichtern.

6. Bildgebung mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie

1. Erfassen Sie Bilder jeder Komponente (Färbung) innerhalb der Biofilme der Behandlungs- und Kontrollgruppen mit den in Tabelle 1 gezeigten konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopeinstellungen. In dieser Studie wurde eine 63-fache Tauchlinse mit einer numerischen Apertur von 0,9 mm verwendet, die einen Arbeitsabstand von 2,2 mm hat.
   
   Tabelle 1. Einstellungen für konfokale Laser-Scanning-Mikroskope.

2. Stellen Sie die Scangröße auf 250 μm x 250 μm und eine minimale Pixelauflösung von 512 x 512 ein, um CLSM-Bilder mit einer für die quantitative Analyse ausreichenden Auflösung aufzunehmen.
3. Verwenden Sie den SY-Farbstoff, um die oberen und unteren Punkte des Biofilm-Bildstapels festzulegen, und stellen Sie dann den Z-Schritt so ein, dass er für die quantitative Analyse geeignet ist (0,6 μm für diese Studie). Optimieren Sie vor der Erfassung eines Scans die Bild- und Fleckenparameter (z. B. PMT-Spannung und Offset) mit der QLUT-Option. Eine Farbnachschlagetabelle wurde verwendet, um jedem Fleck Pseudofarben zuzuweisen (grün für SY, rot für SR und blau für AF), um jede Biofilmkomponente in der 3D-Rekonstruktion besser unterscheidbar zu machen.
4. Erfassen Sie CLSM-Bilder bei 400 Hz durch sequentielles Scannen im "Between Stacks"-Modus, um die Aufnahme von Bildern mehrerer Färbungen innerhalb desselben Biofilms zu optimieren.

7. Biofilm-Strukturanalyse

1. Analysieren Sie die CLSM-Bilder, die mit einer Bildanalysesoftware für Biofilme gesammelt wurden. Die folgenden Schritte beschreiben die Verwendung der ISA3D-Software¹² zur Berechnung der strukturellen Parameter der gesammelten Biofilmbilder.
   1. Kopieren Sie die CLSM-Bilddateien für jeden Biofilm in den Ordner Images, wie im Handbuch der Software angegeben. Stellen Sie sicher, dass die von der Software erforderliche Namenskonvention für CLSM-Dateien eingehalten wird. Die Software ermöglicht die Analyse von Dateien innerhalb von Unterordnern im Batch-Modus und erleichtert so die Analyse von Behandlungs- und Kontrollgruppen-Biofilmen im selben Lauf.
   2. Geben Sie die Abmessungen der X-, Y- und Z-Achse von CLSM-Bildern in die Felder dxy und dz des Hauptdialogfelds ein. Wählen Sie die Einstellungen für die Schwellenwert- und Entfernungskartierung, wie im Handbuch der Software beschrieben (für diese Studie wurden jeweils Otsu und Quasi-Euklidisch verwendet). Geben Sie einen geeigneten Namen für die Ergebnisdatei ein, und führen Sie dann das Programm aus. Eine Ergebnisdatei wird im Ordner ISA erstellt.
   3. Sehen Sie sich die Ergebnisdatei an, um Werte für zwanzig 3D-Strukturparameter¹² zu erhalten, wie z. B. das Biovolumen und die mittlere Biofilmdicke (gemessen in dieser Studie), die die 3D-Verteilung jeder Komponente (Färbung) innerhalb des Biofilms quantifizieren.

8. Visualisierung der Biofilmstruktur

1. Erstellen Sie eine Rekonstruktion der überlagerten Komponenten (Flecken) innerhalb jedes Biofilms mit Hilfe einer Bildanalysesoftware. Die folgenden Schritte beschreiben die Verwendung der Volocity-Software zur Erstellung von 3D-Rekonstruktionen.
   1. Erstellen Sie für jeden Biofilm eine Bibliothek, indem Sie CLSM-Bilddateien in die Software kopieren, wie im Handbuch beschrieben.
   2. Verwenden Sie die Menüoption 3D-Renderer, um ein rekonstruiertes 3D-Bild aus den CLSM-Bildern jedes Biofilms zu erstellen (für diese Studie wurde das HR-Opazitätsformat verwendet).
   3. Drehen Sie das 3D-Bild, um alle Biofilme in Bezug auf die x-, y- und z-Koordinatenachsen auf ähnliche Weise auszurichten. Nehmen Sie einen Schnappschuss der korrekt ausgerichteten Biofilmrekonstruktion auf und exportieren Sie den Schnappschuss dann in TIFF, JPEG oder einem anderen geeigneten Format.
2. Führen Sie eine visuelle Analyse der gleichzeitigen Verteilung von EPS, Proteinen und Nukleinsäurekomponenten innerhalb von Biofilmen auf den rekonstruierten Bildern durch.
3. Verwenden Sie den Korrelationskoeffizienten von Pearson und den Überlappungskoeffizienten von Manders, um eine Kolokalisationsanalyse mehrerer Biofilmkomponenten durchzuführen (die Kolokalisation wurde in dieser Studie nicht gemessen).

9. Statistische Analyse

1. Verwenden Sie separate statistische Analysen mit gemischten Modellen, um die Mittelwerte der strukturellen Parameter zwischen Mundwasser- und Kontrollgruppen (α=0,05) zu vergleichen. Für diese Studie wurde die Software SAS verwendet, um die statistische Analyse durchzuführen.

Results

Repräsentative Ergebnisse für die Behandlungen (Mundspülungen) und die unbehandelte Kontrollgruppe sind in Tabelle 2 und den Abbildungen 1 und 2 dargestellt. Tabelle 2 zeigt die Mittel- und Standardabweichungswerte der Biofilm-Strukturparameter Biovolumen (^{μm 3}) und mittlere Biofilmdicke (μm), die mit der ISA3D-Software berechnet wurden. Strukturparameter von Biofilmen, die mit Mundwasser behandelt wurden und sich signifikant von denen von Biofilmen in der Kontrollgruppe (p<0,05) unterschieden, sind rot markiert mit Mittelwerten und Standardabweichungen. Die Ergebnisse der statistischen Analysen der gemischten Modelle zeigten, dass Mundwasser BIO Biofilmstrukturen erzeugte, die sich signifikant von der Kontrolle (p<0,05) auf beiden Harzkompositen unterschieden, während Mundwasser LTO auf beiden Harzkompositen keine signifikanten Unterschiede (p>0,05) hervorrief. Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass sich die nach den beiden Mundspülungen verbleibenden zellulären und extrazellulären Biofilmkomponenten unterschieden. Es sollte auch beachtet werden, dass sich die S. mutans-Biofilme, die auf den beiden Substraten (PF und TP) gezüchtet wurden, in ihrer 3D-Struktur unterschieden, obwohl sie unter ähnlichen Bedingungen gezüchtet wurden und beide Substrate mit ähnlichen Schleifmitteln poliert wurden.

Die gleichzeitige Verteilung von EPS, Proteinen und Nukleinsäuren innerhalb von Biofilmen kann über die 3D-Rekonstruktionen visualisiert werden, die mit der Volocity-Software erstellt wurden. Die Abbildungen 1 und 2 zeigen repräsentative Rekonstruktionen von Biofilmen der Kontrollgruppe, die auf PF- bzw. TP-Harzkompositen gezüchtet wurden. Der blaue Fleck repräsentiert EPS innerhalb von S. mutans-Biofilmen, der grüne Fleck zeigt Nukleinsäuren und der rote Fleck zeigt Proteine. Der dazwischen liegende Raum kann von Wasser oder anderen nicht fluoreszenzmarkierten Biofilmkomponenten eingenommen werden.

Abbildung 1. Eine repräsentative 3D-Rekonstruktion des Biofilms von S. mutans, der in der Kontrollgruppe auf PF-Harzkomposit gezüchtet wurde (nicht mit Mundwasser behandelt). Die gleichzeitige Überlagerung der drei Färbungen innerhalb eines einzigen Biofilms ermöglicht die gleichzeitige Visualisierung von EPS- (blauer Fleck), Nukleinsäure- (grüner Fleck) und Proteinkomponenten (roter Fleck) innerhalb von S. mutans-Biofilmen. (1 Einheit = 24 μm). Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2. Eine repräsentative 3D-Rekonstruktion des Biofilms von S. mutans, der in der Kontrollgruppe (nicht mit Mundwasser behandelt) auf TP-Harzkomposit gezüchtet wurde. Die gleichzeitige Überlagerung der drei Färbungen innerhalb eines einzigen Biofilms ermöglicht die gleichzeitige Visualisierung von EPS- (blauer Fleck), Nukleinsäure- (grüner Fleck) und Proteinkomponenten (roter Fleck) innerhalb von S. mutans-Biofilmen. (1 Einheit = 24 μm). Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen.

Uhr Uhr kg Uhr Uhr Uhr Uhr kg kg kg Uhr kg Uhr kg Uhr

Harz-Verbundwerkstoff		Punkt 4		TPH3
Mundwasser	Bestandteil	BV (μm3)	MT (μm)	BV (μm3)	MT (μm)
Biotène PBF	Nukleinsäuren	279.517±53.291	9.32±2.80	195.033±42.014	7.45±3.70
	eps	344.902±56.386	35.22±17.19 Uhr	197.840±62.351	9.83±7.26
	proteine	298.796±62.868	54.21±21.65	216.033±66.654	24.33±39.64
Listerine Total Care	Nukleinsäuren	355.707±110.444	26.45±14.21 Uhr	273.296±47.323	13.43±2.89
	eps	494.099±180.592	64.90± 26.68	329.150±47.145	34.35±30.32
	proteine	348.416±161.316	58,68±47,28	303.150±54.705	34.18±41.46
Kontrolle (unbehandelt)	Nukleinsäuren	388.375±42.152	Tel.: 51,15±40,66	327.809±39.400	17.08±1.65
	eps	660.448±173.197	91.37±74.84	363.850±67.612	28.33± 15.07
	proteine	517.274±119.475	Tel.: 127,96±73,84	353.161±56.518	21.17±4.41

Tabelle 2. Mittlere und Standardabweichungswerte des Biovolumens (BV) und der mittleren Biofilmdicke (MT) von Biofilmen, die mit BIO oder LTO behandelt oder unbehandelt gelassen wurden (Kontrollgruppe). Strukturparameter von Biofilmen, die mit Mundspülungen behandelt wurden und sich signifikant von denen der Biofilme in der Kontrollgruppe (p<0,05) unterschieden, sind rot markiert für Mittelwerte und Standardabweichungen.

Discussion

Die Aufnahme von CLSM-Bildern muss in der Art und Weise und dem Format erfolgen, die für die Quantifizierung von Biofilmen und für die Kolokalisationsanalyse erforderlich sind, so dass die Verteilung der Signalintensität in jedem Bild eine zuverlässige Darstellung der Verteilung jedes Fluorochroms im Biofilmstapel ist. Die Signalintensität sollte vom Rauschen und vom Hintergrund^10,11 unterscheidbar sein, nicht durch Autofluoreszenz vom Substrat beeinflusst werden und aufgrund der spektralen Interferenz zwischen den verwendeten Fluorochromen¹¹ ein minimales Durchscheinen aufweisen. Rauschen ist eine unvermeidliche Einschränkung der Fluoreszenzmikroskopie¹¹, und die Bildqualität kann manchmal aus technischen oder logistischen Gründen eingeschränkt sein. Die Identifizierung von Fluorochromen mit minimaler spektraler Überlappung ist entscheidend für den Erfolg dieser Methode, kann aber kompliziert sein. Darüber hinaus stellt die Quantifizierung mehrerer Fluorochrome ein multifaktorielles Problem dar. Daher ist es nicht verwunderlich, dass es nur sehr wenigen Untersuchungen gelungen ist, die gleichzeitige Verteilung von mehr als zwei Komponenten innerhalb der Strukturen von Biofilmen zu quantifizieren.

Das Ziel dieser Studie war es, eine Methodik zu entwickeln, die aus unterschiedlichen, aber miteinander verbundenen Schritten zur Quantifizierung und zum Vergleich der gleichzeitigen 3-dimensionalen Verteilungen von drei zellulären und extrazellulären Komponenten innerhalb von Biofilmen besteht. Der beschriebene Biofilmwachstumsassay ermöglicht das Biofilmwachstum auf relevanten Substraten und erzeugt Biofilmstrukturen, die reproduzierbar sind, wie die in Tabelle 1 berichteten Ergebnisse zeigen. Die Kombination aus neuartiger simultaner Färbung von EPS, Proteinen und Nukleinsäurekomponenten mit der Messung von 3D-Biofilm-Strukturparametern führt zu quantifizierbaren Verteilungen von Komponenten innerhalb von Biofilmen. Eine qualitative visuelle Analyse der gleichzeitigen Verteilung von EPS, Proteinen und Nukleinsäuren innerhalb der Biofilme ist durch die Rekonstruktion von überlagerten Färbungen innerhalb jedes Biofilms möglich. Die ISA3D-Software¹² enthält zusätzlich zu den traditionell gemessenen Parametern wie Porosität und Biofilmdicke mehrere einzigartige Strukturparameter wie fraktale Dimension, Homogenität und Biofilmrauheitskoeffizient, um die Quantifizierung der 3D-Strukturen von Biofilmen zu verbessern. Die statistische Analyse der strukturellen Parameter des Biofilms ermöglicht relevante Vergleiche von Biofilmen unter spezifischen experimentellen Bedingungen, wie z.B. antibakterielle/antifoulingende Wirksamkeit (z.B. nach Behandlung mit Mundspülungen) oder über die Zeit (zeitliche Effekte).

Mit dieser Methodik wurden die gleichzeitigen 3D-Verteilungen von drei Hauptkomponenten innerhalb von S. mutans-Biofilmen , die auf relevanten Substraten gezüchtet wurden, effizient und erfolgreich quantifiziert und verglichen, wodurch zwei Herausforderungen bei der gleichzeitigen Bewertung von Biofilmkomponenten überwunden wurden. Diese Methode kann auch verwendet werden, um die Wirksamkeit von antibakteriellen Behandlungen oder Antifouling-Maßnahmen gegen mehrere Biofilmkomponenten zu bestimmen, wie in dieser Studie anhand von Mundspülungen gezeigt wurde. Darüber hinaus kann der Großteil der oben beschriebenen Protokolle durch Protokolle für die Herstellung relevanter Substrate und Biofilmwachstumsassays relevanter Mikroorganismen ersetzt werden. Daher hat diese Methode eine breite Anwendung, da sie den Vergleich von 3D-Strukturen/-Architektur von in vitro und in vivo Biofilmen in einer Vielzahl von Disziplinen ermöglicht, einschließlich der Medizin, Zahnmedizin, Geologie und Meereswissenschaften.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Agar	Becton, Dickinson and Company	214010
Bacto Todd Hewitt Broth	Becton, Dickinson and Company	249240
Hefeextrakt, granuliert	EMD Millipore	1.03753.0500
Bacto Trypton	Becton, Dickinson and Company	211705
OmniPur Saccharose	EMD Millipore	8510
Kaliumchlorid, ACS-Reagenz, 99,0-100,5%	Sigma-Aldrich	P3911-500G
Kaliumphosphat, einbasisch, ≥ 99,0%, ACS-Reagenz	Sigma-Aldrich	P0662-500G
Natriumchlorid	Sigma-Aldrich	S9888-500G
Natriumphosphat, monobasisch, Monohydrat	EMD Millipore	SX0710-1
Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 99,8+%, ACS-Reagenz	Sigma-Aldrich	252859-500G
Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Konjugat	Invitrogen	C21421
Syto 9	Invitrogen	S34854
Sypro Red	Invitrogen	S12012 oder S6653
Biotè ne PBF Mundspülung	GlaxoSmithKline	N/A
Listerine Total Care	McNeil-PPC, Inc.	N/A