Methodenartikel

Mit einem automatisierten 3D-Tracking-System werden Individuen und Schwärme von erwachsenen Zebrafischen erfasst

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DOI:

10.3791/50681

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5. Dezember 2013

 ,  , 
1R&D, xyZfish

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Verwendung eines automatischen 3D-Videosystems, das einzelne und Gruppen von Zebrafischen verfolgen kann, wird beschrieben. Als Anwendungsbeispiel untersuchen wir die Auswirkungen des NMDA-Rezeptor-Antagonisten MK-801 auf Zebrafischschwärme.

Zusammenfassung

Wie viele Wassertiere bewegt sich auch der Zebrafisch (Danio rerio) in einem 3D-Raum. Es ist daher vorzuziehen, ein 3D-Aufzeichnungssystem zu verwenden, um sein Verhalten zu untersuchen. Das vorgestellte automatische Video-Tracking-System erreicht dies durch die Verwendung eines Spiegelsystems und eines Kalibrierungsverfahrens, das den erheblichen Fehler korrigiert, der durch den Übergang von Licht vom Wasser in die Luft entsteht. Mit diesem System ist es möglich, sowohl einzelne als auch Gruppen von erwachsenen Zebrafischen zu erfassen. Vor dem Einsatz muss das System kalibriert werden. Das System besteht aus drei Modulen: Aufzeichnung, Pfadrekonstruktion und Datenverarbeitung. Es werden die Schritt-für-Schritt-Protokolle für die Kalibrierung und die Verwendung der drei Module vorgestellt. Je nach Versuchsaufbau kann das System zur Testung von Neophobie, weißer Abneigung, sozialem Zusammenhalt, motorischen Beeinträchtigungen, Erkundung neuartiger Objekte usw. verwendet werden. Es ist besonders vielversprechend als erstes Werkzeug, um die Auswirkungen von Medikamenten oder Mutationen auf grundlegende Verhaltensmuster zu untersuchen. Das System liefert Informationen über die vertikale und horizontale Verteilung des Zebrafisches, über die xyz-Komponenten kinematischer Parameter (wie Fortbewegung, Geschwindigkeit, Beschleunigung und Drehwinkel) und liefert die Daten, die zur Berechnung von Parametern für den sozialen Zusammenhalt bei der Prüfung von Schwärmen erforderlich sind.

Einleitung

Zebrafisch ist zu einem wichtigen Modell für die biologische und pharmakologische Forschunggeworden 1-3. Die Verfolgung von Bewegungs- und räumlichen Verteilungsmustern einzelner Zebrafische und von Zebrafischschwärmen ist von unschätzbarem Wert. Ältere Studien wenden eine manuelle Quantifizierung auf der Grundlage von aufgezeichneten Bildernan 4. Heute werden häufig automatische 2D-Video-Tracking-Systeme verwendet5. Da sich Zebrafische und viele andere Wasser- und Nichtwassertiere jedoch in einem dreidimensionalen Raum bewegen, wächst das Interesse an 3D-Systemen6. Das beschriebene 3D-System wurde erstmals im Jahr 2007veröffentlicht 7. Technische Details und Vergleiche mit anderen Systemen finden Sie unter8. Der grundlegende Vorteil dieses Systems im Vergleich zu anderen Systemen besteht darin, dass es zwei (optional drei) synchrone und unabhängige Ansichten mit Hilfe eines Spiegelungssystems erhält und ein zweistufiges Kalibrierungsprotokoll verwendet. Im ersten Schritt wird die 3D-Geometrie des Stereosystems (bestehend aus der Kamera und den Spiegeln) kalibriert. Im zweiten Schritt werden die durch die Lichtbrechung verursachten nichtlinearen Fehler korrigiert. Bei der Untersuchung von Wassertieren können die Auswirkungen der Lichtbrechung beträchtlich sein, wenn sie nicht korrigiert werden. Andere bisher veröffentlichte Systeme (auch neuere Entwicklungen9) verzichten auf das zweistufige Kalibrierverfahren. Für technische Details zur Objektidentifikation, Okklusion mit Multi-Objekt-Tracking, Jigging-Noise etc. Der Leser wird auf die Originalpublikationenverwiesen 8,9. Das System wurde für die Untersuchung von angstähnlichen Verhaltensreaktionen10,11, Schwarmreaktionen8,11,12 und in einer Vorstudie für antagonistisches Verhalten bei Zebrafischen13 validiert. Es wurde auch auf andere Fischarten (Goldfisch8, Schwertträger, Tigerbarbe) und auf Mäuse9 getestet.

Im Folgenden werden die Protokolle zur Kalibrierung und zur Verwendung des Systems beschrieben und die Ergebnisse eines Experiments, das die Auswirkungen des NMDA-Rezeptor-nichtkompetitiven Antagonisten MK-801 auf schwärmende Zebrafische testete, als repräsentatives Beispiel vorgestellt, um die Art von Daten zu demonstrieren, die mit dem System gewonnen werden können.

Sowohl in der natürlichen Umgebung als auch in Aquarien schwimmt der Zebrafisch normalerweise in Schwärmen14. Die Präferenzen für das Schwärmen scheinen von mehreren Faktoren abzuhängen, wie z. B. Aufzucht, Geschlecht und Nahrungsverfügbarkeit14,15. Interessanterweise wird der Abstand zwischen einzelnen Zebrafischen in einem Schwarm kleiner, wenn Signale für eine potenzielle Gefahr vorhanden sind, wie z. B. Alarmpheromone16 oder Neuheit11. Das Shoaling-Paradigma wird daher auch zur Erprobung von Anxiolytika herangezogen17. Dominanzhierarchien18 und soziales Lernen19 sind faszinierende Aspekte des Verhaltens von Zebrafischen. Aufgrund seines hoch entwickelten sozialverhaltensbezogenen Charakters sind Zebrafische auch für die Autismusforschung interessant geworden20,21.

Es wurde berichtet, dass

MK-801 das Sozialverhalten bei Zebrafischenverändert 5,22,23, was an seine Auswirkungen auf Säugetiere erinnert24. MK-801 hat aber auch viele andere Auswirkungen auf andere Verhaltensweisen (wie z.B. Schwimmverhalten, inhibitorische Vermeidung und Ortspräferenz25-27). Daher ist es entscheidend, in ersten Experimenten so viele Informationen wie möglich aus grundlegenden Beobachtungen zu gewinnen. Dies wird die Grundlage für die Gestaltung gezielterer Experimente bilden.

Übersicht über das Aufnahmegerät und die Software

In seiner aktuellen Konfiguration befindet sich der Beobachtungsbehälter (25 cm x 25 cm x 18 cm, L x B x H), in dem sich der Zebrafisch befindet, in der Beobachtungskammer (91 cm x 46 cm x 56 cm, L x B x H). In der Kammer befinden sich außerdem eine Kamera, ein Spiegel, der in einem Winkel von ca. >45° über dem Behälter aufgehängt ist, und LED-Lichtleisten. Abbildung 1 zeigt ein vereinfachtes Diagramm. Die Kamera zeichnet sowohl die Vorderansicht als auch die Draufsicht (Spiegel) auf, um die 3D-Flugbahnen des Zebrafisches zu konstruieren, indem sie seine x-, y- und z-Koordinaten bestimmt. Zur Orientierung werden die Koordinatenvektoren in der linken vorderen Ecke des Beobachtungscontainers (Position relativ zur Kamera) dargestellt, was den Vektoren entspricht, die in den 3D-Ansichten (z. B. Abbildung 15) dargestellt werden, die vom Path Reconstruction Module generiert wurden (siehe weiter unten). Die Abtastrate hängt von der Kamera und dem Computer ab. In unseren Experimenten liegt sie bei etwa 40 Bildern/sec (fps). Die räumliche Auflösung der aufgenommenen Bilder beträgt 640 x 480 Pixel (diese Konfiguration wurde gewählt, um ein optimales Gleichgewicht zwischen räumlicher und zeitlicher Auflösung zu gewährleisten). Windows XP oder höher ist erforderlich.

Vor der ersten Aufnahme muss das System kalibriert werden, um die Positionen der Wände des Behälters und der Wasseroberfläche zu bestimmen, um den Skalierungsfaktor der aufgenommenen Bilder zu bestimmen und um den beträchtlichen Fehler zu berücksichtigen, der durch die Brechung des Lichts beim Übergang vom Wasser in die Luft erzeugt wird. Grundsätzlich muss die Kalibrierung nur bei der Erstinstallation und nach dem Verschieben oder Austausch von Teilen des Setups, wie Kamera oder Spiegel, durchgeführt werden. Dennoch empfiehlt es sich, von Zeit zu Zeit zu überprüfen, ob die Kalibrierung noch korrekt ist, und gegebenenfalls neu zu kalibrieren.

Die Software besteht aus drei Modulen. Das Aufzeichnungsmodul zeichnet die Frames auf (zwei Beispiel-Frames sind in Abbildung 2 dargestellt). Das Trajectory Module rekonstruiert die Pfade für jeden Zebrafisch. Das Data Processing Module berechnet eine Reihe von kinematischen und räumlichen Standardparametern. Zum Zwecke der weiteren Analyse können die Daten in Tabellenkalkulationen oder Statistiksoftware importiert werden.

Protokoll

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem National Institute of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt.

1. Kalibrierung

  1. Stellen Sie einen leeren Beobachtungsbehälter so in die Kammer, dass die Füße des Behälters in die dafür vorgesehenen Löcher eingesetzt werden, um eine korrekte Ausrichtung zu gewährleisten. Richten Sie den Behälter so aus, dass die halbtransparenten Wände (deren Struktur dazu dient, Reflexionen zu reduzieren) zur abgewandten Seite und rechts von der Kamera zeigen.
  2. Öffnen Sie das Aufnahmemodul, wählen Sie "Kamerasteuerung" und stellen Sie "Verstärkung" und "Auslöser" ein (nachdem Sie sie abgewählt haben, Kästchen auf der rechten Seite), so dass das Bild klar ist. Platzieren Sie den Seitenspiegel in einem Winkel von ca. 45° an der linken Seite des Beobachtungsbehälters, so dass die Seitenansicht des Behälters auf dem Computermonitor vollständig sichtbar ist. Darüber hinaus muss der Spiegel so ausgerichtet werden, dass die Vorderwand des Behälters als eine Linie zu sehen ist (wie durch den Pfeil in Abbildung 3 angedeutet).
  3. Schließen Sie das Kalibrierungspanel an den parallelen Anschluss (der Kamerakarte) an und drücken Sie die Taste "LED-Panel ein/aus" im Aufnahmemodul, um die LEDs einzuschalten.
  4. Platzieren Sie die Kalibriertafel so in den leeren Beobachtungsbehälter, dass die 5 LEDs in der Vorder-, Ober- und Seitenansicht auf dem Computermonitor zu sehen sind, wie in Abbildung 3 (manchmal blockiert das Kabel die Sicht, in diesem Fall verschieben Sie es). Achten Sie auch darauf, dass sich die LEDs unterhalb der Markierungen für den Wasserstand befinden (diese Markierungen sind in den Beobachtungsbehältern in 135 mm Entfernung vom Innenboden des Tanks eingraviert) und dass die Position der Platte stabil ist (damit sie sich beim Befüllen des Behälters mit Wasser in Schritt 1.9 nicht bewegt).
  5. Schalten Sie das Licht in der Beobachtungskammer aus und schließen Sie den Vorhang (achten Sie darauf, das Kabel der Kalibriertafel oder den Seitenspiegel nicht zu berühren).
  6. Drücken Sie die Schaltfläche "Datenspeicherort" und erstellen oder wählen Sie einen Ordner für die Kalibrierungsdateien aus. Diese Dateien werden für alle nachfolgenden Aufnahmen (oder Experimente) verwendet, bis eine Neukalibrierung erforderlich wird. Machen Sie daher im Idealfall die Kalibrierdaten zu einem Teil des Namens des Kalibrierordners.
  7. Stellen Sie die drei roten Felder auf dem Computerbildschirm so ein, dass jedes nur die 5 LEDs in einer der drei Ansichten umfasst (Abbildung 4, linkes Feld). Verwenden Sie erneut "Gain" und "Shutter" unter "Kamerasteuerung", um klare Bilder der LEDs zu erhalten, ohne Bilder von anderen Lichtpunkten (die auf Rauschen, Reflexionen oder Wassertropfen an der Wand des Behälters zurückzuführen sind), wie in Abbildung 4, rechtes Feld.
  8. Schalten Sie die LEDs aus und drücken Sie die Taste "Kalibrierung ohne Wasser sammeln". Auf dem Computerbildschirm erscheinen 5 Tags ('x'), die von 0-4 nummeriert sind. Schalten Sie das Panel ein. Die Positionen der Tags sollten mit den LEDs übereinstimmen. Wenn nicht, wiederholen Sie Schritt 1.7 (siehe Abbildung 4 für die Veranschaulichung der falschen Tag-Zuweisung im linken Bereich und der korrekten Tag-Zuweisung im rechten Bereich).
  9. Füllen Sie die Beobachtungskammer bis zur Markierung mit Wasser. Die LEDs sollten unter dem Wasserspiegel liegen (wie in Schritt 1.4 erklärt). Wenn sie über dem Wasserspiegel liegen, leeren Sie den Behälter und gehen Sie zurück zu Schritt 1.4. Achten Sie beim Einfüllen des Wassers in den Behälter darauf, dass sich das LED-Panel nicht bewegt. Sollte dies jedoch passieren, dann leeren Sie den Behälter und gehen Sie zurück zu Schritt 1.4. Dies ist wichtig, da die Kalibrierung auf der Bestimmung der Differenzen zwischen den aufgezeichneten LED-Positionen ohne und mit Wasser basiert.
  10. Drücken Sie die Taste "Kalibrierung mit Wasser sammeln". Auch hier erscheinen, wie in Schritt 1.8, fünf Tags auf dem Bildschirm, die in den meisten Fällen leicht von denen abweichen, die bei der Kalibrierung ohne Wasser erhalten wurden. In diesem Schritt müssen ggf. Gain und Shutter nachjustiert werden. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Tags korrekt auf den LEDs platziert sind (wie in Abbildung 4 im rechten Bereich).
  11. Schalten Sie das Licht in der Beobachtungskammer ein, stellen Sie Verstärkung und Verschluss ein (unter "Kamerasteuerung"), damit das Bild nicht zu hell wird.
  12. Abbildung 5 zeigt die sechs Punkte, die nacheinander per Rechtsklick mit der Maus ausgewählt werden müssen. Achten Sie darauf, dass sich die Punkte auf den gekennzeichneten Linien befinden: 1. Wasserstand in der Vorderansicht, 2. linker oberer Rand des Containers in der Draufsicht, 3. vertikale Linie, die die Vorderwand in der Seitenansicht umreißt. Die Länge der Leitung ist nicht entscheidend. Zwischen den Klickpositionen 1 und 2, 3 und 4 sowie 5 und 6 erscheinen gerade Linien (die Zahlen erscheinen tatsächlich nicht auf dem Bildschirm). Drücken Sie auf "Containerinformationen sammeln", um diese Informationen zu speichern.
  13. Entfernen Sie sowohl den Seitenspiegel als auch die LED-Blende und füllen Sie das Wasser genau bis zur Markierung. Wählen Sie "Aufnahme starten". In einem neuen Fenster wird die Dauer in Minuten abgefragt. Für den aktuellen Zweck ist 1 min ausreichend. Drücken Sie OK.
  14. Beenden Sie nach der Aufnahme das Aufnahmemodul, öffnen Sie das Trajektorienmodul, wählen Sie den Kalibrierungsordner (in Schritt 1.6 erstellt) mit 'Datenspeicherort' aus (das Laden der Datei kann einige Zeit dauern). Dieser Ordner enthält die Kalibrierungsdateien und die Dateien der soeben aufgenommenen Daten (Schritt 1.13).
  15. Drücken Sie die Schaltfläche "Hintergrund erfassen". Es öffnet sich ein neues Fenster, ohne etwas zu ändern, drücken Sie OK und warten Sie, bis ein (auf dem Kopf stehendes) Bild des Beobachtungsbeckens auf dem Monitor erscheint. Drücken Sie dann auf "Hintergrund laden". Das Hintergrundbild wird korrigiert. Es öffnet sich ein neues Fenster, in dem Sie aufgefordert werden, die Felder anzupassen. Drücken Sie einfach auf OK.
  16. Drücken Sie nacheinander die dritte bis siebte Taste: "Korrespondenz ohne Wasser laden", "Virtuelle Kamera(s) kalibrieren", "Gebrochene Korrespondenz laden", "Behältergeometrien sammeln", "Tierbehälterinformationen abrufen". Dieser letzte Schritt kann einige Minuten dauern. Sie ist abgeschlossen, wenn drei weiße Linien auf dem Bildschirm erscheinen (das sind die Linien, die in Schritt 1.12 gezeichnet wurden). Klicken Sie auf die Schaltfläche "Container-Info speichern".
  17. Drücken Sie die Taste "Volumen sammeln". Markieren Sie nun, wie in Abbildung 6 gezeigt, nacheinander die 8 Ecken des Gewässers, das ein Quader ist. Für jeden Punkt klicken Sie ihn zuerst in der Vorderansicht und dann in der Draufsicht an.
  18. Wählen Sie "3D" in der linken Ecke des Fensters. Nun öffnet sich ein neues Fenster, das den Umriss eines Kastens mit weißem Boden zeigt (wie in Abbildung 15, aber ohne die Trajektorie). Klicken Sie mit der rechten Maustaste, um Rotationen und Verschiebungen der Boxansicht auszuwählen. Wenn kein Bild erscheint oder wenn es sich nicht um ein Quader handelt (d.h. in Schritt 1.17 wurden die Ecken in der falschen Reihenfolge mit der rechten Maustaste angeklickt (z.B. wurden die Ecken in der falschen Reihenfolge angeklickt), gehen Sie wie folgt vor: Gehen Sie beim Verlassen, aber nicht Schließen des Trajectory Moduls unter Windows in den Kalibrierungsordner (erstellt in Schritt 1.6), wählen Sie den Unterordner 'Animal container data' und löschen Sie die Datei mit dem Namen TankVertices und wiederholen Sie Schritt 1.17.
  19. Herzlichen Glückwunsch, die Kalibrierung ist abgeschlossen. Idealerweise sollte ein Testlauf mit einem Dummyfisch durchgeführt werden, um zu überprüfen, ob alles gut funktioniert. Die gute Nachricht ist, dass eine Rekalibrierung nur dann durchgeführt werden muss, wenn die Positionen des Spiegels oder der Kamera (auch nur geringfügig) verändert wurden oder wenn es Probleme mit der Nachführung gibt (siehe Abschnitt 3).

2. Aufnahme

  1. Stellen Sie den bis zu den Markierungen mit Wasser gefüllten Beobachtungsbehälter so in die Beobachtungskammer, dass die Füße des Behälters in die dafür vorgesehenen Löcher zur korrekten Ausrichtung eingeführt werden. Richten Sie den Container so aus, dass die halbtransparenten Wände (oder weiße Wände in unserem Beispiel - siehe Diskussion) aus Sicht der Kamera zur abgewandten Seite und nach rechts zeigen.
  2. Schalten Sie das Licht im Fach ein, setzen Sie den (Versuchs- oder Dummy-)Fisch in den Behälter und schließen Sie die Vorhänge. Hinweis: Das System kann mehrere Fische aufzeichnen (siehe Abschnitt Repräsentative Ergebnisse); Es empfiehlt sich jedoch, einige Erfahrungen mit dem System zu sammeln, indem man zunächst einzelne Fische aufzeichnet.
  3. Öffnen Sie das Aufzeichnungsmodul. Auf dem Bildschirm erscheint das Bild der Vorder- und Draufsicht (Spiegelansicht) des Containers. Das Bild ist möglicherweise nicht ideal (z. B. überbelichtet, z. B. Abbildung 7) und muss möglicherweise angepasst werden (die nächsten drei Schritte), um einen guten Kontrast zwischen Fisch und Hintergrund zu erhalten (z. B. Abbildung 8).
  4. Wählen Sie "Kamerasteuerung" und stellen Sie im sich öffnenden Fenster "Allgemeine Einstellungen" "Verschluss" und "Verstärkung" (nach Abwahl der entsprechenden Kästchen rechts, siehe Abbildung 9) so ein, dass das Bild nicht überbelichtet wird und ein guter Kontrast zwischen Fisch und Hintergrund entsteht.
  5. Wählen Sie auf der linken Seite des Fensters "Kamerasteuerung" die Option "Weißabgleich/Farbe" und deaktivieren Sie im neuen Fenster das Kontrollkästchen "Auto" und passen Sie die Rot- und Blauwerte an (siehe Abbildung 10), um den besten Farbkontrast sowohl in der Vorder- als auch in der Draufsicht zu erzielen.
  6. Es kann notwendig sein, einige Male zwischen der Anpassung der Farbe (unter "Weißabgleich/Farbe") und der Anpassung von Verstärkung und Verschlusszeit (unter "Allgemeine Einstellungen") zu wechseln, um die beste Kameraeinstellung zu erhalten. Beachten Sie, dass selbst wenn Sie ohne Anpassung zufrieden sein sollten, es wichtig ist, die Kontrollkästchen "Shutter", "Gain" und "Auto" zu deaktivieren (wie in den Schritten 2.4 und 2.5 beschrieben), da sonst der Hintergrund im Laufe der Aufnahme schwankt, was es unmöglich macht, die Trajektorien zu extrahieren. Ändern Sie keine der anderen Einstellungen. Wenn Sie fertig sind, schließen Sie das Fenster "Kamerasteuerung".
  7. Wählen Sie im Hauptmenü des Aufzeichnungsmoduls "Datenspeicherort" aus, um einen zuvor erstellten Ordner zu erstellen oder zu öffnen. Beachten Sie, dass jede Aufnahme (z.B. Fisch oder Schwarm) einen eigenen Ordner erhält, der idealerweise ein Unterordner des Experimentordners sein sollte.
  8. Drücken Sie auf "Aufnahme starten". Es öffnet sich ein Fenster, in dem die Dauer der Aufzeichnung in Minuten abgefragt wird (nur ganze Zahlen eingeben). Drücken Sie auf "OK", um die eigentliche Aufnahmesitzung zu starten.
  9. Wenn die Aufnahme abgeschlossen ist, beenden Sie das Programm. Vor der Aufnahme des nächsten Fisches empfiehlt es sich, den Computer neu zu starten. Verwenden Sie die Option Neustart in Windows, um die Kameraeinstellungen (aus den Schritten 2.4 und 2.5) beizubehalten. Die Notwendigkeit, den Computer zwischen den Aufnahmen neu zu starten, ist auf einige Probleme mit der Kamerakarte zurückzuführen.
  10. Bevor Sie zum Trajektorienmodul für die Pfadrekonstruktion gehen, kopieren Sie die Unterordner "Tierbehälterdaten" und "Korrespondenzdaten" aus dem Kalibrierungsordner (erstellt im ersten Abschnitt dieses Protokolls) und fügen Sie sie in jeden Ordner ein, der während der Aufzeichnung erstellt wurde. In diesen letztgenannten Ordnern befinden sich zwei weitere Unterordner, nämlich "Rohdaten" und "Zeitstempel". Ersteres enthält alle aufgezeichneten Frames im JPEG-Format; Letzteres enthält Informationen über die Gesamtzahl der Frames und die Intervalle zwischen den Frames (in ms).

3. Pfad-Rekonstruktion

  1. Öffnen Sie das Trajectory Module, drücken Sie 'Data Location', um den Ordner auszuwählen, der mit dem Record Module erstellt wurde, und drücken Sie dann die 'System Setup'-Taste, um die 'Parameters' zu öffnen (siehe Abbildung 11).
  2. Wählen Sie einen Farbschwellenwert für die obere und untere Ansicht aus. Ein guter Startwert ist 1.000. Wenn dieser Wert niedrig ist, ist es wahrscheinlicher, dass die Software Rauschen aufzeichnet. Ist der Wert jedoch zu hoch, kann es sein, dass sich der Fisch unterhalb des Erfassungsbereichs befindet. Später (Schritte 3.11 und 3.12) kann es notwendig werden, die Farbschwellenwerte neu anzupassen. Beachten Sie auch, dass die oberen und unteren Farbschwellenwerte nicht identisch sein müssen.
  3. Wählen Sie Schwellenwerte für die Größe der oberen und unteren Ansicht aus. Ein guter Startwert für einen mittelgroßen Zebrafisch ist 10, für einen sehr großen Zebrafisch 20 und für einen sehr kleinen 5. Je höher der Größenschwellenwert ist, desto geringer ist die Wahrscheinlichkeit, dass Rauschen aufgenommen wird. Ist er jedoch zu hoch, kann es sein, dass die Software den Fisch auch nicht erkennen kann. Auch hier kann es in den Schritten 3.11 und 3.12 notwendig werden, die Größenschwellen neu anzupassen. Beachten Sie auch, dass die oberen und unteren Größenschwellenwerte nicht identisch sein müssen.
  4. Für 'Upper Size Threshold' ist in der Regel ein Wert von 3.000 gut und für 'Specific Length' belassen Sie ihn bei 220 (bereits voreingestellt). Die "Anzahl der Fische" bezieht sich auf die Anzahl der Fische im Beobachtungsbecken. "Maximale Punktzahl" bezieht sich auf die Gesamtzahl der Frames. Merken Sie sich diese oder eine etwas niedrigere Zahl (oder notieren Sie sie) (z. B. 45.703 kann als 45.000 auswendig gelernt werden). Drücken Sie OK.
  5. Drücken Sie nacheinander die Tasten 'Korrespondenz ohne Wasser laden', 'Virtuelle Kamera(s) kalibrieren' und 'Tierbehälter-Info laden'. Es wird eine Fehlermeldung ausgegeben, wenn die Kalibrier-Unterordner 'Tierbehälterdaten' und 'Entsprechende Daten' nicht in den aktuellen Versuchsordner kopiert wurden (siehe Schritt 2.10). Wenn ja, kopieren Sie diese Unterordner jetzt, fügen Sie sie ein und drücken Sie die Tasten erneut.
  6. Drücken Sie die Taste 'Hintergrund erfassen'. In einem neuen Fenster werden Sie aufgefordert, 'von' und 'bis' mit den Standardwerten 0 bzw. 100 auszufüllen. Ändern Sie die 100 in die maximale Anzahl von Frames (im Beispiel in Schritt 3.4 könnte dies auf 45.000 vereinfacht werden). Drücken Sie OK.
  7. Warten Sie, bis ein (verzerrtes) Bild erscheint. Drücken Sie dann auf "Hintergrund laden", was dazu führt, dass das richtige Hintergrundbild erstellt wird. Der Fisch sollte in diesem Hintergrundbild nicht zu sehen sein. Wenn der Fisch sichtbar ist, versuchen Sie, einen besseren Hintergrund aus anderen Aufnahmesegmenten zu erhalten (z.B. versuchen Sie es mit 0-1.000, 1.000-2.000 usw. in Schritt 3.6).
  8. Wenn sich der Fisch während der Aufnahmesitzung überhaupt nicht bewegt hat, besteht die einzige Möglichkeit, einen Hintergrund zu erhalten, darin, den Fisch zu entfernen und eine neue Kurzaufnahme ohne den Fisch zu machen, aber mit den gleichen Einstellungen für die Kamerasteuerung (dies ist wichtig). Rufen Sie den Hintergrund ab und kopieren Sie den Unterordner 'Hintergrunddaten' in den aktuellen experimentellen Ordner. Drücken Sie nun auf "Hintergrund laden", nicht auf "Hintergrund erfassen". Beachten Sie, dass das Öffnen und Schließen des Vorhangs oft zu einem etwas veränderten Hintergrund führt, so dass es notwendig werden kann, die Schwellenwerte in den Schritten 3.2 und 3.3 anzupassen, um das Geräusch zu reduzieren. Schritt 3.11 zeigt, wie Sie auf Rauschen prüfen.
  9. Nach dem Laden des Hintergrunds passen Sie die drei roten Kästchen (mit Hilfe der Maus) an, wie in Abbildung 12 dargestellt. Die Kästchen markieren die Bereiche, in denen die Software nach dem Fisch sucht. Schließen Sie die Box auf der linken Seite (d.h. reduzieren Sie sie auf eine Linie oder einen Punkt), da die Seitenansicht nur zur Kalibrierung verwendet wird (wie in Schritt 1.7 erklärt).
  10. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Trajektorien generieren". Es öffnet sich ein Fenster, in dem Sie nach der Startbildnummer gefragt werden. Verwenden Sie die Standardeinstellung '0'. Nachdem Sie auf "OK" geklickt haben, öffnet sich das Fenster "Tag-Zuweisungen" (siehe Abbildung 13). Drücken Sie "Schritt vorwärts", bis das Tag ("X0") auf dem Bildschirm erscheint. Wenn das Etikett nicht auf dem Bild des Fisches platziert ist, drücken Sie "Nein", bis es korrekt platziert ist. Drücken Sie dann auf "Go". Wenn es nie richtig (oder gar nicht) zugewiesen ist, drücken Sie trotzdem auf "Go" und suchen Sie nach dem Problem (nächster Schritt).
  11. Die Pfadrekonstruktion beginnt. Im Idealfall sollte der Tag immer (oder zumindest meistens) auf dem Bild des Fisches platziert werden. Wenn es oft falsch platziert ist, öffnen Sie das Fenster "Info" (zweite Wahl über dem Videobildschirm). Abbildung 14A zeigt den Idealfall, bei dem nur die Umrisse des Fisches zu sehen sind. Abbildung 14B zeigt einen Fall von übermäßigem Rauschen, das die korrekte Tag-Zuweisung verhindert. Wenn Sie ein klares Bild des Fisches ohne Rauschen sehen (wie in Abbildung 14A), das Tag aber nie oder nur selten korrekt zugewiesen wird, dann ist der wahrscheinlichste Grund, dass die Kalibrierung ausgeschaltet ist. Kalibrieren Sie die Pfadrekonstruktion neu und wiederholen Sie sie. Wenn während der Kalibrierung Spiegel und Kameras nicht bewegt werden, können die neuen Kalibrierungsdaten für die zuvor durchgeführten Aufnahmen verwendet werden.
  12. Bei übermäßigem Rauschen (wie in Abbildung 14B) drücken Sie im Hauptmenü auf "Stopp" und wählen Sie neue Farb- und Größenschwellenwerte (Schritte 3.2 und 3.3). Prüfen Sie auch, ob die roten Kästchen (Schritt 3.9) etwas reduziert werden können (z.B. um das Geräusch auszuschließen, das durch Wasserbewegungen an der Oberseite entsteht). Beachten Sie, dass das Programm manchmal 'hängen' bleibt (wenn überhaupt kein Tag zugewiesen werden konnte): In diesem Fall starten Sie das Programm neu.
  13. Beobachten Sie die Flugbahn auf dem 3D-Bildschirm (dritte Wahl über dem Bildschirm). Abbildung 15. stellt ein Beispiel für eine Trajektorie dar. Wählen Sie mit der rechten Maustaste zwischen Drehung und Verschiebung der 3D-Konfiguration.
  14. Wenn die Trajektorie abgeschlossen ist, drücken Sie nacheinander die Tasten 'Save' (nicht 'Stop', wodurch die Trajektorie gelöscht wird!), 'Trajektorienbereinigung' und 'Trajektorienglättung'. Es öffnet sich ein neues Fenster, in dem die Filterparameter für die Glättung angezeigt werden (Abbildung 16). Ändern Sie die Standardwerte nicht, bevor Sie mehr Erfahrung mit dem System gesammelt haben. Drücken Sie 'OK'.
  15. Inzwischen sollte klar sein, warum die Wahl einer guten Kameraeinstellung (mit gutem Kontrast zwischen Fisch und Hintergrund) vor der Aufnahme (siehe Schritte 2.4-2.6) so wichtig war. Fahren Sie mit der Datenverarbeitung fort.

4. Datenverarbeitung

  1. Werfen Sie zunächst einen Blick auf den Ordner, der für die Aufzeichnung der Fische verwendet wurde (Abbildung 17). Es enthält die Unterordner 'Tierbehälterdaten' und 'Korrespondenzdaten', die aus dem Kalibrierungsordner (Schritt 2.10) kopiert wurden, die Unterordner 'Zeitstempel' und 'Rohdaten', die während der Aufzeichnung des Fisches erstellt wurden, sowie die Unterordner 'Hintergrunddaten' und 'Trajektorien', die bei der Pfadrekonstruktion erstellt wurden.
  2. Abbildung 17 zeigt auch, dass der Unterordner "Trajectories" drei Dateien enthält. Die point.smoothed-Datei ist die Datei, die für die weitere Datenverarbeitung verwendet wird. Bei der Aufzeichnung mehrerer Fische (z.B. Schwarmexperiment) wird für jeden Fisch eine separate point.smoothed-Datei erzeugt.
  3. Abbildung 18 zeigt den oberen Teil einer Beispieldatei point.smoothed-file. Die erste Zeile gibt die Gesamtzahl der Samples oder Frames an, die zweite Zeile die Dauer der Aufnahme (in Minuten) und die dritte Zeile die Koordinaten (Sequenz: x, z, y) des Zentrums des Gewässers relativ zur Kamera. Darauf folgt eine Zeile für jedes Frame, die die x-, y- und z-Koordinaten (in mm) für den Fisch und die Dauer dieser Probe (in Sekunden) angibt.
  4. Es gibt zwei Möglichkeiten, die in den point.smoothed-Dateien bereitgestellten Daten zu verarbeiten: Verwenden Sie das Datenverarbeitungsmodul oder verwenden Sie eine andere Software wie Excel oder MATLAB, um Berechnungen durchzuführen, die (noch) nicht im Datenverarbeitungsmodul enthalten sind.
  5. Öffnen Sie das Datenverarbeitungsmodul, wählen Sie in der Symbolleiste "Projekt" aus, wählen Sie dann aus dem Pulldown-Menü "Neu" und geben Sie dann einen Namen für das Experiment ein. Wählen Sie in der Symbolleiste "Projekt bearbeiten", wählen Sie "Zu Projekt hinzufügen" aus dem Pulldown-Menü, gefolgt von "Neue Gruppe" und geben Sie einen Namen für die Gruppe ein (z. B. "Steuerelemente"). Beachten Sie, dass die Projekt- und Gruppennamen zu diesem Zeitpunkt nicht wirklich verwendet werden, sondern die Namen ausgefüllt werden müssen. Die erstellten Ordner können zum Speichern der Ausgabedateien verwendet werden (siehe Schritt 4.10).
  6. Wählen Sie im rechten Fenster eine Gruppe (z.B. 'Steuerelemente') aus (siehe Abbildung 19). Die Symbolleiste ändert sich. Wählen Sie "Gruppe bearbeiten", dann "Zur Gruppe hinzufügen" aus dem Pulldown-Menü und dann "Neue Messungen". Dadurch wird ein Browser geöffnet. Öffnen Sie den Ordner, der während der Aufnahme erstellt wurde (Schritt 2.7), wählen Sie den Unterordner 'trajectories' und dann die point.smoothed-Datei. In dem in Abbildung 19 dargestellten Beispiel wurden für Gruppe A sechs Dateien geladen, für Gruppe B vier Dateien. (Beachten Sie, dass im illustrierten Beispiel die geglätteten Dateien die Erweiterungen 0 und 1 haben, da in diesem Experiment zwei Goldfische gleichzeitig getestet wurden).
  7. Zur Analyse wählen Sie im rechten Fenster die punktgeglättete Datei aus, wählen Sie "Datenverarbeitung", wählen Sie "Einzelne Endpunkte" aus dem Pulldown-Menü und wählen Sie als Beispiel "Dauer einfrieren" (Abbildung 20). Es öffnet sich ein Fenster, in dem Sie das Einfrieren in Bezug auf den Geschwindigkeitsschwellenwert und den Dauerschwellenwert festlegen können. Im Beispiel verbringt der Fisch 25,86 % der Beobachtungszeit mit dem Einfrieren.
  8. Um sich mit dem Programm vertraut zu machen, probieren Sie andere Beispiele aus, wie z.B. Fahrstrecke, Tiefenverteilung (mit der Sie die Anzahl der Tiefenstufen bestimmen können) und Burst-Häufigkeit.
  9. Es gibt weitergehende Berechnungen, wie z. B. die spektrale Analyse der z-Komponente der Beschleunigung. Wählen Sie in diesem Fall "Zeitreihenmerkmale", dann "TD-Frequenzbereichsanalyse", "Spektralanalyse" und "Z-Beschleunigungsspektrum". Die Fourier-Analyse wird für den angegebenen Parameter durchgeführt (zur Erklärung7). Noch sind nicht alle Optionen, die im Menü angezeigt werden, vollständig implementiert. Zum Beispiel wurde 'Pfadtortuosität' nur experimentell hinzugefügt.
  10. Wenn Sie die Option "Stapelverarbeitung mit Standardschwellenwert" auswählen, werden ca. 200 Endpunkte berechnet. "default" bedeutet in diesem Zusammenhang, dass Trennzeichen gesetzt wurden. Zum Beispiel wird derzeit die Tiefenverteilung für drei Tiefenebenen berechnet, die Winkelverteilung wird für vier Abschnitte (d.h. Quadranten) usw. berechnet. Nach dem Generieren der Parameter öffnet sich ein neues Fenster, in dem Sie nach dem Speicherort und dem Namen der zu erstellenden Datei gefragt werden. Diese werden im CSV-Format gespeichert und können zur weiteren Verarbeitung in andere Software, wie z.B. Excel, importiert werden.
  11. Im Gegensatz zum Recording Module und Trajectory Module handelt es sich beim Data Processing Module um ein sich weiterentwickelndes Modul, das weiter an die Anforderungen der Forschenden angepasst wird.

Ergebnisse

Weibliche Zebrafische (Danio rerio) im Alter von sechs Monaten einer nicht näher spezifizierten Wildtyp-Stammeslinie („short-fin“) wurden von Aquatica Tropicals, Inc. bezogen. Insgesamt wurden 120 Zebrafische verwendet. Sie wurden etwa 8 Wochen lang in 38-L-Aquarien an die Laborbedingungen akklimatisiert, bevor die Experimente begannen. Die Wassertemperatur entsprach der Raumtemperatur (~23 °C). Lichtregime: 14 Stunden Licht (6:00–20:00), 10 Stunden Dunkelheit. Die Zebrafische wurden dreimal täglich gefüttert: 8:00 Tetra-tropische Flocken; 12:00 lebende Artemia-Larven; 15:00 Tetra-tropische Flocken. An den Tagen der Experimente erhielten die Zebrafische nur um 8:00 Flockenfutter. Unmittelbar nach der zweiten Aufnahme wurden die Zebrafische mit 300 mg/L Tricainmethansulfonat (MS-222) euthanasiert.

Für die Kontrollgruppe wurden 14 Vierergruppen (d. h. Gruppen aus vier Zebrafischen) verwendet (n = 14), für die MK-801-Gruppe 16 Vierergruppen (n = 16). Nach einer einstündigen Exposition gegenüber 10 µM MK-801 (beginnend um 9:30) in 1-Liter-Behältern wurden die Vierergruppen in Beobachtungsbehälter transferiert. Die Aufnahme wurde unmittelbar danach (um 10:30) gestartet und dauerte 20 min. Anschließend blieben die Zebrafische 3,5 Stunden lang in den Behältern. Während dieser Zeit wurde Belüftung über einen Schlauch, der an eine Luftpumpe angeschlossen war, bereitgestellt. Um 14:00 erfolgte eine zweite 20-minütige Aufnahme. Das Ziel der beiden Aufnahmen bestand darin, die Effekte der Habituation und/oder der Abnahme der Wirkung der Substanz zu untersuchen (die Halbwertszeit von MK-801 bei Ratten beträgt etwa 2 Stunden28). Wir analysierten (1) die durchschnittlichen sozialen Abstände (auch als interindividuelle Abstände11,29 bezeichnet) als Maß für die soziale Kohäsion, (2) die vertikale Verteilung über zehn Tiefenstufen, (3) die horizontale Verteilung über vier radiale Zonen (siehe Abbildung 24A, Einlage für die Positionen der Zonen) und über Quadranten (siehe Abbildung 24B, Einlage für die Positionen der Quadranten) sowie (4) die drei Komponenten (x, y, z) der zurückgelegten Distanz. Die Daten wurden pro Schwarm gemittelt. Nachdem Shapiro-Wilkins-Tests gezeigt hatten, dass nicht alle Variablen normalverteilt waren, wurden für alle Variablen U-Tests nach Mann-Whitney angewandt, um die Mittelwerte der Kontroll- und MK-801-Gruppen zu vergleichen. Diese Vergleiche wurden separat für die Vormittags- und Nachmittagssitzungen durchgeführt. Wir wählten α = 0,05/4 = 0,0125, da vier (Gruppen von) Variablen verwendet wurden (siehe oben).

Abbildung 2A zeigt ein typisches Beispielbild für Kontroll-Zebrafische und Abbildung 2B ein typisches Beispielbild für mit MK-801 behandelte Zebrafische, beide während der Vormittagssession aufgezeichnet. Beachten Sie, dass sich die Kontroll-Zebrafische nahe am Boden und nahe an der vorderen Wand (d. h. der Seite, die der Kamera am nächsten ist) aufhielten und eng beieinander blieben (d. h. die soziale Kohäsion war hoch). Im Gegensatz dazu befanden sich die mit MK-801 behandelten Zebrafische nahe an der Wasseroberfläche, zeigten keine Präferenz in der horizontalen Ebene und schwammen beträchtlich weit voneinander entfernt (d. h. die soziale Kohäsion war gering). Abbildung 21 zeigt repräsentative Bewegungsbahnen. Die Kontroll-Zebrafische zeigten eine deutliche Tendenz, sich an der vorderen Seite des Beobachtungsbehälters aufzuhalten. Außerdem blieben sie meistens nahe am Boden. Die mit MK-801 behandelten Zebrafische schwammen dagegen überall in der horizontalen Ebene. Sie zeigten jedoch um 10:30 eine klare Präferenz für die oberen Tiefenbereiche. Um 14:00 Uhr wurde ihre vertikale Verteilung homogener.

Die quantitative Analyse der Daten bestätigte unsere Beschreibung. Abbildung 22A zeigt, dass der durchschnittliche soziale Abstand (d. h. der durchschnittliche Abstand zwischen den einzelnen Zebrafischen der Vierergruppen) bei den mit MK-801 behandelten Zebrafischen morgens (um 10:30 Uhr) mehr als dreimal so groß war wie bei den Kontrollfischen, mit U = 0 und p<0,00001. Nach einer 3,5-stündigen Gewöhnungsphase (um 14:00 Uhr) nahm der soziale Abstand bei den Kontrollfischen zu, während er bei den mit MK-801 behandelten Fischen weitgehend unverändert blieb. Dennoch blieb er für beide Gruppen signifikant unterschiedlich (U = 19, p<0,0005). Abbildung 22B zeigt die zeitlichen Verläufe des sozialen Abstands für die beiden Versuchsgruppen sowohl um 10:30 als auch um 14:00 Uhr.

Die vertikale Verteilung war für beide Gruppen ebenfalls sehr unterschiedlich. Abbildung 23 zeigt, dass die Kontroll-Zebrafische sowohl morgens (10:30) als auch nachmittags (14:00) den größten Teil der Zeit in den zwei bis drei tiefsten Tiefenbereichen verbrachten (d. h. den Bereichen, die dem Boden des Beobachtungsbehälters am nächsten lagen). Die MK-801-Zebrafische hingegen schwammen um 10:30 meist nahe an der Wasseroberfläche (Abbildung 23A). Nach einer 3,5-stündigen Gewöhnungsphase waren sie um 14:00 mehr oder weniger gleichmäßig über alle Tiefenbereiche verteilt.

Die horizontale Verteilung war für beide Versuchsgruppen ebenfalls sehr unterschiedlich. In Abbildung 24A ist zu erkennen, dass die mit MK-801 behandelten Zebrafische weniger Zeit in der äußeren Zone und mehr Zeit in der mittleren und zentralen Zone verbrachten als die Kontroll-Zebrafische. Die Unterschiede zwischen den Gruppen hinsichtlich der Quadranten waren noch deutlicher (Abbildung 24B). Die Kontroll-Zebrafische zeigten eine sehr starke Präferenz für die beiden vorderen Quadranten (1 und 4), d. h. die Seite des Behälters, die der Kamera am nächsten war. Die mit MK-801 behandelten Zebrafische hingegen waren mehr oder weniger gleichmäßig auf die vier Quadranten verteilt.

Was die kinematischen Parameter betrifft, beschränken wir die Diskussion hier auf die zurückgelegte Distanz (Abbildung 25). Die mit MK-801 behandelten Zebrafische bewegten sich stärker als die Kontroll-Zebrafische. Interessanterweise war dieser Unterschied besonders signifikant für die y-Komponente der zurückgelegten Distanz. Dies entspricht der Blickrichtung der Kamera (siehe Abbildung 1). Tatsächlich hielten sich die Kontroll-Zebrafische größtenteils nahe der vorderen Wand in den Quadranten 1 und 4 auf (wie in Abbildung 24A und 24B zu sehen ist). Die mit MK-801 behandelten Zebrafische hingegen bewegten sich wiederholt zwischen der vorderen und hinteren Hälfte des Behälters hin und her.

Hier haben wir nur eine Auswahl der möglichen Methoden zur Analyse der experimentell gewonnenen Daten vorgestellt. An dieser Stelle verzichten wir darauf, den Ergebnissen eine spezifische biologische Interpretation zuzuordnen. Es ist jedoch erwähnenswert, dass MK-801 bei Ratten soziale Rückzugshaltung30 und verminderte soziale Untersuchungsverhalten31 ausgelöst hat und als Modell für negative Symptome der Schizophrenie untersucht wurde30. Außerdem verursachte es Hyperaktivität31, Kreisverhalten32, sensorische Beeinträchtigungen33 und eine verminderte Präpulsinhibition34 bei Säugetieren. Obwohl wir diese Beeinträchtigungen nicht gezielt untersucht haben, scheinen unsere Befunde mit ihnen vereinbar zu sein. Um festzustellen, ob die beschriebenen Wirkungen von MK-801 bei Zebrafischen mit denen bei Säugetieren vergleichbar sind, sind spezifischere experimentelle Aufbauten erforderlich. Weitere Analysen und Experimente wären außerdem notwendig, um zu entscheiden, ob Angstzustände, Atemprobleme, räumliche Desorientierung, Aufmerksamkeitsdefizit, Stereotypien etc. eine signifikante Rolle bei den durch MK-801 induzierten veränderten Verhaltensweisen bei Zebrafischen spielten.

Schema des optischen Messaufbaus mit Kamera, Computer, Würfel und Spiegel; Photonik-Studie
Abbildung 1. Schematische Darstellung der Versuchsapparatur. Die Kamera nimmt Einzelbilder (d. h. Standbilder) auf, die sowohl die Vorderansicht als auch die Draufsicht des Beobachtungsbehälters zeigen. Die Bilder werden auf dem Computer gespeichert, um sie anschließend weiterzuverarbeiten. Beachten Sie die Positionen der xyz-Dimensionen, die wichtig sind, um die dreidimensionalen Eigenschaften der Bewegungen und Positionen der Zebrafische zu beschreiben. In unserem Experiment (siehe Repräsentative Ergebnisse) waren die beiden schattierten Wände in der Abbildung (sowie der Boden des Behälters) weiß gestrichen, während die beiden anderen Wände transparent waren. Hier klicken, um die Abbildung in größerer Auflösung anzuzeigen.

Experiment zum Fischverhalten in Aquarien, zwei Aquarien mit Fischverteilung, Versuchsanordnung für Verhaltensstudie
Abbildung 2. Beispielhafte Aufnahmen. Beachten Sie, dass alleinige Front- oder Draufsichten durch Informationsverlust gekennzeichnet sind. Dies ist besonders deutlich in Panel B zu erkennen, wo die drei Zebrafische auf der linken Seite bei Betrachtung der Frontansicht nahe beieinander zu liegen scheinen, während die Draufsicht zeigt, dass dies nicht der Fall ist. Umgekehrt liefert die Draufsicht keinerlei Hinweis auf den Abstand zum Beckenboden. A) Kontroll-Zebrafische. B) Mit 10 µM MK-801 behandelte Zebrafische. Beachten Sie, dass die Hintergrundfarbe (blau) von der Aufnahmesoftware generiert wurde und zur Erzielung eines guten Kontrasts gewählt wurde. Die tatsächliche Farbe der Rückwand und der rechten Seitenwand sowie des Beckenbodens war weiß. Hier klicken, um die Abbildung in größerer Auflösung anzuzeigen.

System zur Verfolgung des Verhaltens aquatischer Tiere; Aufbau zur Videoanalyse; Kalibrierplatte; Überwachungsprozess
Abbildung 3. Ausrichtung des Seiten­spiegels. Der weiße Pfeil links zeigt die vordere Wand (nächste zur Kamera) im Seiten­spiegel an. Falls zwei Linien sichtbar sind, korrigieren Sie die Position des Seiten­spiegels, bis nur noch eine Linie sichtbar ist (Schritt 1.2). Die 5 LEDs der Kalibrierplatte sind auf allen drei Ansichten deutlich sichtbar. Beachten Sie, dass aufgrund der eingeschalteten Beleuchtung im Behälter zahlreiche weitere Reflexionen auf dem LED-Panel sichtbar sind (Schritt 1.4). Hier klicken, um das Bild in größerer Auflösung anzuzeigen.

Prozess der Partikelerkennung, rot markierte Felder, optisches Analyse-Diagramm, bei schwachen Lichtverhältnissen
Abbildung 4. Markierung der LEDs. Das linke Panel zeigt, dass die fünf durch das Kalibrierungsverfahren identifizierten Markierungen (nummeriert von 0 bis 4) nicht mit den tatsächlichen LEDs übereinstimmen. Neben den LEDs sind weitere Lichtflecken (tatsächlich Reflexionen) sichtbar. Im rechten Panel wurden Verstärkung und Verschlusszeit so reduziert, dass nur noch die LEDs sichtbar sind. Nun werden die fünf Markierungen korrekt zugeordnet (wie in den Schritten 1.7–1.10 beschrieben). Klicken Sie hier, um die Abbildung in größerer Auflösung anzusehen.

Benutzeroberfläche der Software zur Verfolgung des Verhaltens aquatischer Tiere mit Kamera-Steuerung und Kalibrierungseinrichtung.
Abbildung 5. Erfassung der Behälterinformationen. Die Reihenfolge der sechs Punkte, die ausgewählt werden sollen (durch Rechtsklick mit der Maus), wird angezeigt. Die Linien werden automatisch gezeichnet. Beachten Sie, dass die hier angegebenen Zahlen nicht auf dem Bildschirm erscheinen. Sobald die Auswahl abgeschlossen ist, klicken Sie auf „Erfassung der Behälterinformationen“ (wie in Schritt 1.12 beschrieben). Hier klicken, um die Abbildung vergrößert anzuzeigen.

Schema des Hydrodynamikexperiments; Versuchsaufbau für Strömungsmechanik und Auftrieb; beschriftete Komponenten
Abbildung 6. Erfassungsvolumen. Rechtsklicken Sie mit der Maus an den markierten Stellen, die die Ecken des Wasserbereichs kennzeichnen: Zuerst markieren Sie die Ecke in der Vorderansicht und dann in der Draufsicht. Fahren Sie dann mit der nächsten Ecke fort (von 1 bis 8). Beachten Sie, dass die acht Punkte den Umriss des Wasserbereichs und nicht den des Tanks markieren. Außerdem ist zu beachten, dass beim Rechtsklicken der Maus nur „x0“ erscheint, das wieder verschwindet, sobald auf die nächste Stelle geklickt wird (die Zahlen 1–8 erscheinen also nicht tatsächlich auf dem Bildschirm). Das Verfahren ist in Schritt 1.17 beschrieben. Hier klicken, um die Abbildung vergrößert anzuzeigen.

Aufbau zur Verfolgung des Verhaltens aquatischer Tiere mit Kamerasteuerung, Überwachung der Bewegung der Tiere im Wassergefäß.
Abbildung 7. Ungerechter Kontrast. Das Bild ist überbelichtet und der Kontrast zwischen Fisch und Hintergrund (insbesondere in der Vorderansicht) ist gering. Hier klicken, um das Bild in größerer Auflösung anzusehen.

Aquatische Versuchsanordnung mit Fischen, die in der Studie zum statischen Gleichgewicht verwendet wurden; Experiment zur Fluiddynamik.

Abbildung 8. Korrigierter Kontrast. Der Kontrast ist im Vergleich zu Abbildung 7 nun verbessert. Beachten Sie, dass die Farben auf dem Bild falsche Farben darstellen. Hier klicken, um das Bild in größerer Auflösung anzusehen.

Kameraeinstellungsoberfläche für Bumblebee2 BB2-03S2C mit Helligkeits-, Belichtungs- und Sättigungseinstellungen.
Abbildung 9. Allgemeine Einstellungen. Nachdem im Hauptmenü „Kamerasteuerung“ ausgewählt wurde, öffnet sich das Fenster „Allgemeine Einstellungen“. Deaktivieren Sie die Felder „Verschluss“ und „Verstärkung“ und verwenden Sie die Schieberegler, um den besten Kontrast zwischen Fisch und Hintergrund zu erzielen. Klicken Sie hier, um das Bild in größerer Auflösung anzusehen.

GUI zur Kamera-Weißabgleich-Einstellung; Rot/Blau-Regler; Optimierung der Bildverarbeitung.
Abbildung 10. Farbeinstellungen. Deaktivieren Sie im Fenster „Weißabgleich/Farbe“ das Kontrollkästchen „Auto“ und verwenden Sie die Regler für „Rot“ und „Blau“, um die beste Kombination für einen guten Kontrast zwischen Fisch und Hintergrund zu finden. Parameter. Nachdem Sie das Trajectory Module geöffnet haben, wählen Sie die experimentelle Datei über „Datenort“ aus und öffnen dann das Fenster „Parameter“ über „Systemkonfiguration“. Hier werden geeignete Startwerte für die Parameter festgelegt. Hier klicken, um das Bild in größerer Auflösung anzuzeigen.

Benutzeroberfläche der Software zur Verfolgung des Verhaltens aquatischer Tiere; Kalibrierungsparameter; Einrichtung der Videoanalyse
Abbildung 11. Parameter. Nach dem Öffnen des Trajectory-Moduls wählen Sie die experimentelle Datei über „Datenort“ aus und öffnen anschließend das Fenster „Parameter“ über „Systemkonfiguration“. Hier werden geeignete Startwerte für die Parameter festgelegt. .Klicken Sie hier, um das Bild vergrößert anzuzeigen.

Aufbau zur Verfolgung des aquatischen Verhaltens, 3D-Systemkalibrierung, Software-Schnittstelle, Trajektorienanalyse
Abbildung 12. Box-Ausrichtung. Beachten Sie, wie die roten Boxen für die Ansicht von oben und von vorne die Bereiche definieren, in denen sich die Fische befinden können. Die linke Box ist zu einer Linie reduziert, um diesen Bereich von der Suche auszuschließen. Hier klicken, um das Bild in größerer Auflösung anzuzeigen.

Benutzeroberfläche der Software zur Verfolgung aquatischer Tiere, dargestellt ist die Kalibrierung und Einrichtung der Überwachung zur Verhaltensanalyse.

Abbildung 13. Markierungszuweisungen. Nachdem der Button „Spuren generieren starten“ gedrückt und der Startbildschirm (normalerweise Bild #0) ausgewählt wurde, öffnet sich das Fenster „Markierungszuweisungen“. Drücken Sie „Weiter“, bis die Markierung („X0“) auf dem Bildschirm erscheint. Falls die Markierung nicht korrekt auf dem Fischbild platziert ist, drücken Sie „Nein“, bis sie richtig positioniert ist. Danach drücken Sie „Weiter“.Klicken Sie hier, um das Bild in größerer Auflösung anzusehen.

Diagramm der dynamischen Analyse mit Kraftvektor, Spannungskonzentration; Komponenten bezeichnet mit A, B.
Abbildung 14. Info-Bildschirm. Das Feld (A) zeigt die korrekte Markierungszuordnung. Die Markierung („X0“) ist in beiden Ansichten auf dem Bild des Fisches platziert. Üblicherweise verläuft eine Linie durch die Markierung. Das Feld (B) zeigt übermäßiges Rauschen und das Fehlen einer Markierungszuordnung. Die Einzelbilder wurden aus derselben Aufnahme gewonnen, wobei die Farb- und Größenschwellenwerte (in Schritt 2.2) von 1.000–50 bzw. 10–5 geändert wurden. Hier klicken, um das Bild in größerer Auflösung anzusehen.

3D-Trassenanalyse, Vektordiagramm zur Veranschaulichung der Teilchenbewegung in kartesischen Koordinaten
Abbildung 15. Dreidimensionale Darstellung des rekonstruierten Weges. Der Ursprung der Pfeile befindet sich aus Orientierungsgründen an der linken vorderen Ecke des Beckens (siehe auch Abbildung 1). In diesem Beispiel bleibt der Fisch demnach nahe an der linken Wand (relativ zur Kamera). Hier klicken, um die Abbildung in größerer Auflösung anzuzeigen.

Parameterfenster für die Glättung von Trajektorien; Filtereinstellungen: Rauschschwellen, Fenstergröße
Abbildung 16. Glättung von Trajektorien. Dieses Fenster öffnet sich nach Betätigen der Schaltfläche „Glättung von Trajektorien“. Akzeptieren Sie vorerst den Standardwert, indem Sie auf „OK“ klicken. Hier klicken, um das Bild vergrößert anzuzeigen.

Diagramm zur Dateiorganisation mit Datenübertragung vom Ordner „fish1“ in den Unterordner „Trajektorien“.
Abbildung 17. Unterordner. Der während der Aufnahme erzeugte Ordner ist oben dargestellt. Nach der Pfadrekonstruktion enthält er die sechs angegebenen Unterordner. Klicken Sie hier, um das Bild in größerer Auflösung anzusehen.

Numerische Daten im Textformat zur statistischen Analyse.
Abbildung 18. Glatte Datei. Der obere Teil einer beispielhaften point.smoothed-Datei ist dargestellt, mit Angabe der Anzahl der Einzelbilder, der Aufzeichnungsdauer (in min), der Koordinaten der Mitte des Wasserbereichs relativ zur Kamera sowie für jedes Einzelbild der Koordinaten und der Dauer. Hier klicken, um das Bild in größerer Auflösung anzusehen.

Benutzeroberfläche der Datenverarbeitungssoftware zur Analyse von Bahnverlaufdaten; Projekteinrichtung und Gruppeneinteilungen
Abbildung 19. Datenverarbeitung. Auswählen der Dateien, die analysiert werden sollen (rechtes Fenster). Klicken Sie hier, um das Bild in voller Größe zu sehen.

ABMT-3D-Datenverarbeitungsoberfläche mit Darstellung des Einfrier-Analyse-Setups zur Trajektorieauswertung.
Abbildung 20. Beispielhafte Analyse. Die gewünschten Endpunkte können durch Auswahl aus dem Menü berechnet werden. In diesem Beispiel wurde „Dauer des Einfrierens“ ausgewählt. Das Programm fordert zur Eingabe von Schwellwerten für Geschwindigkeit und Dauer auf, die das Einfrieren definieren. Das Ergebnis wird als Prozentsatz der Gesamtdauer der Aufnahme angegeben. Hier klicken, um das Bild in größerer Auflösung anzusehen.

Diagramm der Bewegungsanalyse mit verfolgten Pfaden bei Kontroll- und MK-801-Mäusen über verschiedene Zeitintervalle
Abbildung 21. Repräsentative Trajektorien. Es werden zwei repräsentative Trajektorien für Kontroll-Zebrafische und zwei repräsentative Trajektorien für mit 10 µM MK-801 behandelte Zebrafische für die Morgensitzung ab 10:30 Uhr (obere Reihe) sowie für die Nachmittagssitzung ab 14:00 Uhr (untere Reihe) dargestellt. Die Trajektorien der einzelnen Zebrafische jedes Vierer-Ensembles sind jeweils in einer anderen Farbe dargestellt. Beachten Sie jedoch, dass ein Austausch der Markierungen stattgefunden haben könnte. Falls es entscheidend ist, den Verlauf der einzelnen Linien zu verfolgen, ist eine manuelle Korrektur erforderlich. Die linke vordere Seite (Ursprung der Einsetzpfeile) des dargestellten Behälters ist die Seite, die der Kamera am nächsten liegt (siehe Abbildung 1 für die Positionierung des Beckens). Hier klicken, um das Bild in größerer Auflösung anzusehen.

Analyse des sozialen Abstands; Graph; Kontrolle im Vergleich zur MK-801-Wirkung; vergleichende Sitzungsergebnisse; Zeitreihe.
Abbildung 22. Durchschnittlicher sozialer Abstand zwischen Fischen. A) Die durchschnittlichen sozialen Abstände für Kontroll-Zebrafische und mit 10 µM MK-801 behandelte Zebrafische werden für die Morgen- und Nachmittagssitzungen dargestellt. Mittelwert und Standardfehler des Mittelwerts (S.E.M.) sind angegeben. ***, p<0.001. B) Die Zeitverläufe des durchschnittlichen interindividuellen Abstands sind für beide Gruppen dargestellt. Klicken Sie hier, um die Abbildung in größerer Auflösung anzusehen.

Tiefenanalyse; multivariate Grafik; Vergleich von Kontrolle vs. MK-801; Prozentzeit vs. Tiefenstufen.
Abbildung 23. Tiefenverteilung. A) Verteilung der Zebrafische über zehn gleiche Tiefenstufen (wobei Stufe 1 der dem Boden nächstgelegene Bereich ist) für die Morgensitzung. B) Verteilung der Zebrafische für die Nachmittagssitzung. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler des Mittelwerts (S.E.M.). *, p<0.0125; **, p<0.005; ***, p<0.001. Klicken Sie hier, um das Bild in größerer Auflösung anzusehen.

Radial zone and quadrant time proportion graph; data analysis; psychological experiment results.
Abbildung 24. Horizontale Verteilungen. (A) Die zeitliche Verteilung über die vier radialen Zonen der Versuchsgruppen ist dargestellt. Die Einlage zeigt die Positionen der Zonen von Zentrum nach Peripherie: zentrale, mittlere, äußere und kombinierte Eckzonen. (B) Die zeitliche Verteilung über die vier Quadranten der Versuchsgruppen ist dargestellt. Die Einblendung zeigt die Lage der Quadranten. Durch doppelte Linien gekennzeichnete Wände stellen weiße Wände dar, durch einfache Linien dargestellte Wände stellen transparente Wände dar. Die Kamera befindet sich links neben der Einblendung. das heißt. nächstgelegen zu den Quadranten 1 und 4 (siehe auch Abbildung 1). Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler des Mittels (S.E.M.). Schwarze Sternchen bezeichnen den Vergleich zwischen den Gruppen für die Morgensitzung, graue Sternchen jene für die Nachmittagssitzungen: *, p<0,0125; **, p<0,005; ***, p<0.001. Klicken Sie hier, um die Abbildung in voller Größe anzuzeigen.

Diagramm des statischen Gleichgewichts; zurückgelegte Distanz vs. Koordinaten; Kontrolle vs. MK-801; Datenanalyse
Abbildung 25. Zurückgelegte Distanz. Die xyz-Komponenten der zurückgelegten Distanz der Zebrabärblinge während der Vormittags- und Nachmittagssitzungen sind dargestellt. Mittelwerte und Standardfehler des Mittelwerts (S.E.M.) werden angezeigt. Schwarze Sternchen kennzeichnen den Vergleich zwischen den Gruppen für die Vormittagssitzung, graue Sternchen für die Nachmittagssitzungen: *, p<0,0125; ***, p<0,001. Klicken Sie hier, um das Bild in größerer Auflösung anzusehen.

Diskussion

Das hier gezeigte experimentelle Verfahren ermöglicht die Erfassung von einzelnen Zebrafischen, Zebrafischpaaren (z.B. zur Untersuchung von Paarungen oder Aggressionen) und Zebrafischschwärmen (wie im repräsentativen Beispiel gezeigt). Das System eignet sich besonders zur gleichzeitigen Gewinnung von Informationen über die 3D-Verteilung (vertikal und horizontal), kinematische Eigenschaften (z.B. Geschwindigkeit, Beschleunigung, Drehwinkel) und soziale Parameter (z.B. sozialer Zusammenhalt). Im Folgenden listen wir einige wichtige Punkte auf, die bei der Planung von Experimenten zu beachten sind.

Je nach experimentellem Vorgehen können unterschiedliche Verhaltenssysteme untersucht werden. Um zum Beispiel Neophobie (d.h. Angst vor neuen Umgebungen) zu erforschen, sollte die Aufnahme sofort nach dem Einführen des Zebrafisches in das Beobachtungsbecken gestartet werden (nachdem man nur ein paar Sekunden gewartet hat, bis sich das Wasser beruhigt hat, um den Lärm zu verringern), ohne vorherige Gewöhnung11,17,37. Auf der anderen Seite könnten einige Forschungsthemen eine gute Gewöhnung des Zebrafisches erfordern, z. B. bei der Untersuchung der Wirkung von Alarmpheromonen16. Bei der Untersuchung von Gruppen von Zebrafischen sollte sich der Experimentator darüber im Klaren sein, dass die Software zwar das Umschalten der Tags minimiert, es aber derzeit nicht möglich ist, einzelne Zebrafische vollständig zu verfolgen. Dies ist auch nicht wichtig für Schwarmstudien, bei denen der Schwerpunkt auf dem sozialen Zusammenhalt liegt, wäre aber entscheidend für die Erforschung von Aggression oder Paarung. Die manuelle Neuzuweisung von Tags ist eine Option, kann aber sehr zeitaufwändig sein.

Die Farbe der Wände des Beobachtungsbehälters und der Beobachtungskammer kann einen großen Einfluss auf das Verhalten des Zebrafisches haben. Zum Beispiel wurde beschrieben, dass weiße Wände Aversionsreaktionen hervorrufen36, 37. Wenn Sie verschiedene Farben ausprobieren, sollten Sie zwei Dinge beachten: 1) Es ist wichtig, dass die Vorderwand (d.h. die Wand, die der Kamera am nächsten ist) transparent bleibt und dass ein Deckel (falls einer verwendet wird) ebenfalls transparent sein muss; 2) Wenn Sie eine noch nie verwendete Farbe auswählen, ermitteln Sie zunächst, ob der Kontrast zwischen Zebrafisch und Hintergrund für die Aufnahme geeignet ist. Führen Sie einen Testlauf durch. Das Ändern der Kameraeinstellungen für die Aufnahme (Verstärkung, Verschluss, Rot und Blau, wie in den Schritten 2.5 und 2.6 beschrieben) und der Einstellungen für die Trajektorienrekonstruktion (z. B. Farb- und Größenschwellenwerte, wie in den Schritten 3.3, 3.5, 3.11 und 3.12 beschrieben) kann einen großen Unterschied machen. Auch hier wird die Erfahrung mit dem System einen großen Einfluss darauf haben, was möglich ist.

Je nach Zweck des Experiments kann eine Lichtquelle mit unterschiedlichen Eigenschaften (z.B. Spektrum, Intensität) wünschenswert sein. Die LED-Leisten können einfach ausgetauscht werden. Stellen Sie sicher, dass das Licht jeden Teil des Behälters erreicht.

Wenn das Experiment erfordert, dass der Zebrafisch mehrere Stunden im Beobachtungsbehälter verbleibt, stellen Sie sicher, dass er belüftet wird. Ein Luftschlauch kann mit einem Clip an der hinteren rechten Ecke befestigt werden. Überprüfen Sie auf dem Computerbildschirm, ob der Clip die Aufnahme nicht beeinträchtigt, d.h. dass der Zebrafisch zu keiner Zeit dem Blick verborgen bleibt. In den Abbildungen 2A und 2B ist der schwarze Clip in der Draufsicht zu sehen. Idealerweise sollte die Belüftung vor oder zwischen den Aufnahmen erfolgen, aber nicht während der Aufnahme, um Lärm zu vermeiden. Beachten Sie auch, dass das Ein- oder Ausschalten der starken Belüftung den Zebrafisch erschrecken kann.

Wenn das Experiment erfordert, dass der Zebrafisch über Nacht im Behälter gehalten wird, ist es sinnvoll, die Beobachtungskammer mit einem durchsichtigen Deckel abzudecken, um zu verhindern, dass der Zebrafisch herausspringt (was sehr häufig vorkommt). Wenn die Abdeckung vor der Aufnahme nicht entfernt wird (um den Zebrafisch nicht zu stören), beachten Sie die folgenden zwei Punkte: 1) Stellen Sie sicher, dass die Spiegelbilder der Lichtquellen die Aufnahme nicht behindern (z. B. durch Verschieben der Lichtquellen oder durch Wahl eines Deckels, der das Licht nur minimal reflektiert); 2) Beachten Sie, dass der Deckel bei Verwendung über Nacht beschlagen werden kann, zumal in diesem Fall auch für eine Belüftung gesorgt werden muss; Eine Möglichkeit, dies zu reduzieren, besteht darin, einen Deckel mit kleinen Löchern zu wählen.

Für einige Experimente kann es wichtig sein, das Ausgangsverhalten des Zebrafisches zu bestimmen, bevor ein Medikament verabreicht wird. In diesem Fall kann das Medikament zwischen den Sitzungen über einen Schlauch hinzugefügt werden (ähnlich wie der oben besprochene Belüftungsschlauch).

Obwohl hier der Fokus auf der Erfassung von Zebrafischen (Danio rerio) lag, können natürlich auch andere Fischarten mit dem System erfasst werden. Es wurde verwendet, um das Verhalten von (juvenilen) Goldfischen (Carassius auratus), Tigerbarben (Barbus tetrazona) und Grünen Schwertträgern (Xiphophorus helleri) zu untersuchen.

Abschließend sei noch angemerkt, dass andere Abmessungen der Beobachtungsbecken prinzipiell möglich sind. Dies würde jedoch eine Neukonfiguration des Systems und eine gute Balance zwischen räumlicher und zeitlicher Auflösung erfordern, wenn viel größere Beobachtungscontainer verwendet werden. Darüber hinaus muss die Form des Behälters quaderförmig sein. Die Anzahl der Zebrafische oder anderer Versuchspersonen ist theoretisch unbegrenzt; Das Tag-Swapping nimmt jedoch mit der Anzahl der Motive zu.

Offenlegungen

Hans Maaswinkel, Liqun Zhu und Wei Weng sind Mitarbeiter von xyZfish, Ronkonkoma NY, die das in diesem Artikel verwendete Tracking-System herstellen.

Danksagungen

Die Autoren haben keine Danksagungen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AABT-3D Tracking HardwarexyZfishAABT IIInklusive Kamera, Grafikkarte, Beobachtungsfach mit Spiegel und Beleuchtung
AABT-3D KalibriergerätxyZfishKaliberEnthält Kalibriertafel und Seitenspiegel
AABT-3D BeobachtungsbehälterxyZfishWürfel 
AABT-3D-Tracking-SoftwarexyZfishv.1.0 
ComputeroptionalN/AWindows XP oder höher
(+)-MK-801 WasserstoffmaleatSigmaM107 
LuftpumpeFusion500 
Luftschlauch 3/16"Lee' s Aquarien- und Heimtierprodukte14508 
Mittlere BindeklammernOfficeDepot561339Zur Befestigung der Fluggesellschaft an einem Beobachtungsbehälter

Referenzen

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