Summary
Transgénicos y knockout modelos de ratón de enfermedades neurológicas son útiles para estudiar el papel de los genes en la neurofisiología normal y anormal. Este artículo describe metodologías que pueden utilizarse para estudiar la potenciación a largo plazo, un mecanismo celular que puede ser la base de aprendizaje y la memoria, en transgénicos y knockout libremente comportarse modelos de ratón de la neuropatología.
Abstract
Estudios de la potenciación a largo plazo de la eficacia sináptica, un fenómeno sináptica dependiente de la actividad que tiene propiedades que lo hacen atractivo como un potencial mecanismo celular de almacenamiento de aprendizaje y la información subyacente, han sido durante mucho tiempo utilizado para elucidar la fisiología de varios circuitos neuronales en el hipocampo, la amígdala , y otras estructuras límbicas y corticales. Con esto en mente, los modelos de ratones transgénicos de enfermedades neurológicas representan plataformas útiles para llevar a cabo la potenciación a largo plazo (LTP) estudios para desarrollar una mayor comprensión de la función de los genes en la comunicación sináptica normal y anormal en las redes neuronales implicadas en el aprendizaje, la emoción y la información procesamiento. En este artículo se describen las metodologías para la inducción de LTP en forma confiable el ratón libremente comportarse. Estas metodologías se pueden utilizar en estudios de transgénicos y Knockout comportarse libremente modelos de ratón de enfermedades neurodegenerativas.
Introduction
El desarrollo de la tecnología para manipular genes ha producido transgénicos y knock-out modelos de ratón de casi todas las enfermedades neurodegenerativas y neurológicas. Esto ha requerido traducción de técnicas de investigación electrofisiológicos utilizados previamente en especies de roedores más grandes en el modelo animal de ratón. Una de tales técnicas de investigación neurofisiológica es el uso de la potenciación a largo plazo (LTP) para probar la eficacia de las conexiones sinápticas dentro de las redes neuronales implicados en diversos trastornos neuropatológicos. Este protocolo describe las técnicas para la investigación electrofisiológica fiable de LTP en comportarse libremente ratones. La ventaja de este protocolo sobre otros es que es simple y fácil de implementar, sino que también es bastante menos costoso, ya que no requiere ni el uso de costosos sistemas de microdrive controlados por el ordenador ni Headstages transistor de efecto de campo, y, a nuestro conocimiento, es el primer protocolo de video de grabaciones electrofisiológicas crónicas to estudiar la LTP en comportarse libremente ratones. Con este fin, se describe en este artículo metodologías sencillas para estudiar la potenciación a largo plazo en ratones comportarse libremente. Estas metodologías pueden ser fácilmente traducidos a modelos transgénicos y knockout de ratón de trastornos neuropatológicos.
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Protocol
Este protocolo es adecuado para ratones de 3 y 18 meses de edad y el peso corporal aproximado de 30-50 g). Los ratones se pueden obtener de El Laboratorio Jackson (Bar Harbor, ME). Todos los protocolos quirúrgicos y experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo Trinity College y estaban de acuerdo con la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
1. Preparación de los animales y Procedimientos Quirúrgicos
- Preparar cóctel que contiene la anestesia de ketamina (25 mg / ml), xilazina (2,5 mg / ml) y acepromacina (0,5 mg / ml). Inyectar 1 ml / kg de peso corporal en el cuadrante inferior derecho del abdomen, complementado por inyecciones de 0,2 ml / kg cada 45 minutos a partir de entonces para mantener una profundidad estable de anestesia usando el reflejo de retirada pedal.
- Preparar ratón anestesiado para la cirugía por el afeitado el pelo de su cráneo usando una máquina de afeitar eléctrica. El área afeitada debe incluir el centro de los ojos a la mitad de los oídos. Asegúrese de no afeitarse la whiskers, ya que forman parte del sistema sensorial del barril del ratón.
- Use hisopos de algodón para aplicar alcohol isopropílico seguido de Betadine a la zona de afeitado en la cabeza. Entonces, también el uso de bastoncillos de algodón, se aplica una pequeña cantidad de aceite mineral en los ojos para evitar que los globos oculares de secado.
- Utilice manguitos del oído de ratas lactantes en lugar de barras de oreja regulares para montar la cabeza del animal en el aparato marco estereotáxico. Para ello, primero montar la oreja izquierda en el puño del oído izquierdo. Entonces aliviar un poco la oreja derecha en el puño derecho, apoyando suavemente la cabeza del animal con una mano y el avance del manguito del oído con la otra mano. Luego, coloque un cojín eléctrico bajo el cuerpo del animal y ponerlo a 86 ° C para mantener la temperatura corporal.
- A continuación, compruebe si hay rigidez bilateral al intentar mover la cabeza de lado a lado. El animal está montado correctamente en el marco estereotáxico cuando la cabeza es rígida y no se puede mover de lado a lado, pero puede girar fácilmente hacia arriba y abajo.
- Descansar suavemente lahocico del ratón sobre la barra de la nariz / diente de montaje asegurándose de que los incisivos están descansando suavemente pero con seguridad dentro de la abertura de los dientes de la barra de la nariz / diente.
- Con un bisturí estéril practicar una incisión en la línea media a partir de la mitad de los ojos hasta la mitad de las orejas. Asegúrese de que el bisturí se llevará a cabo en un ángulo de 45 ° y aplicar suficiente presión para cortar a través de la fascia subyacente, pero no a través del cráneo ya que esto causará sangrado excesivo.
- Use hisopos de algodón para separar la fascia y exponer el cráneo. Cráneo hitos bregma y lambda debe ser claramente visible (fig. 1A). Asegúrese de que el animal está en la posición cráneo plano mediante el ajuste de la barra de la nariz / diente de tal manera que bregma y lambda puntos de referencia están en la misma posición dorsoventral (DV) (+ 0,1 mm).
- Aplique una pequeña cantidad de solución salina estéril al área expuesta y usar hisopos de algodón para limpiar suavemente el cráneo. Luego, esperar 2-3 minutos para que el cráneo se sequen completamente al aireantes de proceder.
- Montar una aguja en el brazo estereotáxica izquierda para medir la posición de DV bregma y lambda. El posicionamiento de DV de estos dos puntos de referencia debe estar dentro de 0,1 mm el uno del otro. Si no, la barra de la nariz del marco estereotáxico se puede ajustar hacia arriba y hacia abajo para lograr esto.
- Coloque la aguja en bregma para grabar su anterior-posterior (AP), lateral (LAT) y (DV) mediciones dorsoventral. Asegúrese de que la aguja toque el cráneo y no penetra en ella.
- Utilice un ratón atlas del cerebro, tales como "el cerebro del ratón en estereotáxica Coordenadas" 1, para determinar las coordenadas de las estructuras de destino: vía medial perforante (MPP) en el haz angular y giro dentado (GD) del hipocampo, en relación con lambda y bregma, respectivamente (véase también el cuadro 1). A continuación, utilice un bolígrafo de punta fina o un lápiz para marcar estos puntos en el cráneo.
- También, marque dos puntos más en el lado contralateral del cráneo. Estos puntos which servirá como la masa (GND) y de referencia (REF) debe ser de aproximadamente 3 mm de la línea media y colocado longitudinalmente con relación a cada otra (Figura 1A, también la Tabla 1).
- Quite el marcador de la aguja del brazo estereotáxica izquierda y reemplazarlo con un taladro dental eléctrico equipado con un montaje estereotáxica. Coloque el taladro sobre cada punto marcado y hacer pequeños agujeros de trépano de aproximadamente 0,5 mm de diámetro. Al taladrar, use un movimiento hacia arriba y hacia abajo repetitivo y comprobar con frecuencia si el simulacro ha penetrado en el cráneo para exponer la superficie del cerebro.
- Con suavidad pero con firmeza conducir un electrodo de tornillo (# 0-80 1/8 de los tornillos de máquina de acero inoxidable, ranurado fillister cabeza) en cada uno de los agujeros contralateral (GND y REF) de tal manera que sólo tocan la superficie cortical sin penetrar en él (Figura 1A ). Estos dos electrodos de tornillo sirven de suelo y de referencia.
- Mount estimulantes y grabación electrodos en electroDe los titulares en los brazos estereotáxica izquierdo y derecho, respectivamente.
- Conectar los terminales de electrodo de estimulación a un estimulador electrofisiológico con el aislamiento de corriente y el terminal de electrodo de registro a un amplificador electrofisiológico diferencial (ganancia = 1,000, filtro de paso de banda = 1 Hz-3 kHz) y luego a un osciloscopio digital para la inspección visual de las respuestas evocadas. Además, conecte GND y terminales de los electrodos REF al amplificador diferencial.
- Suave y lentamente baja estimulante y electrodos de grabación en incrementos de 0,5 mm, mientras que el seguimiento de la respuesta evocada visualmente a un choque de estímulo de 600 a 800 uA. Continúe bajando cada electrodo hasta que llegan a su respectiva posición DV meta y se observa una señal estereotipada en el osciloscopio (Figura 1B).
- Después, utilizar el cemento acrílico dental para hacer una tapa para mantener los terminales de los electrodos en su lugar, cualquier cemento dental que toca la piel debe limpiarseinmediatamente. Una vez que el cemento dental está completamente curado transferir al animal del marco estereotáxico a una jaula de roedores limpia. Utilice una lámpara de calor o una almohadilla para mantener la temperatura central.
- Monitorear el animal cada hora hasta que se recupere la conciencia. Una inyección de flunixina se puede administrar como un analgésico.
2. La inducción de LTP
- Deje que los animales de 5-7 días para recuperarse de la cirugía. Colocar el animal en el entorno de grabación que consiste en una jaula de Faraday (122 cm x 43 cm x 43 cm) equipado con material de insonorización y un conmutador giratorio 5-canal que conecta el electrodo conduce a la configuración de estimulante / grabación.
- Permita que el animal se aclimate durante 1-2 horas en el entorno de grabación antes de conectar los electrodos a los instrumentos de estimulación y registro (consulte el paso 1.17).
- Ajuste los controles del estimulador de la producción de 400 uA y registrar la amplitud de un promedio de 10 respuestas evocadas asegurándose ªen al menos 10 segundos transcurrido entre los estímulos. Utilice el método que se muestra en la Figura 1C para cuantificar la respuesta evocada. Repita este procedimiento para 600, 800, 1.000, 1.200, y 1.400 uA.
- Construir una curva de entrada / salida por el trazado de la amplitud media de la respuesta evocada frente a la intensidad del estímulo. De esta figura determinar la intensidad del estímulo que corresponde a 50% de la amplitud máxima medida. Utilice la intensidad de 50% para el resto del experimento.
- Entonces, usando la intensidad del estímulo 50%, obtener una línea de base mediante el registro de la amplitud media de 5 respuestas evocadas cada minuto durante 15 minutos. Una vez más asegurarse de que al menos 10 segundos transcurrido entre estímulos.
- Posteriormente entregar la estimulación tetánica que consiste de 10 ráfagas de 10 pulsos suministrados a 400 Hz con una velocidad de ráfaga de 5 Hz a la vía perforante medial. Monitorear el animal para detectar signos de convulsiones, incluyendo sacudidas de perro mojado. Si el animal tiene una convulsión del experiment debe ser terminada y todos los datos de ese animal debe ser excluido de los resultados del estudio.
- Luego, continuará grabando la amplitud promedio de 5 respuestas evocadas cada minuto durante 30 minutos posttetanization. Después de eso, comparar esta amplitud a la amplitud de línea de base obtenida en la etapa 2.5 mediante el cálculo del porcentaje de cambio desde la línea base (Figura 2).
- Tras la conclusión de los experimentos, el animal es sacrificado por medio de la inhalación de isoflurano-un método que sea consistente con las Directrices sobre la eutanasia de la Asociación Americana de Medicina Veterinaria.
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Representative Results
La Tabla 1 muestra las coordenadas de la DG y mPP empleado en el presente protocolo Figura 1A muestra las marcas de las estructuras diana en el cráneo;.. También se muestran la ubicación de los electrodos de tierra y de referencia Figura 1B ilustra representante respuesta evocada traza tanto pre- y posttetanization en el mismo animal. Tenga en cuenta que la posttetanization respuesta evocada es mayor que la respuesta pretetanization que es indicativo de la inducción de LTP 2. Figura 1C ilustra el método utilizado para cuantificar la amplitud de la respuesta. De hecho, la Figura 2 muestra el porcentaje de cambio en la amplitud de la respuesta durante un transcurso de tiempo que abarca ambos períodos de tiempo pre-y posttetanization. Es de señalar que los valores de pico de LTP superaron 100%. Estos resultados de una mayor amplitud de la respuesta siguiente tetanización indican que este protocolo tiene éxito y por lo tanto fiable para el estudio de LTPen el modelo de ratón libremente comportarse.
Tabla 1. Coordenadas de estructuras diana. Antero-posterior (AP) coordenadas de giro dentado (DG) y REF se dan en relación a bregma mientras que los de media vía perforante (MPP) y GND son en relación con Lambda. Todas las coordenadas DV son en relación con la superficie cortical por debajo de la duramadre.
Figura 1. Ubicación del electrodo y trazas representativas de la respuesta evocada. A) Representación esquemática de la localización relativa de los electrodos en la SKU ratónLL. B) rastros típicos de la respuesta evocada tanto de pre-y posttetanization. C) algoritmo utilizado para cuantificar la amplitud de la respuesta evocada.
Figura 2. LTP en el medial perforante-path giro dentado sinapsis. Consecuencia Representante de la inducción de LTP en el MPP-DG sinapsis de un ratón libremente comportarse. Nota mejora la estimulación postetánica de la amplitud de la respuesta evocada indicativo de la inducción de LTP.
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Discussion
En este protocolo, hemos demostrado un método fiable y sencillo para el estudio de LTP en la Dirección General en ratones comportarse libremente. Mientras que muchos estudios de LTP en ratas despiertas se han realizado 3,4, muy pocos se han realizado en ratones despiertos todo debido a la complejidad técnica que supone la inmobiliaria craneal limitada en ratones y el peso de Headstages electrodos en relación con el peso medio de 5 ratones. Los pocos estudios que han demostrado la PLP en la Dirección General de comportarse libremente ratones utilizados ya sea sistemas de electrodos Microdrive o efecto de campo de unión (JFET) transistor preamplificadores integrados en el headstage que necesariamente se suma a la carga de la carga útil del electrodo al animal 6-10. La importancia del presente protocolo es que representa una mejora sobre los métodos existentes para la inducción de LTP en la Dirección General de comportarse libremente los ratones, ya que evita el uso de sistemas de electrodos Microdrive o un headstage JFET de.
Es importante destacar los pasos críticos de este protocolo. Estos incluyen: 1) montaje de la cabeza del ratón en el marco estereotáxico tal que es bilateral rígido (este paso puede ser el más difícil, ya que requiere la práctica y el conocimiento de la técnica), 2) la colocación óptima de los electrodos para maximizar la magnitud de la respuesta puede ser mejorada asegurando que el bregma y lambda están en el mismo plano que por lo general se puede lograr mediante el ajuste de la barra de diente marco estereotáxico tal que la diferencia en el posicionamiento dorsoventral de bregma y lambda no es mayor que 0,1 mm; 3) durante la fase de registro de los el experimento, se recomienda que los animales se permitirá tiempo para habituarse al entorno de grabación debido a la novedad del entorno de grabación puede insinuar las fluctuaciones en los datos de respuesta recopilados evocados; 4) la selección adecuada de los electrodos mejorará la calidad de la señal y de la fidelidad: electrodos bipolares ( acero inoxidable tubo hipodérmico de acero inoxidable de 0,2 mminserto de alambre con una separación de punta de 0,5 mm) se prefieren para estimular mientras electrodos monopolares (sola hebra de alambre de tungsteno epoxylite con aislamiento) se utilizan para la grabación en el tejido nervioso, y 5) los ratones pueden ser anestesiados con una inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina (25 mg / ml), xilazina (2,5 mg / ml) y acepromacina (0,5 mg / ml). Esta mezcla anestésica debe entonces ser administrada a una dosis de 1ml/kg que es generalmente eficaz en aproximadamente 20 min complementados con 0,2 ml / kg cada 45 minutos para mantener una profundidad estable de la anestesia.
Hay algunas limitaciones de este protocolo que llevan mención. Este protocolo no da ninguna visión sobre los mecanismos de los canales iónicos o receptor de la síntesis de proteínas que pueden estar al servicio de LTP. Por lo tanto escasa información disponible sobre el número real de las neuronas en la población que se está grabando. Otra limitación es que, dado que las respuestas evocadas se están recogiendo en animales despiertos es difícil ASCERTAin y diseccionar el efecto de factores tales como el estrés, la manipulación, o la contaminación de la señal registrada por la actividad sensoriomotora espuria. Estas limitaciones pueden ser superadas por asegurarse de que las respuestas evocadas se registra sólo cuando el animal es el estado inactivo, pero alerta, también conocido como el tranquilo estado de la vigilancia de vigilia.
Sin embargo, las técnicas descritas en este protocolo proporciona la plataforma más fisiológicamente relevantes para la investigación de la conducta subyacente actividad eléctrica del cerebro. Siguiendo los pasos descritos en este protocolo, toda la estructura del cerebro puede ser objetivo de utilizar las coordenadas que se indican a por un atlas del cerebro del ratón 1. Es importante tener en cuenta que el marco estereotáxico de rata adulta se puede utilizar en ratones, siempre que los puños del oído de rata lactante adecuado se utilizan en lugar de las barras de oído regulares. Los puños del oído se inmovilizará la cabeza sin dañar las orejas del ratón. Por último, las metodologías presentadas aquí pueden ser readily traducido a las investigaciones electrofisiológicas en modelos transgénicos y knockout mouse de una serie de trastornos neurológicos.
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Disclosures
Los autores tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a las siguientes: Dr. Joseph Bronzino, Dr. Khamis Abu-Hassaballah, Sr. RJ Austin-LaFrance, y la Sra. Jessica Koranda.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine (100 mg/ml) | Henry Schein | 10177 | |
| Xylazine (20 mg/ml) | Henry Schein | 33197 | |
| Acepromazine (10 mg/ml) | Henry Schein | 2177 | |
| Dental acrylic powder | Lang Dental Manufacturing Co. | 1330CLR | |
| Dental acrylic liquid | Lang Dental Manufacturing Co. | 1306CLR | |
| Tungsten wire (0.127 mm) | World Precision Instruments | TGW0515 | |
| Stainless Steel Hypodermic Tubing (0.286 mm) | World Precision Instruments | 832400 | |
| Flunixin (50 mg/ml) | Henry Schein | 14165 | |
| Epoxilyte | Superior Essex | EP 6001-M | |
| Stainless steel wire insert (0.2 mm) | World Precision Instruments | 792900 | |
| Stereotaxic frame apparatus | Kopf Instruments | Model 902 | |
| Ear cuffs (ear cups) | Kopf Instruments | Model 921 | |
| Electrophysiological stimulator | Astro-Med, Inc. | S88 | |
| Digital oscilloscope | B K Precision Corp. | 2542 | |
| Current isolation unit | Astro-Med, Inc. | PSIU-6 | |
| Differential amplifier | World Precision Instruments, Inc. | DAM-50 | |
| Commutator | Plastics One | SLC6 | |
| Dental drill | Stoelting | 58650 |
References
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Compact 2nd edn, Elsevier Academic Press. (2004).
- Bliss, T. V. P., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. J. Physiol. 232, 331-356 (1973).
- Blaise, J. H., Bronzino, J. D. Effects of stimulus frequency and age on bidirectional synaptic plasticity in the dentate gyrus of freely moving rats. Exp. Neurol. 182, 497-506 (2003).
- Blaise, J. H., Koranda, J. L., Chow, U., Haines, K. E., Dorward, E. C. Neonatal isolation stress alters bidirectional long-term synaptic plasticity in amygdalo-hippocampal synapses in freely behaving adult rats. Brain Res. 1193, 25-33 (2008).
- Koranda, J. L., Masino, S. A., Blaise, J. H. Bidirectional synaptic plasticity in the dentate gyrus of the awake freely behaving mouse. J. Neurosci. Methods. 167, 160-166 (2008).
- Cooke, S. F., et al. Autophosphorylation of alphaCaMKII is not a general requirement for NMDA receptor-dependent LTP in the adult mouse. J. Physiol. 574, 805-818 (2006).
- Davis, S., Bliss, T. V., Dutrieux, G., Laroche, S., Errington, M. L. Induction and duration of long-term potentiation in the hippocampus of the freely moving mouse. J. Neurosci. Methods. 75, 75-80 (1997).
- Jones, M. W., Peckham, H. M., Errington, M. L., Bliss, T. V., Routtenberg, A. Synaptic plasticity in the hippocampus of awake C57BL/6 and DBA/2 mice: interstrain differences and parallels with behavior. Hippocampus. 11, 391-396 (2001).
- Zhang, T. A., Tang, J., Pidoplichko, V. I., Dani, J. A. Addictive nicotine alters local circuit inhibition during the induction of in vivo hippocampal synaptic potentiation. J. Neurosci. 30, 6443-6453 (2010).
- Tang, J., Dani, J. A. Dopamine enables in vivo synaptic plasticity associated with the addictive drug nicotine. Neuron. 63, 673-682 (2009).
