Antikörperfärbung in C. Elegans Mit der "Freeze--Cracking"

Summary

"Freeze-Cracking", ein Verfahren zur Freilegung der inneren Gewebe des Nematoden C. elegans, um Antikörper für die Proteinlokalisierung, wird demonstriert.

Abstract

Um C. Fleck elegans mit Antikörpern müssen die relativ undurchlässig Kutikula durch chemische oder mechanische Verfahren umgangen werden. "Freeze-Cracking" ist eine Methode verwendet, um körperlich ziehen Sie die Nagelhaut von Nematoden durch Komprimieren Nematoden zwischen zwei haftenden Folien, Einfrieren, und ziehen Sie die Folien auseinander. Gefrier Cracken liefert eine einfache und schnelle Möglichkeit, den Zugang zu den Geweben ohne chemische Behandlung erhalten und kann mit einer Vielzahl von Fixiermitteln verwendet werden. Sie führt aber zum Verlust von vielen der Proben und die erforderliche Kompression der Probe mechanisch verformt. Praxis ist erforderlich, um Rückgewinnung der Proben mit guter Morphologie zu maximieren. Gefrier Cracken kann für bestimmte Fixierbedingungen, Rückgewinnung der Proben oder niedrige nicht-spezifische Färbung optimiert werden, aber nicht für alle Parameter auf einmal. Für Antikörper, die sehr schwer Fixierung Bedingungen erfordern und tolerieren die chemischen Behandlungen erforderlich, um chemisch permeabilisieren die Nagelhaut, treatment intakter Nematoden in Lösung bevorzugt werden. Wenn der Antikörper erfordert eine leichtere Lösung oder, wenn die optimale Fixierung Bedingungen bekannt sind, bietet gefrier Cracken eine sehr nützliche Methode, um schnell zu testen, die den Antikörper und spezifische subzelluläre und zelluläre Lokalisation Information für das Antigen von Interesse zu ergeben.

Introduction

Um die zellulären und subzellulären Lokalisation von Proteinen zu bestimmen, haben Wissenschaftler traditionell mit Antikörpern ausgewählt, um bestimmte Proteine ​​spezifisch erkennen, ^ein markierter Gewebe. In einigen Modellorganismen wie C. elegans, Antikörperfärbung wurde oft durch molekulargenetische Techniken, die Ergebnisse schneller erzielen ersetzt. Diese umfassen die Umwandlung Organismen mit Konstrukten aus Genfusionen zwischen dem Promotor und der codierenden Regionen des Gens von Interesse und das grün fluoreszierende Protein. Jedoch unterliegen einer Anzahl von Artefakten, einschließlich der Probleme mit Kenntnis der wahren Promotor u....

Protocol

HINWEIS: Mehrere Protokollschritte sind mit Optionen für die Einrichtung und Vorbereitung abhängig von den spezifischen Bedingungen des Experiments vorgestellt. Für diese Fälle sind alternative Schritte A, B, C usw. dargestellt Das Protokoll mit alternativen Schritte ist in Fig. 1 skizziert.

1. Vorbereitung von Polylysin beschichtete Objektträger

Drei verschiedene Arten von Folien verwendet werden können, abhängig von dem gewünschten Kompromiß zwischen der Leichtigkeit der Herstellung, relativ Haftung und nicht-spezifische Bindung des Antikörpers. Details der Objektträgerpräparations Al....

Results

Wenn Würmer richtig komprimiert, rissig, und leicht fixiert ist, kann nahezu die gesamte Schnecken zugänglich Antikörper-Färbung (siehe Abbildung 2). Die Lage der Kerne durch DAPI-Färbung angezeigt anzeigt, welche Teile der Schnecke sind intakt, wenn die Würmer zu einem härteren Fixiermittel wie Formaldehyd ausgesetzt wird, kann sich die Morphologie der Schnecke verzerrt werden (wie durch die unnatürlich wellige Aussehen der gesehen Muskeln in den Fig. 3A-D). Ein weiteres häufiges Probl.......

Discussion

Das gefrierCrack Protokoll ist eines von mehreren Verfahren zur Antikörperfärbung in C. elegans. Es bietet eine relativ einfache Möglichkeit, Würmer Fleck, erfordert aber spezifische Reagenzien und Praxis für optimale Ergebnisse. Kritische Schritte (in Abbildung 1 dargestellt) umfassen: 1) Bei Objektträgervorbereitung (siehe Schritte 1 und 2) manuelle Kompression der Nematoden (siehe Schritte 2 und 3) schnelle Fixierung (siehe Schritt 3). Erstens, um die Haftung der Nematoden auf die Objektträg.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Lysin-Objektträger (Marke ESCO)	Fisher	12-545-78	Objektträger der Marke Sigma eignen sich auch für
Poly-L-Lysinhydrobromid	Sigma	P1524	WICHTIG: Marke und hohes Molekulargewicht von Polylysin kritischer
einfacher mattierter Rand Objektträger	Fisher	48312-002	Andere Marken sind geeignet
Natriumazid	Sigma	S2002-25G	TOXIC, tragen Sie Handschuhe und Maske, während Sie das Pulver abwiegen, um 10% Vorrat zu erhalten. Tragen Sie Handschuhe, wenn Sie Stammlösung
Coplin Färbeglas	VWR	47751-792	Andere Marken sind geeignet
5-Objektträger-Versandtasche	Elektronenmikroskopie Wissenschaft	71549-01	Eine von vielen verschiedenen Marken von kleinen Objektträgerhaltern, geeignet zum Färben von
Paraformaldehyd	VWR	MK262159	WICHTIG: Normale Formalinlösungen (37% Formaldehyd) sind NICHT geeignet. Entweder 1) Crysatlaline paraformaldehyd in Phosphatpuffer auflösen und in kleinen Aliquoten gefroren lagern. Oder 2) Kaufen Sie Paraformaldehyd in Elektronenmikroskopiequalität in Aliquoten. GIFTIG - Handschuhe tragen; Entsorgen Sie überschüssiges Waschbecken mit Wasser.
Glutaraldehydlösung, 25% in Wasser	Sigma	G 5882	WICHTIG: Glutaraldehyd in Elektronenmikroskopiequalität in Ampullen kaufen; GIFTIG - Handschuhe tragen; Entsorgen Sie überschüssiges Waschbecken mit Wasser.
Triton X-100	VWR	EM-9410	Andere Marken sind geeignet
Rinderserum Albumin	Fisher	ICN820451	Andere Marken sind geeignet
Eselserum, lyophilisiert	Jackson Immunoresearch	017-000-121	Andere Marken sind geeignet
Cy3 Donkey Anti-Maus IgG Multi-Labeling	Jackson Immunoresearch	715-165-150	Dieses Unternehmen wird für hochwertige Multi-Label-Antikörper (affinitätsarmiert) empfohlen. Wählen Sie den geeigneten Farbstoff und das geeignete Antigen (Tier, das zur Aufzucht des Primärantikörpers verwendet wurde).
n-Propylgallat	Fisher	ICN10274750	Andere Marken eignen sich DAPI
, 4',6'-diamidino-2-phenylindol dihydrochlorid	Sigma	D 9542	TOXIC. Tragen Sie Handschuhe und dosieren Sie in kleine Aliquots und feeze, um die Exposition zu minimieren
Whatman #1 Filter mit 15 cm Durchmesser	Fisher	09805G
Deckglas #1 1/2 Rechteck 24 x 60 mm	VWR	48393-252	#1 1/2 Dicke ist optisch am besten
Objektträgermappe	VWR	48429-092	Andere Marken sind geeignet