Neutrophile Einhaltung der aktivierten Endothel an den Standorten der Infektion ist ein integraler Bestandteil des Gastgebers Entzündungsreaktion. Beschrieben in diesem Bericht ist ein neutrophilen Bindungs-Assay, die für das erlaubt In vitro Quantifizierung von primären humanen Neutrophilen-Bindung an Endothelzellen durch Entzündungsmediatoren unter statischen Bedingungen aktiviert.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die vaskuläre Endothel spielt eine wesentliche Rolle bei der entzündlichen Reaktion. In der akuten Phase der Entzündung werden Endothelzellen (ECs) von Host-Vermittler oder direkt durch konservierte mikrobielle Komponenten oder Host-derived Gefahr Moleküle aktiviert. Activated ECs express Zytokine, Chemokine und Adhäsionsmoleküle, mobilisieren, aktivieren und behalten Leukozyten an den Ort der Infektion oder Verletzung. Neutrophile sind die ersten Leukozyten, um anzukommen, und sich an das Endothel durch eine Vielzahl von Adhäsionsmolekülen auf den Oberflächen der beiden Zellen. Die wichtigsten Funktionen von Neutrophilen sind direkt beseitigen mikrobiellen Bedrohungen, die Förderung der Rekrutierung von anderen Leukozyten durch die Freisetzung von zusätzlichen Faktoren, und initiieren Wundheilung. Daher ist die Einstellung und Befestigung des Endothels ein kritischer Schritt in der Einleitung der entzündlichen Reaktion. In diesem Bericht beschreiben wir eine in-vitro-Assay mit neutrophilen AdhäsionCalcein primären humanen Neutrophilen AM-markierten, um das Ausmaß der mikrovaskulären endothelialen Zell-Aktivierung unter statischen Bedingungen zu quantifizieren. Dieses Verfahren hat den zusätzlichen Vorteil, dass die gleichen Proben mittels Fluoreszenz-Spektrophotometrie quantifiziert auch direkt visualisiert werden mittels Fluoreszenzmikroskopie für eine qualitative Bewertung der Neutrophilen-Bindung.
Einleitung
Da das vaskuläre Endothel ist in direktem Kontakt mit dem zirkulierenden Blut wird in ausgezeichneter Lage, eine schnelle Entzündungsreaktion während der Infektion oder Verletzung zu initiieren. Endothelzellen (ECs) express pattern recognition receptors, die eine Vielzahl von konservierten bakteriellen Komponenten und Gefahr Moleküle erkennen und Rezeptoren für Host Entzündungsmediatoren wie TNFa. Die Aktivierung dieser Rezeptoren führt ECs, Zytokine (z. B. IL-6, IL-8, CXCL1 und CCL2) sezernieren, und Adhäsionsmoleküle (zB E / P-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1) in ihrer Zelloberfläche 1 hochreguliert , 2. Diese Moleküle alle erleic....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
1. Plating und Wartung von mikrovaskulären Endothelzellen
- Auftauen und das Wachstum Ihres mikrovaskulären Endothelzellen nach den Herstellern mitgelieferten Anleitung. In diesem Protokoll wurden die Zellen in EGM-2 MV Medien (Lonza) gewachsen, und es wird empfohlen, dass alle Versuche innerhalb von zwei Wochen nach dem Auftauen eine Variation aufgrund Durchgang Nummer minimieren durchgeführt werden. Unsere Experimente mit HMVEC-Lung zwischen Passagen 4 bis 9 durchgeführt.
- Tag 1: Wenn die Zellen 80-90% Konfluenz erreichen, trypsinize und resuspendieren bei 120.000 Zellen pro ml. Teller 36.000 Zellen (0,3 ml) pro Well in 48-Well-, Polystyrol Gewebe....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Um eine zuverlässige, reproduzierbare Ergebnisse mit einem Neutrophilen Bindungs-Assay erhalten, ist es wichtig, dass die Gesundheit und das Konfluenz der mikrovaskulären Endothelzellen optimal am Tag des Tests sind, wie bei HMVEC-Lung in Abbildung 1 dargestellt. Darüber hinaus ist es unerlässlich, dass niedrige Durchgang Nummer mikrovaskulären ECs verwendet werden (dh weniger als 9 Stellen), und entsprechend, empfehlen wir die Durchführung aller Experimente innerhalb von zwei Wochen nach dem A.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Neutrophilen / Mikrogefäßendothelzellen Zelladhäsionsassay sind: 1) der niedrigen Passage-Nummer (<9), gesunde Endothelzellen Verwenden; 2) Pflege der isolierten Neutrophilen bei einer geringen Dichte (dh <5 x 10 6 Zellen / ml) und mit ihnen innerhalb von zwei Stunden der Isolation, und 3) Fastidious Waschen der Calcein AM-markierten Neutrophilen und die Nutzung der Calcein AM-markierten Neutrophilen rechtzeitig EG Verschmutzung und Verlust von Cal.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der UCSF Abteilung Anästhesie und perioperative Pflege unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| HMVEC-Lung | Lonza | CC-2527 | |
| EGM-2 MV | Lonza | CC-3202 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175-095 | Kann mit jedem Hersteller ersetzt werden |
| 48-Well-Gewebekulturplatten | BD Falcon | 353078 | |
| PBS (ohne Phenolrot) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001 | Kann mit jedem Anbieter ersetzt werden |
| D-PBS (ohne Ca2+ und Mg2+ und Phenolrot) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | Kann mit jedem Hersteller |
| ersetzt werden RPMI-1640 (ohne Phenolrot) | Life Technologies | 11835-030 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield | 1114683 | |
| Calcein AM | Life Technologies | C3099 | (0,995 mM) Lager soln |
| Trypan Blue Lösung | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 40 μ M Filter | VWR | 21008-949 | Kann durch jeden Hersteller ersetzt |
| werden FLUOstar OPTIMA Spektralphotometer | BMG LABTECH | - |
Referenzen
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Collins, T., et al.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
