Ein Protokoll für die Phagen-Display-und Affinity Auswahl mit rekombinantem Protein-Köder

Summary

Phagen-Display ist eine leistungsfähige Technik, Proteine ​​oder Proteineinheiten, die mit einem immobilisierten Molekül von Interesse in Wechselwirkung zu erfassen. Sobald eine Entscheidung über die Art der Phagen-cDNA-Bibliothek zu erstellen und zu Bildschirm gemacht worden ist, das hier beschriebene Protokoll ermöglicht eine effiziente Affinitätsselektion, die zu Identifizierung der Interaktionspartner.

Abstract

Verwendung von rekombinanten Phagen als Gerüst, um verschiedene Proteinabschnitte durch eine richtungs klonierten cDNA-Bibliothek zu immobilisierenden Molekülen codiert Köder präsentieren, ist ein effizientes Mittel, um Wechselwirkungen zu entdecken. Die Technik wurde weitgehend verwendet, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu entdecken, sondern der Köder-Molekül in Frage gestellt werden muss nicht auf Proteine ​​beschränkt. Die hier vorgestellten Protokoll optimiert worden, damit eine bescheidene Anzahl von Ködern in Replikaten gescreent werden, um die Identifizierung der unabhängigen Klonen da er das gleiche Protein zu maximieren. Dies ermöglicht eine größere Zuversicht, dass interagierende Proteine ​​identifiziert sind legitime Interaktoren des Köders Molekül. Die Überwachung der Phagen-Titer nach jeder Affinität Auswahlrunde bietet Informationen darüber, wie die Affinitätsselektion voran sowie auf die Wirksamkeit der negativen Kontrollen. Ein Mittel zum Titrieren der Phagen und wie und was zu im Voraus vorzubereiten, damit dieser Prozess so effizient wie Fortschrittemöglich ist, wird dargestellt. Attribute abgerufen Amplikons nach der Isolierung von unabhängigen Plaque werden hervorgehoben, die verwendet werden können, um festzustellen, wie gut die Affinitätsselektion fortgeschritten ist. Fehlerlokalisierungstechniken, Fehlalarme zu minimieren oder zu umgehen anhaltend erholt Phagen werden erläutert. Mittel zur Reduzierung der viralen Kontamination aufflammen werden diskutiert.

Introduction

Warum Phagen-Display-und Affinitätsselektion statt der unzähligen anderen für die Entdeckung und Untersuchung von Protein-Interaktionen mit anderen Molekülen verfügbaren Techniken? Phagen-Display kann einige einzigartige Vorteile gegenüber anderen Verfahren zum Nachweis von Protein-Ligand-Wechselwirkungen ^1-3 einschließlich der folgenden aufweist:

Sehr breite Repertoire der Köder Moleküle

Der wichtigste Grund ist in der Vielfalt der Moleküle wirken kann als Köder in Affinitätsselektion ^4. Phagendisplay ist ein sehr wirksames Mittel zur Isolierung von Protein-Fragmenten, die mit anderen Prote....

Protocol

Eine grafische Darstellung der unter (1) beschriebene Verfahren beschreibt die zwei Hauptkomponenten für die Affinitätsselektion unter Verwendung einer Phagen-Display-Bibliothek: A) eine Phagen-Display-Bibliothek cDNA wahrscheinlich Proteine ​​mit Affinität für den Köder zu kodieren und, b) eine gereinigte rekombinante Köder Protein. Herstellung von Köder (rekombinantes Protein) wurde ausgiebig untersucht und Literatur skizziert Best Practices für die Sicherung von löslichen, aktiven, rekombinanten Protein aus E. coli ^12-13, eukaryotische Hefe ^14, Insekten ^15-16, Pflanzen ^{17-18, 19-20} oder Säugetie....

Results

Die Möglichkeit, die Kapazität des Köders mit Phagen präsentierten Proteinen interagieren (metabolisch Vergiftung der Köder) beeinträchtigen eine starke negative Kontrolle für diese Technik. Es ist auch ratsam, um zu bestimmen, wenn der Köder, wenn sie auf die Mikrotiterplatte gebunden ist, behält seine Funktion. Beide Prüfungen werden das Vertrauen, das die Interaktion, auf Phagen-Proteine ​​durch die nonpoisoned Köder erholt sind legitim zu erhöhen.

Probenahme drei dreifach aus jeder Verti.......

Discussion

Indem das Experiment in drei replizierten Vertiefungen, kann einzeln erfasst Phagen des gleichen Proteins, das an dem Köder zu unterscheiden, selbst wenn sie die gleichen Klon (dh kein Unterschied in der Nukleotidsequenz der CDS-Region, die erfasst worden ist, aber diese haben sich von unabhängigen Brunnen abgerufen). Ansonsten ist der einzige Weg, um unter den gleichen Phagen-Protein-Bindung an den Köder kodiert, zu unterscheiden, ob sie unabhängig voneinander revers transkribiert Regionen, die in einem Teil d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trypton	Becton Dickinson Co.
Hefeextrakt	Becton Dickinson	212750
Agar	Becton Dickinson	214010
Natriumchlorid	Fisher Scientific	BP358-10
Agarose	Research Products International	A20090
Blockierungsreagenz	EMD Chemicals Inc.	69064
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100
Natriumhydroxid	Fisher Scientific	BP359-212
Natriumdodecylsulfat	Fisher Scientific	BP166-500
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-5
Chloroform	Fisher Scientific	BP1145-1
Escherichia coli BLT5403	EMD Chemicals Inc.	BLT5403	Genotyp: F- ompT hsdSB (rB> - mBgal dcm pAR5403 (AmpR)
Ampicillin, Natriumsalz	Forschungsprodukte International	A40040
Ethidiumbromid	Fisher Scientific	BP102-1
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma-Aldrich Corp.	A-9647
Penta-HIS primärer Antikörper	Qiagen Inc.	34660
Ziegen-Anti-Maus-Alkali-Phosphatierungskonjugat	Sigma-Aldrich Corp.	A-5153
para-Nitrophenylphosphat	Sigma-Aldrich Corp.	N-7653
T7-UP Grundierung	EMD Chemicals Inc.		5'-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3'T7-DOWN
Grundierung	EMD Chemicals Inc.		5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'Qiaquick
PCR-Aufreinigungskit	Qiagen Inc.	28104
Qiaquick Gel-Extraktionskit	Qiagen Inc.	28706
Big Dye Terminator v3.1 Zyklus-Sequenzierungskit	Invitrogen Life Technologies	4336917
Heizblock	Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.)	18780
96-Well-Zellkulturplatten	Corning	Costar 3590
Isotemp Inkubator Ofen	Fisher Scientific	516D
Pasteur-Pipetten, 5 ¾ in	Fisher Scientific	13-678-20A
ChromaView Transilluminator	UVP Inc.	TS-15
UV Shield	Oberon	071AF
Handschuhe, Nitril	Fisher Scientific	19-170-010C
Sterile 1,5 ml Röhrchen	USA Scientific Inc	1615-5500
10 ml Borosilikatpipetten	Fisher Scientific	13-678-25E
Borosilikat-Kulturröhrchen	Fisher Scientific	14-961-27
Uniskan I, ELISA-Platten-Reader	Labsystem and Flow Laboratories, Helsinki, Finnland	Typ 362