Simultane Multicolor-Imaging biologischer Strukturen mit Fluoreszenzphotoaktivierung Lokalisationsmikroskopie

Summary

Wir demonstrieren die Verwendung von Fluoreszenz-Photoaktivierungs-Lokalisierungsmikroskopie (FPALM), um gleichzeitig mehrere Arten von fluoreszenzmarkierten Molekülen in Zellen abzubilden. Die beschriebenen Techniken ermöglichen die Lokalisierung von Tausenden bis Hunderttausenden einzelner fluoreszierend markierter Proteine mit einer Genauigkeit von Dutzenden von Nanometern innerhalb einzelner Zellen.

Abstract

Lokalisierungsbasierte Superauflösungsmikroskopie kann angewendet werden, um eine räumliche Karte (Bild) der Verteilung einzelner fluoreszenzmarkierter einzelner Moleküle innerhalb einer Probe mit einer räumlichen Auflösung von Dutzenden von Nanometern zu erhalten. Unter Verwendung von photoaktivierbaren (PAFP) oder photoschaltbaren (PSFP) fluoreszierenden Proteinen, die mit Proteinen von Interesse fusioniert sind, oder organischen Farbstoffen, die an Antikörper oder andere Moleküle von Interesse konjugiert sind, kann die Fluoreszenz-Photoaktivierungslokalisierungsmikroskopie (FPALM) gleichzeitig mehrere Arten von Molekülen innerhalb einzelner Zellen abbilden. Mit dem folgenden Ansatz werden Populationen einer großen Anzahl (Tausende bis Hunderttausende) einzelner Moleküle in einzelnen Zellen abgebildet und mit einer Genauigkeit von ~10-30 nm lokalisiert. Die gewonnenen Daten können verwendet werden, um die räumliche Verteilung mehrerer Proteintypen auf der Nanoskala innerhalb einer Zelle zu verstehen. Ein Hauptvorteil dieser Technik ist die drastische Erhöhung der räumlichen Auflösung: Während die Beugung die Auflösung bei der herkömmlichen Lichtmikroskopie auf ~200-250 nm begrenzt, kann FPALM Längenskalen abbilden, die mehr als eine Größenordnung kleiner sind. Da viele biologische Hypothesen die räumlichen Beziehungen zwischen verschiedenen Biomolekülen betreffen, kann die verbesserte Auflösung von FPALM Einblicke in Fragen der zellulären Organisation geben, die der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie bisher nicht zugänglich waren. Neben der Beschreibung der Methoden zur Probenvorbereitung und Datenerfassung beschreiben wir hier den optischen Aufbau für FPALM. Ein weiterer Aspekt für Forscher, die hochauflösende Mikroskopie betreiben möchten, sind die Kosten: Eigeninstallationen sind deutlich billiger als die meisten kommerziell erhältlichen Bildgebungsgeräte. Zu den Einschränkungen dieser Technik gehören die Notwendigkeit, die Markierung von Molekülen von Interesse in Zellproben zu optimieren, und die Notwendigkeit einer Nachbearbeitungssoftware zur Visualisierung der Ergebnisse. Wir beschreiben hier die Verwendung der PAFP- und PSFP-Expression, um zwei Proteinspezies in fixierten Zellen abzubilden. Die Ausweitung der Technik auf lebende Zellen wird ebenfalls beschrieben.

Introduction

Während zelluläre Strukturen auf einer Vielzahl von räumlichen Skalen existieren, ist die Fluoreszenzbildgebung der zellulären Organisation auf Längenskalen kleiner als ~250 nm in der konventionellen Mikroskopie aufgrund der physikalischen Einschränkung der Beugungsgrenze eingeschränkt. Diese Grenze wurde mit dem Aufkommen der Fluoreszenz-Photoaktivierungslokalisierungsmikroskopie (FPALM¹) und ähnlicher Techniken^{überwunden 2,3}, die eine große Anzahl einzelner Moleküle mit einer Genauigkeit von ~10 nm lokalisieren können, um Bilder mit einer Auflösung von einigen Dutzend Nanometern zu erzeugen. FPALM basiert auf der Verwendung optischer Kontrolle, um Untergruppen von Molekülen zu aktivieren und zu inaktivieren (für eine vollständige Beschreibung von FPALM und Anweisungen zur Implementierung dieses Bildgebungssystems siehe Gould et al.⁴). Diese Technik ermöglicht es, die räumlichen Verteilungen ganzer Populationen einzelner Moleküle zu kartieren und so biologische Strukturen über Längenskalen von mehreren zehn Nanometern bis zu mehreren zehn Mikrometern aufzuklären. Die lokalisationsbasierte Superauflösungsmikroskopie (im Folgenden als Lokalisationsmikroskopie bezeichnet) wurde inzwischen an eine Reihe biologischer Fragestellungen angepasst, wobei technologische Entwicklungen beispielsweise die Abbildung einzelner molekularer Orientierungen mit Polarisations-FPALM oder P-FPALM⁵, die Fluoreszenzbildgebung einzelner Moleküle in drei Dimensionen mit Biplane FPALM⁶ oder anderen Techniken ermöglichen^7-9und die hochauflösende Fluoreszenzbildgebung einzelner Moleküle in lebenden Zellen^10-12. Die Lokalisationsmikroskopie wurde auch auf die Bildgebung mehrerer Spezies in fixierten Zellen angewendet^13-16. Kürzlich wurden drei Proteinspezies gleichzeitig mit FPALM sowohl in fixierten als auch in lebenden Zellen abgebildet¹⁷. Die Lokalisationsmikroskopie kann Proben abbilden, die auf verschiedene Weise markiert wurden: Beispiele hierfür sind Proteine, die mit PAFP- oder PSFP-Fusionsmarkierungen exprimiert werden, Antikörper oder Moleküle, die mit eingeschlossenen organischen Farbstoffen markiert sind, oder herkömmliche organische Farbstoffe. Während die Verwendung herkömmlicher Fluoreszenzfarbstoffe die Markierung von Proteinen in Abwesenheit eines Fusionsprotein-Tags ermöglicht, erfordern die Bedingungen, die im Allgemeinen für die Verwendung von nicht käfiggebundenen organischen Farbstoffen in der hochauflösenden Bildgebung erforderlich sind, dass Proben in Reduktionspuffer getaucht werden.². Darüber hinaus erfordert die intrazelluläre Verabreichung von Antikörper-Farbstoff-Konjugaten in der Regel, dass Zellen fixiert und ihre Membranen permeabilisiert werden. oder erfordert, dass lebende Zellen durch Elektroporation oder auf andere Weise durchlässig gemacht werden. Die Anforderungen an die Reduzierung der Pufferbedingungen und der Membranpermeabilisierung schränken die Eignung organischer Farbstoffe für die Bildgebung lebender Zellen ein, obwohl die jüngsten Entwicklungen einen effektiven Einsatz von HaloTags und FPALM zur Abbildung von Membranstrukturen ermöglicht haben¹⁸.

FPALM war die erste Lokalisationsmikroskopietechnik, die auf lebende Zellen angewendet wurde¹⁰. In lebenden Zellen kann FPALM nicht nur eine zeitabhängige räumliche Karte der Positionen markierter Moleküle liefern, sondern auch einzelne Moleküle über mehrere Frames verfolgen und molekulare Trajektorien über Zeitskalen von Millisekunden^{bestimmen 19}. Somit bietet FPALM Zugang zu relativ kurzen Zeitskalen und nanoskaliger Auflösung.

Multicolor FPALM kann für eine Vielzahl verschiedener Sonden verwendet werden, einschließlich photoaktivierbarer Proteine und organischer oder nicht käfigartiger Farbstoffe. Im Folgenden stellen wir Ihnen das Protokoll und den Aufbau für die gleichzeitige Bildgebung von zwei fluoreszierenden Proteinspezies, Dendra2 und PAmCherry, vor. Wir berichten über die Ergebnisse der Bildgebung von PAmCherry, konjugiert mit Beta-Aktin (PAmCherry-Aktin) und Dendra2, konjugiert mit Influenza-Hämagglutinin (Dendra2-HA) in NIH-3T3-Fibroblasten. Die in der Einrichtung beschriebenen Komponenten können gegen andere Hardware ausgetauscht werden, die für die Abbildung anderer Sonden besser geeignet ist. Wo dies der Fall ist, haben wir versucht, im Text explizit zu sein.

Multicolor FPALM ist ideal für die Darstellung der räumlichen Verteilungen mehrerer Proteinspezies in lebenden oder fixierten Zellen. Diese Technik eignet sich besonders für die Untersuchung räumlicher und/oder dynamischer Beziehungen auf räumlichen Längenskalen von Nanometern, obwohl Bilder die Lokalisierung auf einer Reihe von Längenskalen von Dutzenden von Nanometern bis zu Dutzenden von Mikrometern berichten. Ein großer Vorteil von multicolor FPALM ist, dass der Aufbau relativ kostengünstig zu konstruieren und sehr flexibel für den Einsatz mit verschiedenen Sondenkombinationen ist. Der Prozess der Konstruktion und Kalibrierung des Systems aus Komponenten bietet auch ein beträchtliches Verständnis von Faktoren, die die Qualität und Interpretierbarkeit der Daten und damit das Forschungsergebnis beeinträchtigen können. Im Folgenden werden die Methoden für den optischen Aufbau, die Probenvorbereitung und die Datenerfassung mehrerer Proteinspezies mit PSFP- und PAFP-Fusionskonstrukten unter Verwendung von FPALM detailliert beschrieben. Während dieses Protokoll die Analyse fixierter Zellen beschreibt, sind diese Verfahren ohne weiteres auf die Bildgebung lebender Zellen anwendbar.

Der hier beschriebene optische Aufbau ist ideal für die gleichzeitige Abbildung des PSFP Dendra2 und des PAFP PAmCherry. Viele andere Sonden können für die mehrfarbige Bildgebung verwendet werden; Die genauen benötigten Komponenten können jedoch variieren, abhängig von den Anregungs- und Emissionsspektren der gewählten Sonden. Die Auswahl der dichroitischen Spiegel, Filter und Laserwellenlängen sollte auf der Grundlage dieser Überlegungen getroffen werden.

Protocol

Bitte beachten Sie: Eine schematische Darstellung der optischen Komponenten, auf die in diesem Protokoll verwiesen wird, finden Sie in Abbildung 1.

1. Vorbereitung von Zellproben

1. Plattenzellen mit einer optimierten Dichte (für NIH-3T3-Zellen ist dies ungefähr 2-5 x 10⁴ Zellen/cm²) in Vertiefungen einer 8-Well-Kammer. Die Zellen sollten mit vollständigen, für den Zelltyp geeigneten Medien plattiert werden, obwohl die Medien ohne Antibiotika und ohne Phenolrot hergestellt werden sollten, das zur Hintergrundfluoreszenz beiträgt. Beachten Sie, dass die Bedingungen für Zellexperimente, wie z. B. der optimale Bereich der Durchgangszahlen, für einzelne Zelllinien unterschiedlich sein können.
2. Die Zellen werden 24 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO₂ (oder unter für den Zelltyp geeigneten Bedingungen) inkubiert, damit die Zellen am Deckglas haften können. Transfizieren Sie Zellen mit endotoxinfreier DNA für jedes von zwei Proteinspezies-Konstrukten (in diesem Fall DNA für PAmCherry-Aktin und Dendra2-HA). Decken Sie die Probe mit lichtundurchlässigem Material wie Aluminiumfolie ab. Die Transfektion sollte Vertiefungen mit beiden DNA-Konstrukten und Vertiefungen mit nur einem dieser Konstrukte umfassen.
3. Inkubieren Sie für 4-6 Stunden, 37 °C und 5 % CO₂ (oder unter Bedingungen, die für den Zelltyp geeignet sind), bevor Sie in vollständiges Medium (mit Antibiotika, ohne Phenolrot) wechseln und 16-48 Stunden lang inkubieren, damit die Zellen die gewünschten Proteine exprimieren können.
   1. Die Zellen können fixiert werden, indem man sie dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) wäscht, dann 15 Minuten lang mit 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS bei RT inkubiert und dann weitere 3x mit PBS wäscht. Abhängig von den Proteinen, die von Interesse sind, kann diese Fixierung jedoch zu einem beträchtlichen Pool von markierten Molekülen führen, die noch beweglich sind. Um die Mobilität weiter zu reduzieren, umfassen alternative Fixierungsmethoden die Verwendung von gekühltem 100 % Methanol oder 0,2 % Gluteraldehyd und 4 % PFA in PBS für >30 min bei 25 °C²⁰. Bei beiden Methoden sollten die Zellen wie oben beschrieben mit PBS gewaschen werden. Es ist zu beachten, dass die Verwendung von Gluteraldehyd unter bestimmten Bildgebungsbedingungen die Hintergrundfluoreszenz oder Autofluoreszenz erhöhen kann und eine Nachbehandlung mit Natriumborhydrid²¹ erforderlich machen kann.
4. Die Probe kann bis zu 7 Tage vor der Bildgebung bei 4 °C aufbewahrt, in PBS getaucht und in einer selbstversiegelnden Folie versiegelt werden.

2. Ausrichtung des Mikroskops

1. Platzieren Sie eine Kalibrierskala (Absehen) auf dem Mikroskoptisch. Zentrieren Sie das Absehen mit einem 10-fachen Objektiv und der Lampe für Durchlicht in der Mitte des Sichtfelds (FOV).
2. Köhler Beleuchtung. Stellen Sie das Mikroskop auf Köhler-Beleuchtung²² ein. Schließen Sie zunächst die Feldblende und fokussieren Sie durch das Okular auf das Absehen. Wenn die Ränder der Feldblende unscharf sind, passen Sie die Höhe des Kondensors an, bis sowohl die Feldblende als auch das Absehen scharf sind.
3. Passen Sie die seitliche Position der Feldblende an, bis sie in Bezug auf das Sichtfeld zentriert ist. Schließen Sie die Feldblende, bis nur noch das mittlere Gitter auf dem Fadenkreuz beleuchtet ist.
4. Für eine grobe Ausrichtung der Kameraposition (d. h. das erste Mal, dass das Setup ausgerichtet wird) verwenden Sie eine hohe Lampenintensität bei geschlossenem Kameraverschluss und platzieren Sie keine Komponenten in Box B (Abbildung 1) in den Strahlengang, bis Schritt 2.5 erreicht ist. Platzieren Sie L2 und L3 nicht in den Erkennungspfad, wenn Sie die Kamera zum ersten Mal ausrichten. Zentrieren Sie das Fadenkreuzbild grob auf dem Kameraverschluss, indem Sie die vertikale und horizontale Position der Kamera anpassen (Abbildung 2B). Deaktivieren Sie die EM-Verstärkung, schalten Sie die Raumbeleuchtung aus und öffnen Sie den Kameraverschluss.
5. Nachdem Sie die Lampenintensität auf ein Niveau reduziert haben, das den Kamerasensor nicht beschädigt, projizieren Sie das Licht aus dem Fadenkreuzbild direkt auf den Kamerasensor (Abbildung 2A). Fokussieren Sie das Absehen, indem Sie den Fokusknopf des Mikroskops einstellen, während Sie das Bild im Live-Videomodus in der Aufnahmesoftware betrachten. Zentrieren Sie das Fadenkreuzbild auf dem Kamerasensor, indem Sie die vertikale und horizontale Position der Kamera anpassen (Abbildung 2B).
6. Platzieren Sie L2 und L3 in den Detektionspfad zwischen der Blende und der Kamera (Abbildung 2C). Richten Sie L2 und L3 so aus, dass L2 eine Brennweite vom Brennpunkt der Mikroskopaustrittsöffnung und L3 eine Brennweite vom Kamerasensor entfernt ist. Der Abstand zwischen L2 und L3 sollte idealerweise der Summe der Brennweiten von L2 und L3 entsprechen, kann aber etwas angepasst werden, um den Platzverhältnissen gerecht zu werden. Die Kamera und die Objektive sollten sich auf der gleichen Höhe wie der Ausgang befinden.
7. Beachten Sie, dass das vom Mikroskop emittierte Licht auf L2 und L3 zentriert sein sollte. Passen Sie den Abstand zwischen L2 und dem Mikroskop an, um sicherzustellen, dass das Absehenbild sowohl auf der Kamera als auch durch das Okular scharf ist.
8. Bei Bedarf können kleine Verschiebungen (z.B. <1 mm) von L2 und L3 verwendet werden, um das Absehenbild auf dem Kamerasensor zu zentrieren.
9. Zweifarbiges Modul. Sobald die Kameraposition optimiert ist, befestigen Sie die in Feld B (Abbildung 1) gezeigten Komponenten in den Erkennungspfad. Diese Komponenten können an einer abnehmbaren Halterung befestigt werden, so dass das gesamte Modul für mehrfarbige FPALM eingesetzt oder für andere FPALM-Anwendungen, die dies nicht erfordern, entfernt werden kann.
10. Wenn diese Komponenten zum ersten Mal eingebaut werden, passen Sie die Pfadlängen der einzelnen Kanäle gleich an. Projizieren Sie das Absehen auf den Kamerachip, stellen Sie M7 und M9 ein und/oder schließen Sie die Detektionsblende (AP), um eine räumliche Überlappung zwischen den beiden Kanälen zu vermeiden. Fokussieren Sie das Bild des Absehens im reflektierten Lichtkanal.
11. Wenn das Bild im Durchlichtkanal nicht scharf ist, verschieben Sie M9 (und drehen Sie es gegebenenfalls), bis das Absehenbild in beiden Kanälen gleichzeitig scharf ist. Beachten Sie, dass die beiden Kanäle seitlich voneinander verschoben werden sollten (Abbildung 2D). Diese Verschiebung, ob horizontal oder vertikal, kann sich auf die Erfassungsgeschwindigkeit auswirken. Weitere Informationen finden Sie in der Bedienungsanleitung der Kamera.
12. Nehmen Sie einen Schnappschuss der Absehenskala auf (um ihn später zur Berechnung der Gesamtvergrößerung zu verwenden). Wählen Sie mit der Kamerasoftware den gewünschten Interessenbereich aus. Höhere Bildraten sind in der Regel für einen kleineren Bereich von Interesse möglich.

3. Laserausrichtung

1. Schalten Sie die Anzeige- und Aktivierungslaser ein. (ACHTUNG: Laser sollten nur nach einer Lasersicherheitsschulung verwendet werden.) Alle Türen zum Labor sollten geschlossen bleiben, so dass sich nur geschultes Personal im Labor befindet, während die Laser ausgerichtet werden. Verwenden Sie die Verschlüsse SH1 und SH2, um die Anzeige- bzw. Aktivierungsstrahlen zu blockieren, wenn sie nicht verwendet werden, und ND-Filter, um die Laserleistung auf ein sicheres Niveau (<1 mW) zu dämpfen. Es ist hilfreich, die gesamte Raumbeleuchtung während der Ausrichtung zu minimieren, mit Ausnahme der aus Sicherheitsgründen erforderlichen Beleuchtung.
2. Blockieren Sie die Aktivierungs- und Auslesebalken. Entfernen Sie L1 aus dem Lasergang.
3. Legen Sie eine weiße Karte bündig gegen M4. Die meisten kommerziellen Verbundmikroskope verfügen über einen eingebauten Verschluss, um die einfallende Beleuchtung zu blockieren. Falls verfügbar, öffnen Sie den Mikroskopverschluss und fokussieren Sie, bis das Fadenkreuzbild auf M4 projiziert wird. Wenn kein interner Mikroskopverschluss verfügbar ist, verwenden Sie einen externen Verschluss an einer geeigneten Stelle, die verhindert, dass alle Laserstrahlen in das Mikroskop eindringen
.
4. Zentrierung des Ausleselasers im FOV. Entsperren Sie den Auslesestrahl. Zentrieren Sie den Auslesestrahl auf das Fadenkreuz des Fadenkreuzbildes auf M4, indem Sie M1 einstellen.
5. Projizieren Sie das Fadenkreuzbild auf M5 und stellen Sie den Spiegel M4 so ein, dass der Strahl auf dem Fadenkreuz auf M5 zentriert ist, so dass der Auslesestrahl mit dem Fadenkreuz sowohl bei M4 als auch bei M5 zentriert ist. Blockieren Sie den Auslesestrahl.
6. Zentrierung des Aktivierungslasers im Sichtfeld. Projizieren Sie das Fadenkreuzbild auf M3 und entfernen Sie den Strahlaufweiter (BE) aus dem Lasergang. Lösen Sie die Blockierung des Aktivierungsstrahls.
7. Passen Sie M2 so an, dass der Aktivierungsstrahl auf das Fadenkreuz des Fadenkreuzbildes auf M3 zentriert wird. Ersetzen Sie nach dem Zentrieren den BU zwischen M2 und M3 und passen Sie die Position des BU an, bis der Strahl auf dem Fadenkreuz des Fadenkreuzbildes auf M3 zentriert ist.
8. Projizieren Sie mit einem 10-fach-Objektiv das Fadenkreuzbild auf den M5 und stellen Sie bei Bedarf den Fokusknopf des Mikroskops ein, um den Fokus zu erhalten. Passen Sie den Winkel von DM1 an, bis der Aktivierungsstrahl dort auf dem Fadenkreuzbild zentriert ist. Blockieren Sie beide Balken.
9. Wenn kein Objektiv angebracht ist und der Mikroskopverschluss geöffnet ist, projizieren Sie den Ausleselaser durch die hintere Öffnung des Mikroskops. (VORSICHT: Dieser Schritt stellt ein Sicherheitsrisiko für den Laser dar, indem ein paralleler Laserstrahl in einen nicht blockierten vertikalen Pfad gerichtet wird.) Stellen Sie M5 so ein, dass der Strahl gerade aus dem Mikroskop herausragt und direkt über dem Mikroskop an der Decke landet oder auf einer Karte zentriert ist, die auf der Objektivhalterung im Revolver platziert ist.
10. OPTIONAL: Die Bestimmung der korrekten Ausrichtung kann durch die Verwendung einer Probe von Farbstoff in Lösung (in diesem Fall Rhodamin B bei ~100 μM in Wasser oder Methanol mit einer Tiefe von >0,5 cm für visuelle Zwecke) erleichtert werden, die mit der 60X-Objektivlinse auf dem Probentisch platziert wird. Wenn der Strahl korrekt ausgerichtet ist, projiziert das Objektiv einen Fluoreszenzkegel, der an der Achse des Objektivs und des Mikroskops ausgerichtet ist. Kleine Abweichungen in der Platzierung des Laserstrahls in der hinteren Apertur des Objektivs führen dazu, dass der Konus von einer rein vertikalen Ausrichtung wegkippt.
11. Blockieren Sie beide Balken. Montieren Sie L1 im Lasergang in dem entsprechenden Abstand (d. h. eine Brennweite) von der hinteren Blende der Objektivlinse. Wenn das 60X-Objektiv an Ort und Stelle ist, lassen Sie den Auslesestrahl an die Decke projizieren. Stellen Sie die horizontale und vertikale Position von L1 (senkrecht zur Richtung der Laserausbreitung) ein, bis der Strahl über dem Mikroskop zentriert ist. Hinweis: In diesem Schritt bildet der Balken einen größeren Fleck als im vorherigen Schritt.
12. Die axiale Position von L1 und seine Brennweite beeinflussen die Größe des beleuchteten Bereichs an der Probe. Streng genommen muss bei der Berechnung des Beleuchtungsprofils an der Probe die Beugung²³ berücksichtigt werden. Grob gesagt führt jedoch die Platzierung von L1 in einem anderen axialen Abstand als einer Brennweite von der hinteren Brennebene des Objektivs in vielen Fällen zu einem kleineren, intensiveren Laserbeleuchtungsprofil, als wenn L1 genau eine Brennweite von der hinteren Brennebene entfernt ist. Eine kleinere beleuchtete Fläche kann verwendet werden, um für bestimmte Anwendungen, wie z. B. die Hochgeschwindigkeitsbildgebung, eine höhere Laserintensität zu erzeugen.
13. Messung des Auslesestrahlprofils. Wenn L1 an Ort und Stelle ist, legen Sie eine Probe der geeigneten konzentrierten Farbstofflösung (in diesem Fall Rhodamin B bei ~100 μM in Wasser) auf den Tisch.
14. Wenn der Aktivierungslaser blockiert ist, projizieren Sie den Ausleselaser (stellen Sie ND1 ein, um eine Leistung <<1 mW für alle belichteten Strahlen zu erhalten) durch das 60X-Objektiv und in den Farbstoff und senden Sie dieses Bild (bei deaktivierter EM-Verstärkung) an die Kamera.
15. Fokussieren Sie das Objektiv auf die Probe. Für diesen Schritt wird eine ausreichend große Blende benötigt, um eine Abbildung des Vollstrahlprofils zu ermöglichen.
16. Verschieben Sie den AP lateral, sodass die Mitte des Trägerprofils und der AP konzentrisch sind. Wählen Sie mit der Kamerasoftware den gewünschten Bereich aus, um den kleinsten Kameraauslesebereich zu ermöglichen, der beide Kanäle umfasst. Notieren Sie sich diese Koordinaten. Nehmen Sie einen einzelnen Schnappschuss auf (dies ist das Auslesebalkenprofil).
17. Bilder, die das Laserprofil in der Fokusebene besser wiedergeben, werden erhalten, wenn die Probe der Farbstofflösung so dünn wie möglich ist. Eine solch dünne Probe kann hergestellt werden, indem ein Tropfen ~5 μl Farbstofflösung zwischen einen Objektträger und ein Deckglas gegeben wird.
18. Messung des Aktivierungsstrahlprofils. Blockieren Sie den Ausleselaser. Projizieren Sie den Aktivierungslaser auf die Probe. und projizieren Sie dieses Bild in die Kamera.
19. Verwenden Sie bei Bedarf die EM-Verstärkung <100 und stellen Sie DM1 ein, bis der Strahl in jedem Sichtfeld zentriert ist. Zeichnen Sie einen Schnappschuss des Aktivierungsbalkenprofils auf.
20. Messen Sie die Leistung jedes Strahls. Entfernen Sie die Farbstofflösung und platzieren Sie einen Leistungsmessersensor über dem 60X-Objektiv (ohne Immersionsmedien). Messen Sie die Leistung jedes Strahls (Aktivierung und Auslesung) separat. Beachten Sie, dass die Position des Leistungsmessers sorgfältig eingestellt werden muss, um sicherzustellen, dass die gesamte emittierte Laserleistung auf den Leistungsmessersensor trifft.
21. Verwenden Sie für jeden Laser Neutraldichtefilter (ND1 und ND2), um die Leistung so anzupassen, dass bei der für das Experiment geeigneten Probe Intensitäten erzielt werden.
22. Intensität des Ausleselasers für die Bildaufnahme. Die Intensität des Ausleselasers sollte so hoch eingestellt werden, dass einzelne Moleküle innerhalb weniger Bilder angeregt und photogebleicht werden können. Typische Werte sind 10^{3-10 4} W/cm² (siehe auch Gould et al.⁴). Die Intensität an der Probe hängt von der Größe des Bildbereichs ab, so dass die Leistung, die zum Erreichen der gewünschten Intensität erforderlich ist, von System zu System variiert.
23. Intensität des Aktivierungslasers. Die Intensität des Aktivierungslasers sollte so gewählt werden, dass die Anzahl der aktiven Moleküle in einem gegebenen Erfassungsrahmen klein ist (z. B. 1-100). Grob gesagt ist die gewünschte Dichte erreicht, wenn der geringste Abstand zwischen aktiven Molekülen etwas größer ist als die beugungsbegrenzte Auflösung (siehe auch Abschnitt 6, Bildgebung). Da die Population der inaktiven Einzelmoleküle abnimmt, sind höhere Intensitäten des Aktivierungslasers erforderlich. Typische Intensitäten sind ^{10-1-10 2} W/cm².
24. Optimieren Sie die Viertelwellenplatte. Die Viertelwellenplatte (QWP) ist optional, aber durch Erhöhen des Zirkularpolarisationsgrades der Auslese- und Aktivierungslaser mit einem QWP kann die Moleküldichte in den endgültigen Bildern erhöht werden. Um das QWP zu optimieren, platzieren Sie einen Polarisator zwischen dem QWP und M5. Blockieren Sie den Aktivierungslaser. Projizieren Sie den Ausleselaser auf ein Leistungsmessgerät über das trockene 60X-Objektiv.
25. Notieren Sie den Winkel des QWP. Stellen Sie den Polarisator so lange ein, bis die maximale und dann die minimale Leistung erreicht ist. Notieren Sie jeden dieser Werte und berechnen Sie das Verhältnis von Minimum zu Maximum. Stellen Sie den Winkel des QWP ein und wiederholen Sie diese Messungen. Während es wünschenswert ist, Werte nahe 1,0 zu erhalten, ist ein Verhältnis von >0,8 für die Bildgebung ausreichend.

4. Erstellen einer dauerhaften Stichprobe von Beads für die Kanalausrichtung

1. Verdünnen Sie eine Probe fluoreszierender Kügelchen (mit einem Durchmesser von 40 bis 100 nm) im Verhältnis 1:70 in Wasser in HPLC-Qualität. Verdünnen Sie diese Stammlösung weiter 1:15 in HPLC-Wasser, um ein Endvolumen von 200 μl Bead-Suspension in Wasser zu erhalten.
2. Beschichten Sie ein Deckglas mit flüssigem Poly-L-Lysin. 30 Minuten bei RT inkubieren. Aspirieren Sie, um die Lösung zu entfernen, und waschen Sie den Deckglas dreimal mit Wasser in HPLC-Qualität. Saugen Sie alle Wasserspuren aus dem Deckglas ab und lassen Sie es bei RT trocknen.
3. Pipettieren Sie 200 μl der Perlensuspension auf das Deckglas. Lassen Sie dieses Deckglas 20 Minuten bei RT einwirken, bevor Sie es dreimal mit HPLC-Wasser waschen. Alternativ können Sie das Deckglas O/N bei RT belassen, damit die Suspension trocknen kann.
4. Montieren Sie das Deckglas mit ~20 μl HPLC-Wasser oder Eindeckmedium auf einen Objektträger. Versiegeln Sie den Rand des Deckglases mit klarem Nagellack. Sobald die Politur getrocknet ist, legen Sie das Deckglas (und das entsprechende Objektiv-Immersionsmedium; entweder Wasser oder Öl) auf das 60X-Objektiv.

5. Bildaufnahme: Bildgebungsbead-Probe zur Ausrichtung der Detektionskanäle

1. Beleuchten Sie die Bead-Probe mit dem auslesbaren Laserstrahl mit einer Intensität, die etwa 10-mal geringer ist als bei der Bildgebung. Wenn die EM-Verstärkung auf 100 eingestellt ist, projizieren Sie das Bild auf die Kamera und passen Sie den Fokus an, bis in beiden Kanälen Perlen sichtbar sind.
2. Wenn die Kügelchen dunkel sind, erhöhen Sie entweder die Laserleistung oder die EM-Verstärkung. Die Minimierung des Rauschens in Bead-Bildern (durch Detektion einer großen Anzahl von Photonen, d.h. insgesamt mindestens 5.000 von jeder Bead) ist entscheidend für eine genaue Kanalregistrierung. Konfigurieren Sie die Kamera so, dass sie 100 Bilder mit der gleichen Belichtungszeit aufzeichnet, die für die nachfolgende FPALM-Bildgebung verwendet wird.
3. Suchen Sie nach Bereichen, in denen die Kügelchen sowohl in der Mitte als auch an der Peripherie der Kanäle verteilt sind und in denen die Raupendichte niedrig genug ist, dass die einzelnen Kügelchen gut voneinander entfernt sind und einzeln identifiziert werden können.
4. Erfassen Sie zwischen 10 und 20 Sätze von Bildern verschiedener Regionen bei diesen Raupendichten. Weitere Informationen zur Verwendung der Raupenbilder für die Kanalkalibrierung finden Sie im Abschnitt "Ergebnisse".

6. Bildaufnahme: Mehrfarbiges FPALM

1. Es ist wichtig, Zellen abzubilden, die mit nur einem der Konstrukte transfiziert wurden, sowie Bilder von Zellen mit allen Konstrukten aufzunehmen. Diese Daten helfen bei der Erstellung der Alpha-Histogramme jeder der verwendeten Sonden und sind für die Interpretation von mehrfarbigen Daten erforderlich.
2. Finden Sie Zellen, die photoschaltbare Sonden exprimieren, falls sie verwendet werden. Eliminieren Sie die gesamte Raumbeleuchtung. Projizieren Sie die Quecksilberlampe über die Flip-Halterung (FM) auf die Probe (mit den transfizierten Zellen). Tauschen Sie den Revolverfilterwürfel in einen Würfel aus, der die entsprechende dichroitische Spiegel-Filter-Kombination enthält, um eine Anregung des vorphotogeschalteten Zustands der Markierung zu ermöglichen. Für die Abbildung von vorfotogeschaltetem Dendra2 oder Sonden mit einer grünen vorgeschalteten Emission ist beispielsweise für DM4 ein dichroitischer Filter gewählt, der blaues Licht (<488 nm) reflektiert, und für F5 ein Filter, der Licht von ~500-570 nm durchlässt, während Licht außerhalb dieses Bereichs blockiert wird.
3. Suchen Sie mit dem Okular nach Zellen, die die präfotogequetschte Sonde exprimieren. Zum Beispiel werden Zellen, die Dendra2 exprimieren, grün angezeigt. Es ist zu beachten, dass nicht alle Sonden photoschaltbar sind und dass je nach ihren vorgeschalteten Emissionsspektren Kombinationen von DM4/F5 erforderlich sein können, die sich von den hier aufgeführten unterscheiden.
4. Sobald eine Zelle ausgewählt ist, bewegen Sie den FM nach unten, damit die Laser in das Mikroskop eindringen können (blockieren Sie das Quecksilberlicht vom Weg). Tauschen Sie den Filterrevolver so aus, dass er den entsprechenden dichroitischen Revolver für die Bildgebung enthält (in diesem Fall sollte DM2 sowohl den Auslese- als auch den Aktivierungslaser reflektieren, während er längere Wellenlängen durchlässt, und F1 sollte Wellenlängen in das Rot des Lasers übertragen und idealerweise eine hohe Unterdrückung bei der Laserwellenlänge aufweisen).
5. Wenn die Zellen keine photoschaltbare Sonde exprimieren, suchen Sie nach Zellen, indem Sie das Bild auf die Kamera projizieren und den Ausleselaser verwenden, um die Probe zu beleuchten. Einzelne Moleküle werden wahrscheinlich in vielen der Zellen sichtbar sein (siehe Abbildung 3).
6. Um transfizierte Zellen von der Hintergrundfluoreszenz zu unterscheiden (die immer noch als einzeln blinkende Moleküle erscheinen kann) und um zu bestätigen, dass Moleküle photoaktivierbar sind, beleuchten Sie die Probe kurz mit einer geringen Leistung des Aktivierungslasers (typischerweise in der Größenordnung von Mikrowatt). Die Anzahl der photoaktivierbaren Moleküle, die unter dem Auslesestrahl sichtbar sind, sollte drastisch ansteigen und auch dann noch kurzzeitig hoch bleiben, wenn die Aktivierungsbeleuchtung wieder blockiert wurde. Beachten Sie, dass verschiedene Sonden in ihrer Helligkeit, Photokonversionseffizienz und Laserleistung, die für die Aktivierung^24-27 erforderlich sind, erheblich variieren können.
7. Bereiten Sie die Kamerasoftware auf eine kinetische Serienaufnahme vor, indem Sie die EM-Verstärkung auf 200 einstellen und die gewünschte Anzahl von Bildern (in der Regel 5.000 bis 10.000) sowie die Belichtungszeit (in der Regel 10-30 ms sind angemessen) auswählen. Während die EM-Verstärkung höher als 200 eingestellt werden kann, kann eine Erhöhung der EM-Verstärkung ab einem bestimmten Punkt das Rauschen erhöhen.
8. Blockieren Sie den Aktivierungsstrahl. Heben Sie die Blockierung des Auslesestrahls auf und projizieren Sie das Bild der beleuchteten Zelle auf die Kamera.
9. Vergewissern Sie sich, dass die Zelle transfiziert wurde (Schritt 6.6). Während Sie die Zelle betrachten, stellen Sie den Fokus so lange ein, bis die gewünschte Fokusebene sichtbar ist und die Moleküle scharf fokussiert sind.
10. Um eine Brennebene zu wählen, die in der Nähe der unteren Zellmembran abbildet, verschieben Sie den Fokus nach unten, bis einzelne Moleküle nicht mehr sichtbar sind. Bewegen Sie dann den Fokus allmählich nach oben, bis die Moleküle zum ersten Mal sichtbar werden.
11. Um Bilder in der Nähe der oberen Zellmembran zu erhalten, verschieben Sie den Fokus weiter um den gewünschten Wert nach oben, wobei Sie den Abstand mit dem Fokusknopf des Mikroskops oder dem automatischen Fokus notieren. Wenn Sie einen Fokusbereich zwischen diesen beiden Grenzen auswählen, wird ein Bereich in der Mitte der Zelle abgebildet
.
12. Lösen Sie die Blockade des Aktivierungsstrahls und beleuchten Sie die Probe mit geringer Intensität (verwenden Sie die ND2-Filter, um den Strahl auf eine sehr geringe Intensität von etwa <1 W/cm² an der Probe abzuschwächen).
13. Beginnen Sie mit der Datenerfassung. Eine hohe Dichte an aktiven Molekülen ist erwünscht; Entscheidend für die Analyseschritte ist jedoch, dass sich diese Moleküle nicht räumlich überlappen.
14. Versuchen Sie, eine Dichte sichtbarer photoaktivierbarer Moleküle von ~0,1-1 ^μm-2 aufrechtzuerhalten, indem Sie ND2 anpassen. In der Regel sind für einen Bildbereich mit einem Durchmesser von ~10-20 μm ~10-100 Moleküle gleichzeitig sichtbar (siehe Abbildungen 3 und 4 als Referenz). Da die Anzahl der verbleibenden inaktiven Moleküle im Laufe der Erfassung abnimmt, muss die Aktivierungslaserleistung möglicherweise allmählich erhöht werden, um die Dichte beizubehalten.
15. Wenn eine TIRF-Bildgebung gewünscht wird*, sollten M5 und L1 beide auf einem einzigen Translationstisch montiert werden (TS, Abbildung 1), der seitlich bewegt werden kann (d. h. in einer Richtung, die senkrecht zum Laser direkt hinter dem Eingang zum Mikroskop verläuft). Wenn M5 und L1 translatiert werden, kippen die Laser, die das Objektiv nach oben durch die Probe verlassen, allmählich zur Seite (ACHTUNG: Gefahr für die Lasersicherheit).
16. Wenn der Winkel der Laser 90° von der Vertikalen erreicht, verschwindet der austretende Laser selbst, der einfallende Ausleselaser wird zurückreflektiert und tritt als Strahl aus, der sich aus der hinteren Apertur des Objektivs bewegt, antiparallel zum einfallenden Strahl und zur Seite verschoben wird.
17. Gleichzeitig wird die Hintergrundfluoreszenz fast vollständig abgeschwächt und die Dicke des Probenbereichs, der erkennbare, fokussierte Einzelmoleküle enthält, wird stark reduziert.
    *TIRF ermöglicht die Abbildung eines dünnen Schnitts der Probe, der ~100-500 nm über dem Deckglas liegt. Die Abbildung von Fokusebenen, die weiter in der Probe liegen, ist mit Weitfeldbeleuchtung leicht zu erreichen (Abschnitt 3), aber nicht für TIRF geeignet.
    
18. Schließen Sie nach Abschluss der Aufnahme sofort den Mikroskopverschluss und blockieren Sie beide Strahlen. Deaktivieren Sie die EM-Verstärkung, stellen Sie die Kamera so ein, dass sie ein Bild aufzeichnet, und stellen Sie den Anzeigebereich der Kamera auf die maximale Größe ein.
19. Blockiere einen Kanal, indem du eine Karte über F3 oder F4 legst. Mit einem Langpassfilter (>580 nm), der auf der Mikroskoplampe montiert ist, beleuchten Sie die Probe und projizieren Sie dieses Bild auf die Kamera. Nehmen Sie einen Schnappschuss der Zelle auf.
20. OPTIONAL: Wenn ein Kanal noch blockiert ist, öffnen Sie die Blende, so dass ein großer Bereich der Probe durch Durchlichtbeleuchtung sichtbar ist. Nehmen Sie einen Schnappschuss auf. Diese Durchlichtbilder sind sehr hilfreich, um den Kontext der entsprechenden FPALM-Bilder zu betrachten.
21. Bildgebung lebender Zellen. Um lebende Zellen abzubilden, transfizieren Sie Zellen gemäß den Schritten 1.1-1.3, fixieren Sie diese Proben jedoch nicht. Richten Sie stattdessen den Aufbau wie oben beschrieben vollständig aus, aber bevor Sie Proben abbilden, entfernen Sie sie von 37 °C und 5 % CO₂, waschen Sie sie 3x in PBS und tauchen Sie die Probe in bildgebende Medien (z. B. PBS mit 20 mM Glukose). Durch Entfernen von Nährmedien und Waschen wird der mit den meisten Mobilfunkmedien verbundene Hintergrund reduziert.
22. Die Proben können auf Wunsch bei RT abgebildet werden, wie es bei fixierten Zellen der Fall ist, oder bei 37 °C und 5 % CO₂ unter Verwendung eines Inkubationstisches, der auf dem Mikroskoptisch montiert ist. Eine einzelne Probe von NIH 3T3-Zellen sollte nicht länger als etwa 1 Stunde in bildgebende Medien getaucht werden. Es kann hilfreich sein, vor der Vorbereitung solcher Experimente zu überwachen, wie Zellen auf das Eintauchen in bildgebende Medien reagieren, um die Immersionszeit und möglicherweise die Zusammensetzung des bildgebenden Mediums zu optimieren, um die Störung der Zellen zu reduzieren.

Results

Influenza-Hämagglutinin (HA) bildet Cluster in der Größenordnung von Dutzenden von Nanometern bis Mikrometern, und diese Cluster kolokalisieren variabel mit Aktin (Abbildung 5). Diese räumlichen Verteilungen bestätigen die gröbere Abbildung dieser beiden Proteine²⁸ und die Abhängigkeit der räumlichen HA-Verteilungen von Aktin¹⁹. Mehrfarbige FPALM-Bilder können weiterhin verwendet werden, um die Dichte, die Fläche und den Umfang dieser Cluster sowie den Grad der Kolokalisation zwisch...

Discussion

Die lokalisierungsbasierte hochauflösende Bildgebung bietet viele leistungsstarke Funktionen für die biologische Bildgebung. Der Weg von einzelnen optischen Komponenten, die auf dem Tisch platziert werden, zu einem funktionsfähigen Superauflösungsmikroskop, das in der Lage ist, mehrere fluoreszierende Spezies in einer biologischen Probe gleichzeitig abzubilden, stellt eine Reihe von Herausforderungen dar. Einige Aspekte der Ausrichtung sind kritischer als andere; Im Folgenden bemühen wir uns, potenziellen Benutzern, die ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
LabTek II Kammern	Nunc
Fluoreszierende Kügelchen	Invitrogen	F-8801	Kügelchen zur Kalibrierung
Tetraspeck Kügelchen	Invitrogen	T-7279	Vierfarbige Kügelchen zur
Kalibrierung Objektiv-Immersionsöl	Zeiss	518F	Immersionsöl für Objektive mit hohem NA-Gehalt (abhängig von der Wahl des Objektivs)
HPLC-Wasser	Fisher Scientific	W5-4
Media	ATCC	30-2003	Or Cellgro 10-090
Antibiotika	GIBCO	15070-063
Serum	Thermo Scientific	SH30087.03
Lipofectamine	Invitrogen	52887
Optimem I	GIBCO	11058-021
Trypsin	MPBiomedicals
Paraformaldehyd	Fisher Scientific	AA433689M	VORSICHT: Giftig