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Methodenartikel

Ein Protokoll für die Phagen-Display-und Affinity Auswahl mit rekombinantem Protein-Köder

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DOI:

10.3791/50685

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16. Februar 2014

 ,  , 
1Department of Horticulture, University of Kentucky

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Phagen-Display ist eine leistungsfähige Technik, Proteine ​​oder Proteineinheiten, die mit einem immobilisierten Molekül von Interesse in Wechselwirkung zu erfassen. Sobald eine Entscheidung über die Art der Phagen-cDNA-Bibliothek zu erstellen und zu Bildschirm gemacht worden ist, das hier beschriebene Protokoll ermöglicht eine effiziente Affinitätsselektion, die zu Identifizierung der Interaktionspartner.

Zusammenfassung

Verwendung von rekombinanten Phagen als Gerüst, um verschiedene Proteinabschnitte durch eine richtungs klonierten cDNA-Bibliothek zu immobilisierenden Molekülen codiert Köder präsentieren, ist ein effizientes Mittel, um Wechselwirkungen zu entdecken. Die Technik wurde weitgehend verwendet, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu entdecken, sondern der Köder-Molekül in Frage gestellt werden muss nicht auf Proteine ​​beschränkt. Die hier vorgestellten Protokoll optimiert worden, damit eine bescheidene Anzahl von Ködern in Replikaten gescreent werden, um die Identifizierung der unabhängigen Klonen da er das gleiche Protein zu maximieren. Dies ermöglicht eine größere Zuversicht, dass interagierende Proteine ​​identifiziert sind legitime Interaktoren des Köders Molekül. Die Überwachung der Phagen-Titer nach jeder Affinität Auswahlrunde bietet Informationen darüber, wie die Affinitätsselektion voran sowie auf die Wirksamkeit der negativen Kontrollen. Ein Mittel zum Titrieren der Phagen und wie und was zu im Voraus vorzubereiten, damit dieser Prozess so effizient wie Fortschrittemöglich ist, wird dargestellt. Attribute abgerufen Amplikons nach der Isolierung von unabhängigen Plaque werden hervorgehoben, die verwendet werden können, um festzustellen, wie gut die Affinitätsselektion fortgeschritten ist. Fehlerlokalisierungstechniken, Fehlalarme zu minimieren oder zu umgehen anhaltend erholt Phagen werden erläutert. Mittel zur Reduzierung der viralen Kontamination aufflammen werden diskutiert.

Einleitung

Warum Phagen-Display-und Affinitätsselektion statt der unzähligen anderen für die Entdeckung und Untersuchung von Protein-Interaktionen mit anderen Molekülen verfügbaren Techniken? Phagen-Display kann einige einzigartige Vorteile gegenüber anderen Verfahren zum Nachweis von Protein-Ligand-Wechselwirkungen 1-3 einschließlich der folgenden aufweist:

Sehr breite Repertoire der Köder Moleküle

Der wichtigste Grund ist in der Vielfalt der Moleküle wirken kann als Köder in Affinitätsselektion 4. Phagendisplay ist ein sehr wirksames Mittel zur Isolierung von Protein-Fragmenten, die mit anderen Proteinen, Nukleotiden, Kohlenhydrate, etc. 5. Wesentlichen interagieren, wenn ein Polymer / Molekül kann an einen Träger gebunden erzielbaren werden kann, kann zur Affinitäts mit Phagen-Proteine ​​gescreent werden. Zusätzlich kann das Köder-Molekül zugegriffen, um festzustellen, ob es die biologische Aktivität beibehält, wenn sie immobilisiert 6 werden, wenn die Bedingungen verwendet werden, um reduce / eliminieren seine Tätigkeit wirksam sind 6 oder, post-translationale Modifikationen auf den Köder vor der Affinitätsselektion einzuführen.

Phage Widerstand gegen äußere Faktoren

Ein zweiter Grund für die Verwendung von Phagen-Display, ist, dass es möglich ist, dass einige Köder erfordern Umweltstress (Hitze, hohe Konzentrationen Osmolyten, spezifischen Kofaktoren, usw..), Um ihre wechselwirkende Proteine ​​zu erfassen, oder die Phagen-Proteine ​​müssen irgendwie verändert werden vor der Affinitätsselektion. Der primäre Faktor untersucht, ist die Wechselwirkung zwischen Köder und Protein, nicht die Bedingung, dass die Wechselwirkung auftreten können oder wenn es tödlich für den Testorganismus. Die T7-Phagen ist besonders gut geeignet für solche Studien, da es hart experimentellen Bedingungen sowohl intakt und lebensfähig zu widerstehen (z. B. die veröffentlichte thermische Maximum für T7 Lebensfähigkeit ~ 60 ° C 7). Als ein Beispiel des Änderns Phagen proProteine, bei der Prüfung der Arabidopsis thaliana Samen für Proteom-Proteinsubstraten der Reparatur-Enzym, Protein Isoaspartyl Methyl Transferase (PIMT), das Virus in diesen Studien verwendet hatte "gealtert" war für eine Woche vor jeder Affinität Auswahlrunde, um die Einführung zu fördern von isoaspartate (isoAsp) Reste bei empfindlichen Proteine ​​6, die in Organismen, die erkennen und reparieren / verstoffwechseln solche Anomalien nicht möglich ist.

Metabolisch inert

Weiterhin werden die Phagen in der Regel resistent gegen Stoffwechselgiften und störende kleine Moleküle, die, zumindest, führen würde pleiotrope Wirkungen auf metabolisch aktive Testorganismen. Nach den Waschungen Stringenz wird das Gift, bevor eine große Menge von Bakterien zur Infektion eingeführt, das Gift ist auf einen Bereich um die Bakterien harmlos oder nachfolgenden Phagenreplikations verdünnt entfernt. Bei der Untersuchung der Protein-Targets PIMT ReparaturEnzym, S-Adenosylmethionin (AdoMet) wurde verwendet, um die Mikro-Titer-Platten-und immobilisierte Enzym zu aktivieren, um Zielprotein Abfangen zu ermöglichen, während sich auf S-Adenosyl Homocystein (AdoHcy) zur Inaktivierung des Enzyms und bieten eine nützliche Negativkontrolle sichern in das Wissen, dass das Virus nicht durch beider AdoMet oder AdoHcy 6 beeinflusst werden. Zusätzlich Mitglieder bestimmter spätEmbryoGenese Reichlich (LEA) Proteinfamilien, in diesem Labor untersucht, sind dafür bekannt, ihre Form in Gegenwart von Zusätzen wie Sucrose 8, die hohen Konzentrationen von 200 mM in Sojabohnensamen an dem Punkt erreichen kann, zu verändern physiologischer Reife 9. Das Virus wird nicht angenommen, dass durch Zugabe von 200 mM Saccharose in jeder Runde der Affinitätsselektion, möglicherweise für bestimmte LEA-Client-Protein-Wechselwirkungen erforderlich, was nicht der Fall autonom lebensfähigen Testorganismen 10 beeinflusst werden.

Dieses Labor hat sich auf ENTDECKEN konzentriertG-Protein-Protein-Wechselwirkungen in reifen, dehydriert oder keimenden Samen, die den Mechanismus der gespeicherten Proteom Schutz während der Dehydratisierung 11 oder Reparatur von Komponenten des gespeicherten Proteom, die anfällig für isoAsp Bildung sind, wenn das Saatgut aufgesaugt 6 zugrunde liegen. Somit ist die Produktion und Aufreinigung der rekombinanten Proteine ​​als Köder in einem aktiven Zustand erforderlich ist, und sicherzustellen, dass sie so bleiben, bevor und nachdem sie immobilisiert werden, obwohl häufig schwierig ist, ist ein Grundpfeiler unserer Arbeit. Doch wie jedes rekombinante Proteinproduktion Szenario ist anders, die Optimierung der Bedingungen für die Produktion rekombinanter Proteine ​​wird hier nicht angesprochen werden. Die Benutzer werden aufgefordert, zu versuchen, wo immer möglich, zu bestimmen, ob das immobilisierte Protein noch funktionsfähig ist (z. B. wenn es ein Enzym, tun ein Enzym-Assay in den Vertiefungen von Mikrotiterplatten). Dies wird etwas Vertrauen, dass der Köder ist biologisch aktiv und daher, dass alle entdeckten Wechselwirkungenetwas häufiger auf biologische Relevanz haben.

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Protokoll

Eine grafische Darstellung der unter (1) beschriebene Verfahren beschreibt die zwei Hauptkomponenten für die Affinitätsselektion unter Verwendung einer Phagen-Display-Bibliothek: A) eine Phagen-Display-Bibliothek cDNA wahrscheinlich Proteine ​​mit Affinität für den Köder zu kodieren und, b) eine gereinigte rekombinante Köder Protein. Herstellung von Köder (rekombinantes Protein) wurde ausgiebig untersucht und Literatur skizziert Best Practices für die Sicherung von löslichen, aktiven, rekombinanten Protein aus E. coli 12-13, eukaryotische Hefe 14, Insekten 15-16, Pflanzen 17-18, 19-20 oder Säugetierzellen gibt es zuhauf.

In dem folgenden Protokoll, markiert ein hexahistidyl rekombinante Protein hat als Köder verwendet. Dies ermöglicht, dass die Überprüfung Köder-Proteine ​​bleiben in den Brunnen nach Inkubation über Nacht-und Waschschritte.

1. ELISA für rekombinante Proteinbindung in der Mikrotiterplatte Wells

  1. Mark einMikrotiterplatte mit dauerhafter Tinte und bezeichnen die Brunnen werden, welche Proteinkonzentrationen enthalten. Führen Sie diese in 3 Wiederholungen von Brunnen. Fügen Sie 3 Wiederholungen einer Negativkontrolle Konzentrationsreihe (nicht hexahistidyl-markierten Protein; BSA funktioniert gut als diesem Hintergrund Prüfung).
  2. Ausgiebig Waschen Sie die Platte mit Wasser und Wasser zu entfernen durch Schmatzen die Platte umgedreht auf 4 Lagen Küchenpapier zwischen den Waschgängen.
  3. Immobilisieren, in den ersten 3 Vertiefungen in 100 &mgr; l Tris, pH 7,5, (oder Puffer nach Wahl) die höchste Konzentration des rekombinanten Proteins (10 ug / ml). In den nächsten drei Vertiefungen, die das rekombinante Protein bei (1,0 ug / ml), etc., auf 1,0 ng / ml. Machen Sie dasselbe mit der BSA-Konzentration Serie.
  4. Decken Sie Speisen mit Plastikfolie und lassen Sie über Nacht bei 4 ° C
  5. Am nächsten Morgen, entfernen Proteins durch schmatzende Platte auf den Kopf auf 4-5 Schichten Papiertuch.
  6. Brunnen waschen 5x mit 200 ul 1x TBS jeder Zeit, so dass die Pufferin den Vertiefungen ~ 1 min bei jeder und Entfernen der Waschpuffer durch Schmatzen die Platte nach oben auf der Papierhandtücher nach jedem Waschen.
  7. Sperrung der ELISA-Platte auf einem Drehschüttler mit 200 ul 5% (w / v) BSA und 200 &mgr; l 5% (G / V) Blockierungsreagenz in TBS bei Raumtemperatur für 2 h (oder sitzt stationär über Nacht bei 4 ° C bei praktisch ) in Plastikfolie eingewickelt.
  8. Entfernen Sie überschüssiges Blockierungslösung durch Schmatzen die Platte umgedreht auf die Papierhandtücher. Waschen Sie 4x 1 min mit je 200 ul 1x TBS, das Entfernen der Waschlösung durch Schmatzen die Platte auf den Kopf.
  9. Verdünnen Penta-HIS primären Antikörper 1/2, 000 in Blockierungspuffer und liefern 100 ul in jede Vertiefung. Inkubieren 1-2 h bei Raumtemperatur mit der stationären Platte.
  10. Entfernen Sie den primären Antikörper durch Schmatzen die Platte umgedreht auf den Papierhandtücher. Mit 200 &mgr; l 1 × TBST waschen 4x 1 min jedesmal. Entfernen Sie jede Wasch durch Schmatzen die Platte auf den Kopf.
  11. Verdünnen Sie die sekundären Antikörper(Ziegen-Anti-Maus-alkalische Phosphatase-Konjugat) in Blockierungspuffer inkubiert und 100 ul in jede Vertiefung für 1 h bei Raumtemperatur mit der stationären Platte.
  12. Entfernen Sie die sekundäre Antikörper durch Schmatzen die Platte umgedreht auf den Papierhandtücher. Mit 200 &mgr; l 1 × TBST waschen 4x 1 min jedesmal. Entfernen Sie jede Wasch durch Schmatzen die Platte auf den Kopf.
  13. Platz 200 ul von para-Nitrophenylphosphat (pNPP) Substratlösung in jede Vertiefung. Das Substrat ist bei -20 ° C ein Feststoff, so stellen Aliquots und rufen Sie die erforderliche Anzahl von Teilmengen für den Nachweis aus dem Gefrierfach nötig auch vor der Zeit, so ist es vollständig von diesem Zeitpunkt aufgetaut.
  14. Bei 30 min stoppen die Reaktion durch Zugabe von 50 ul 3 M NaOH in jedes Loch.
  15. Die Absorption bei 405 nm sofort auf der ELISA-Plattenlesegerät.

Hinweis: Wenn das rekombinante Protein von Interesse sich nicht in die Vertiefungen legen, ist es möglich, zu verändern thZusammensetzung E / pH des Puffers wesentlich (Carbonat-Puffer, pH 10,0) oder fügen Chaotrope (Harnstoff), um zu versuchen, Protein Bindung an die Vertiefungen von Mikrotiterplatten zu unterstützen. Jedoch die Wiederherstellung, daß das rekombinante Protein: 1) bleibt an der Mikrotiterplatten unter den Bedingungen für die Affinitätsselektion und, 2) behält seine biologische Aktivität nach der Entfernung des hohen pH / Chaotrop empfohlen.

2. Wachsende bakteriellem Wirt (BLT5403) für Titrierung

  1. Autoklav (2A) zehn 250 ml-Erlenmeyerkolben und 3 Kulturröhrchen. Machen LB Flüssigkeit und LB-Agar zum Gießen festen Medien-Platten. Coole LB-Agar bis 50 ° C und fügen Ampicillin bis 100 ug / ml vor aseptisch Gießen in Petrischalen in einem Strömungshaube (Abbildung 2B).
  2. Auch in einem Strömungshaube (2B) Serie ein LB, 100 ug / ml Ampicillin (LB AMP100) Agar-Platte für Einzelkolonien BLT5403 ab Lager in 15% gehalten (v / v)Glycerin bei -80 ° C (Fig. 2C). Zeigen Platte auf den Kopf bei 37 ° C über Nacht in einem Inkubator für Wachstum (2D).
  3. Am Morgen impfen 50 ml LB AMP100 in einem 250 ml-Erlenmeyerkolben mit einer Einzelkolonie von der Platte aufgenommen. Inkubieren bei 37 ° C, 200 rpm in einem Horizontalschüttler (Fig. 2E und 2F), und mit einem Spektrophotometer, um die Zelldichte auf OD600 = 0,5 bis 0,6 (2H) überwachen.
  4. Gießen Sie die Zellen in ein 50 ml-Falcon-Röhrchen oder ähnlich, und halten bei 4 ° C bis zur Verwendung (2G). Die Zellen werden in der Regel lebensfähig bleiben für ca. 1 Woche.
  5. Stellen Sie 500 ml LB, legen Sie sie in einem Schikanefernbach-Kolben und autoklavieren. Sobald es steril ist, wird der Kolben bei 4 ° C (2G) oder bei Raumtemperatur bis zur Nacht des "DAY ONE" unten.

Hinweis: Die bakteriellen WirtszellenBLT5403, eine plasmidgetragenen Quelle des T7 nativen Kapsidprotein ohne die die T7 Mitte und low-copy-Vektoren nicht erfolgreich replizieren exprimieren, sind äußerst anfällig für das Virus. Es ist zwingend notwendig, um eine Kontamination zu vermeiden. Verunreinigungen werden schließlich treten an diesem Punkt alle Oberflächen in Kontakt mit dem Virus / infizierten Bakterien muss mit 70% (v / v) Ethanol abgewischt oder mit Detergens gewaschen (2I) werden. Wenn diese unwirksam ist, ist eine gründliche Dekontamination von allen Oberflächen, die Envirocide (2J) standhalten kann erforderlich. Starten BLT5403 Zellen aus dem Gefrierschrank Bestand jedes neue Runde der Affinitätsselektion zur Linderung Kontamination der Lager in 4 ° C und sorgen kräftige Zellen werden im Protokoll verwendet. Filter Barriere Pipettenspitzen sind unerlässlich.

3. Affinity Auswahl

ONE DAY

  1. Mark eine Mikrotiterplatte mit dauerhafter Tinte und bezeichnen die Brunnen werden die prot enthalteneins / Änderungen. (Aufgrund der Verunreinigung Fragen werden die Platten nicht wiederverwendet). Führen Sie diese in 3 Wiederholungen von Brunnen für jedes Protein und Behandlung.
  2. Ausgiebig Waschen Sie die Platte mit Wasser und Wasser zu entfernen durch Schmatzen die Platte umgedreht auf 4 Lagen Küchenpapier zwischen den Waschgängen. Immobilisieren, in 100 &mgr; l Tris, pH 7,5, (oder Puffer nach Wahl) das rekombinante Protein (10 ug / ml) in sechs Bohrungen oder BSA (10 ug / ml) in drei Vertiefungen, für insgesamt 9 Vertiefungen für die erste Runde der Affinitätsselektion. Decken Gericht mit Plastikfolie und lassen Sie über Nacht bei 4 ° C (2G).
  3. Stellen Sie sicher, dass es 9 x 250 ml-Erlenmeyerkolben (siehe 2.1) gereinigt, autoklaviert und entsprechend gekennzeichnet (Codierung mit farbigen Band gut funktioniert, 2F).
  4. Berechnen des Volumens des Phagen-Lysats für jede Vertiefung auf dem Titer der verwendeten Bibliothek und der Anzahl von Phagen, die gescreent werden, basieren.
  5. Stellen Sie sicher, dass frische BLT5403 Zellen sind gebrauchsfertigTitern für diese Affinität Auswahlrunde morgen (3A).
  6. Ausreichende 1x TBS (150 mM NaCl, 50 mM Tris-Base, pH 7,6) und TTBS 1x (1x TBS + 0,05% (v / v) Tween 20) sind 10 × 200 &mgr; l Waschanlagen für die Anzahl von Vertiefungen verwendet führen . Zusätzlich vorinkubiert die TTBS an der Affinitätsselektion Temperatur. Stellen Sie sicher, dass eine Sicherung, versiegelt, 50 ml Falcon-Röhrchen aus 1x TTBS an der Affinitätsselektion Temperatur mit ausreichender 1x TTBS existiert.
  7. Bereiten Sie 3 Behandlungen x 3 Wiederholungen x 3 dreifach von 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen (27 gesamt) mit 990 ul jeder LB 100 AMP und entsprechend zu kennzeichnen (z. B. 10 -2). Diese sind für die infizierten Bakterien aus den Vertiefungen von Mikrotiterplatten abgerufen morgen. Markieren der Verdünnung auf einer Seite des Rohres (10 -2) und einer aufsteigenden Reihe auf der anderen Seite ("1"). Für jedes Eppendorf-Röhrchen, auch beschriften ein Borosilikat-Rohr und ein LB 100 AMP Platte. In diesem way, die Platten und Borosilikat Reagenzgläser werden mit 1, 2, 3, 4, 5, usw.. zu machen Titerung schneller gehen. Danach kann die einfache Zahl der Verdünnung und der Behandlung auf dem Eppendorf-Röhrchen angepasst werden (z. B. # 12 Rohr war die dritte dreifach der ersten Replikation des BSA-Verdünnungssteuerung für 10 -5). Shop Eppendorf-Röhrchen und LB 100 AMP Platten über Nacht bei 4 ° C (Abb. 2G und 3B).

Zum Beispiel: Starten Beschriftung 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen für 10 -2 drei Verdünnungen von Phagen aus der BSA-Replikation sowie einen 1, 2 und 3 (drei Dreifachwerte von Phagen-Titer für die Replikation eins), und markieren Borosilikat Teströhrchen 1, 2 und 3, in dem die infizierten Bakterien wird mit nicht-infizierten Bakterien und Top-Agarose vor dem Gießen auf LB-Agarplatten AMP 100 (Fig. 3C) gemischt werden.

  1. Für die serielle dilutions, Label-und Eppendorf-Röhrchen, jedem, fügen Sie 900 ul LB 100 AMP. Sobald die ersten Verdünnungen (10 -2) der infizierten Bakterien werden für jedes Protein / Behandlung, Replikation und dreifach, morgen hergestellt, werden sie gut gemischt und 100 ul von ihnen aufgenommen und in den entsprechenden Eppendorf-Röhrchen mit 900 &mgr; l LB-100 hinzugefügt AMP für die 10 -3-Verdünnung (Rohre 4, 5 und 6 für die Replikation einer BSA-Kontrolle). (9 7, 8) und diese werden ihrerseits gemischt werden und die 10 -3 Verdünnung verwendet werden, um die 10 -4-Verdünnungen zu machen. Mit den 10 -4 Verdünnungen für die 10 -5 Verdünnungen (10, 11, 12), usw. um den Titer der ersten der drei BSA Replikationen (wells) erhalten.
  2. Das gleiche wird für die BSA-Replikation zwei durchgeführt werden (auch 2), BSA-Replikation drei (auch 3), die drei Wiederholungen des vergifteten Köder und schließlich die drei Wiederholungen der Köderbrunnen. Am Ende sollte es Rohre f markiert seinrom 1-135 (135 ist die letzte dreifacher Ausfertigung der letzten Replikation der Köder bei der maximalen Verdünnung von 10 -6). Diese Eppendorf-Röhrchen über Nacht lagern bei 4 ° C (Fig. 3C zeigt die Eppendorf und Borosilikatröhrchen für alle Verdünnungen der Triplikaten der drei Wiederholungen (die drei Vertiefungen) BSA.
  3. Start 2 oder 3 Kulturröhrchen BLT5403 Zellen (von Einzelkolonien von einer frisch ausgestrichenen LB über Nacht AMP100 Platte aufgenommen, von Schritt 2.2) wächst in der Inkubation Schüttler (2E und 2F) als eine Nacht-Kultur. Um die 500 ml LB (Punkt 2.5 oben), fügen Ampicillin bis 100 ug / ml und legen Sie die Fernbach-Kolben in der Klemme im Schüttelinkubator so wird es bei 37 ° C sein und belüftet den folgenden Morgen (2F).

Hinweis: Runde drei und vier ungefähre Verdünnungen von bis zu 10 -10 Volumen erfordern phage, um die Lautstärke der LB AMP100.

TAG ZWEI

  1. Am nächsten Morgen, legen Sie die autoklaviert, leere 9 x 250 ml-Erlenmeyerkolben (eine für jede Mikrotiterplatte) in den Klammern in der Inkubation Shaker. Impfen der 500 ml LB 100 AMP mit 500 ul von einer der-Nacht-Kulturen von Zellen BLT5403 begann gestern Abend (siehe Schritt 3.8 oben), wieder zu verschließen und starten Sie es wächst (37 ° C, 220 rpm). Schalten Sie das Spektralphotometer (2H) und stellen Sie es auf die Absorption bei 600 nm gelesen.
  2. Entfernen Sie die Mikrotiterplatte von 4 ° C, entfernen Sie die Kunststoff-Folie, und entfernen Sie das ungebundene Protein von der Platte durch Waschen mit 200 ul 10x jedes Mal von 1x TBS pH 7,5 und Schmatzen die Platte umgedreht auf dem Papiertuch zwischen Wäschen. Block mit 200 ul 5% (w / v) BSA und 200 &mgr; l 5% (G / V) Blockierungsreagenz in TBS für 1 h (oder über Nacht, wenn bequem) mit der Platte in Plastikfolie eingewickelt.
  3. Waschen Sie die Sperr solution 10x mit 200 ul jedes Mal von 1x TBST, Schmatzen die Platte umgedreht auf 4 Lagen Küchenpapier zwischen den Waschgängen. Es ist möglich, die Vertiefungen mit 200 ul Wasser in diesem Stadium zu füllen, decken Sie sie mit Plastikfolie und legen Sie sie bei 4 ° C für maximal 1 Woche zu speichern.

Hinweis: Starten Sie die Kultur bald genug, dass durch die Zeit, die Phagen-infizierten BLT5403 von der Fertigstellung der Affinitätsselektion bereit sind, hinzuzufügen, die Zellen in den 500 ml sind zwischen 0,6 und 1,0 OD 600. Wenn sie weit über 1,0 wachsen, kann die Lyse nicht aufgrund von Ressourcenbeschränkungen auftreten, wie Zellen nähern stationären Phase. Wenn die Zellen eine OD 600 von 0,6 zumindest vor der Einführung des Phagen nicht erreichen, kann die Multiplizität der Infektion zu hoch sein, schnell die Zellen abzutöten, die die Darstellung des Lysats beeinflussen können. Wenn die Zellen noch nicht näher eine OD 600 von 0,6 mit der Beendigung der Affinitätsselektion, inokulate der Kolben mit BLT5403 aus der zweiten (oder auch von beiden zweiten und dritten) Teströhrchen bei 37 º C (Fig. 2F) Schütteln. Wenn eine OD 600 von 1,0 zu schnell nähert, schalten Sie die Heizung und den Shaker und den Deckel öffnen, um die Kultur zu kühlen und verhungern die Bakterien Sauerstoff. Wieder aufzunehmen Heizung / einmal Phagen Schütteln wurden hinzugefügt.

Von hier verwenden Filterbarriere Tipps, um Phagen Kreuzkontamination zu vermeiden.

  1. Sobald der Kolben wird geimpft, legen Sie die Phagen-Bibliothek (100 ul) in mit den Proteinen, verschließen Sie die Platte mit Plastikfolie und bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
  2. Bei 55 min, notieren Sie die OD 600 der Zellen. Die Verdopplungszeit ist etwa alle 20 min. Gesetz entsprechend (siehe "Hinweis" oben).
  3. Am Ende einer Stunde entfernen Sie die Plastikfolie von der Platte und sofort durch Ausschütteln des Phagen in das verwandelt Abfall und dann schnell Zugabe von 200 ul 1x TB waschenST. (Verwenden Sie ein multipipettor mit 1 = 100 ul Kopf und die Pipette auf Set 2 [dh liefert 200 ul / Kolben Depression] für diese und es schnell geht). Stellen Sie einen Timer für 1 min. Nach 1 min, schütteln Puffer in verwandelt Abfall, klatschen Platte auf den Kopf auf Papiertuch und legen Sie wieder auf der Bank (25 ° C-Platte). Wiederholen Sie die Schritte 10x Waschen.
  4. Nach dem 10. Wäsche, nehmen 200 ul BLT5403 Zellen aus der 50 ml-Falcon-Röhrchen bei 4 ° C und steckte sie in den Boden der Brunnen, aus dem die letzte Wäsche von TTBS entfernt wurde. Wickeln Sie die Platten in der Plastikverpackung und bei 37 ° C für 20 min gestellt, jede Phagen noch auf den Köder, um die Bakterien zu infizieren, stecken (siehe Hinweis in der Diskussion über die anhaltend abgerufen Phagen-und / oder Hoch Hintergrund aus wahllos bindenden Phagen).
  5. Am Ende der 20 Minuten, packen die Platten und nehmen 10 ul Bakterien aus dem BSA bei 25 ° C die Replikation ein und legen Sie es in den 990 ul LB 100 AMP markiert"1". Zweimal wiederholen mehr für diesen Schacht (Rohre 2 und 3), was 3 Triplikaten von 1/100 Verdünnungen der Phagen aus diesen auch. Dies ist ein BSA-Replikation dreimal abgetastet. Diese Verdünnungen werden verwendet, um die mittlere Titer ± SEM für die Replikation von BSA zu schätzen.
  6. Machen Sie dasselbe für die Replikation 2 und 3 des BSA (drei dreifachen Proben von je 10 ul), für die drei replizierten Vertiefungen der vergifteten Köder-Protein und für den Köder-Protein. Setzen Sie diese 27 Eppendorf-Röhrchen zur Seite und bekommen die restlichen 170 ul der infizierten Bakterien in den Vertiefungen wachsende Richtung Lyse.
  7. Wenn die Bakterien in dem Kolben wird bei OD 600 = 0,6-1,0, dekantiert 50 ml Zellen aus der Fernbach-Kolben in jeder der neun 250-ml-Erlenmeyerkolben. Nehmen Sie die restlichen 170 ul des Phagen-infizierten BLT5403 Bakterien in der BSA-Replikation ein gut und es zu den 50 ml Zellen mit "BSA Rep 1" (gelbe Band) hinzufügen. Tun Sie dies für alle neun Brunnen und legte sie Schütteln im Inkubator ( 2F).
  8. Überwachung der Zellen in 37 ° C-Schüttler inkubiert, von Zeit zu Zeit für die Lyse (etwa 3 Stunden von der Zeit der Inokulation). Nehmen Sie die Verdünnungen aus den 27 ersten Verdünnungen (10 -2) in die entsprechenden, beschriftet Eppendorf-Röhrchen während dieser Zeit.
  9. Um diese Verdünnungen von den ersten 27 Verdünnungen von 3.12 durchzuführen, nehmen Sie 100 ul der LB mit Bakterien aus Eppendorf-Röhrchen 1 (BSA Replikation ein, zuerst der dreifachen Proben aus dieser Verdünnung 1/100 davon auch) und an die ADD 900 ul LB in Eppendorf-Röhrchen 4 (1 x 10 -4-Verdünnung von BSA Replikation ein, zuerst der Dreifachproben von dieser gut).
  10. Entsorgen Sie die Filterbarriere Tipp für eine neue, bevor man 100 ul der LB mit Bakterien aus Eppendorf-Röhrchen 4 bis zu den 900 ul LB in Eppendorf-Röhrchen 7 (1 x 10 -5 Verdünnung der BSA-Replikation ein, zuerst der dreifach hinzufügen Proben aus dieser gut). Fortsetzung der Verdünnungen (deigenen bis 1 x 10 -6) für alle Triplikaten aller Replikationen aller Proteine ​​und Behandlungen (135 Rohre insgesamt).
  11. Sobald die Zellen lysiert, bringen die Kultur auf 0,5 M NaCl durch Zugabe von 5 ml einer 5 M NaCl Lager und Transfer zu einem markierten Zentrifugenflasche.
  12. Zentrifugieren bei 8000 × g für 10 min bei 4 ° C. Dekantieren Stand (Virus) in einen sauberen, sterilen 50 ml-Falcon-Röhrchen.
  13. Fügen Sie ein paar Tropfen Chloroform zu der Überstand dekantiert, in der Falcon-Röhrchen.
  14. Lagerung bei 4 ° C für die nächste Runde der Affinitätsselektion.

4. Tag drei

  1. Autoklaven oder bleichen alle Laborgeräte, die bei der Erzeugung dieses Affinität Auswahlrunde verwendet worden ist, um für die nächste Runde vorzubereiten.

5. Titrierung

  1. Anzahl, wie viele feste LB 100 AMP Platten, da es Verdünnungen in aufsteigender Reihenfolge (es sollte jetzt ein Teller für jeden Borosilikatröhrchen und Eppendorf-Röhrchen, die jeweils mit der gleichen Anzahl sein). Put die Platten in der 37 ° C-Inkubator (Fig. 3D).
  2. Melt-Top-Agarose (1,0 g Bacto Trypton, 0,5 g Hefeextrakt, 0,5 g NaCl, 0,6 g Agarose, machen bis 100 ml, Autoklav) durch Lösen der Top-Agarose Flasche und abwechselnd die Mikrowelle die Flasche und wirbeln sie zu mischen, bis die Oberseite Agarose vollständig geschmolzen ist. Legen Sie die Flasche im Wasserbad auf 50 ° C (3E) abkühlen.
  3. Nehmen Sie ein Borosilikat 10 ml Pipette mit einer Pipette Pumpe angebracht. Zünden Sie eine Bunsenbrenner. Schalten Sie ein Styropor Falcon Rohrhalter oder Kühler Deckel auf den Kopf auf die Bank und legen Sie die LB100 AMP Platten 1 bis 6 (frisch aus dem 37 ° C-Inkubator) darauf obersten Plate 1 (Abbildung 4A). Das Styropor hält die Platten warm.
  4. Setzen Sie 250 ul BLT5403 Zellen von 4 ° C in jede der nummerierten Borosilikat Reagenzgläser am ersten Tag oben hergestellt (Abschnitt 3.7 und Fakten 4B und 4C). Arreichen die nummerierten Borosilikatröhrchen in der gleichen Reihe wie die aufsteigenden Verdünnungen in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen (4A).
  5. Setzen Sie 100 ul von der Verdünnung in ein Eppendorf-Röhrchen in den 250 ul Zellen in Borosilikat Reagenzglas 1 (Abb. 4D und 4E). Heizen Sie den ersten 5 in der Pipette über der Flamme ein wenig (nicht zu viel! ~ 3 Seitenhiebe, 4F) und tauchen Sie in die geschmolzene Top-Agarose. Ziehen Sie 3 ml und liefern schnell in das Reagenzglas auf der Zellen / Phagen (4G).
  6. Mix von schnippte mit dem Finger, während das Rohr mit der anderen Hand (4H) halten und den Inhalt auf der Platte (Abb. 4E). Kippen Sie die Platte und verwenden Sie das Reagenzglas Blasen und trockene Stellen zu jagen, bis die ganze Platte wird von der Top-Agarose bedeckt. Legen Sie sie beiseite, aufrecht auf der Bank abkühlen.
  7. Entsorgen Sie die Borosilikatröhrchen, werfen Sie die Filterbarriere Spitze, erhalten einefrische und weiter, bis alle Verdünnungen wurden vergoldet. Abrufen LB AMP-Platten 100 aus dem Inkubator, wenn sie nicht mehr als 6 zu einer Zeit aufgebraucht werden oder aber sie abkühlen, und der Top-Agarose zu schnell erstarrt.
  8. Nachdem die Top-Agarose ist solide, drehen die Platten auf den Kopf (es ist wichtig, dies zu tun). Andernfalls wird der Agar / Agarose "weint", kondensiert auf dem Deckel, fällt auf der Top-Agarose und läuft über sie, unter den Phagen mit ihm macht es unmöglich, genau Titer) und entweder: 1) legte die Platten in den 37 ° C-Inkubator [zurück 4 Stunden später, um den Titer zählen als T7 ist aggressiv] ODER: 2) Lassen Sie sie den Kopf auf die Bank und sie bereit sind, um am nächsten Morgen Titer zählen.
  9. Nimmt man alle notwendigen Vorkehrungen zum Schutz vor Bruches oder Verletzungen, wenn es nicht, setzen Sie die Top-Agarose-Flasche Kappe wieder auf lose-und Mikrowellen der Top-Agarose, bis es kocht. Tun Sie dies zweimal. Abkühlen lassen, ziehen dieKappe und legte es weg. Schalten Sie das Wasserbad bis auf die üblichen Temperatur oder schalten Sie es. Setzen Sie die Verdünnungen in der 4 ° C Kühlschrank. Sie werden benötigt, um die Titer zu interpretieren und / oder Redo einige der Titrierung.

6. Ermittlung und Berechnung der Titer

  1. Untersuchen Sie die auf den Platten gebildet Plaque und entsorgen die mit konfluenten Lyse (5A zB 10 -2 Verdünnung). Bestimmen Sie, welche der verbleibenden serielle Verdünnungen ausreichend paar Plaque produziert haben, um eine genaue Tally (nd den 5A 5B) zu ermöglichen. Notieren Sie die Anzahl der Plaque von diesen Platten (Tabelle 1, Abbildung 5B).
  2. Multiplizieren die Anzahl der Plaque von der Verdünnung und multipliziert diese Zahl durch 100, die Anzahl der Plaque-bildenden Einheiten pro ml der infizierten Bakterien aus den Vertiefungen (erhalten taken dh nur 10 &mgr; l der infizierten Bakterien wurden für jedes der Dreifach und s genommeno dies muss mit 100 multipliziert werden, um Zählungen pro ml) zu erhalten. Durchschnittlich die Anzahl der Plaque-bildenden Einheiten (PFU) pro Milliliter (PFU / ml unverdünnter infizierten Bakterien aus der Mikrotiterplatte gut gemacht), über die drei dreifach von diesem gut gemacht.
  3. Bilden Sie ein Grand-Durchschnitt der Zählungen für die drei Wiederholungsvertiefungen und die Berechnung der Standardfehler des Mittelwerts (Tabelle 1). Dies ist, was in der Figur der Erhöhung Phagen-Titer für jede Runde der Affinitätsselektion und Behandlung (Fig. 5C) aufgezeichnet werden.

7. Plaque-Isolierung, PCR und Sequenzierung

  1. Am Ende der Affinitätsselektion Runde 4, wählen Sie 18 einzelne, genau definierte, Plaque und Kolonien, mit einer sterilen Pasteur-Pipette, Zahnstocher, gelben Pipettenspitze oder einem ähnlichen Gerät, Kern diese Plaque von den Titerung Platten. Bei der Verwendung von Rohren oder Tipps, zuerst nass das innen mit dem Tris-HCl, pH 8,5, in der Eppendorf-Röhrchen (5D).
  2. Bei Verwendung von Rohren, sicherzustellen, dass die Borosilikatröhrchen hält keine überschüssige Tropfen Tris, die Birne zu drücken und mit ihm noch zusammengedrückt wird, drücken Sie die Borosilikat Pipettenspitze durch einen gut isolierten Plaque Recht auf die Kunststoff-Petrischale unten (Abb. 5E). Lassen Sie die Lampe mit der Pipettenspitze noch in der Agar / Top-Agarose und saugen den Kern (5F, siehe Pfeil).
  3. Vertreibt den Kern in 100 ul Tris-HCl, pH 8,5, in der entsprechenden Rohr (5G) und kurz vortexen.
  4. Erhitzen Sie 20 ul von diesem Volumen bei 65 ° C für 10 min.
  5. Zentrifugieren des erhitzten Volumens bei 13.000 × g in einer Tischzentrifuge bei Raumtemperatur für 10 min. Nehmen 3 ul aus dem Überstand dieser Aliquot in PCR-Reaktionen mit T7 und T7-UP-DOWN-Primer verwendet werden.
  6. Für jede der 18 isolierten Plaque, erwärmten Lösungen, machen Sie eine 50 ul PCR-Reaktion unter Verwendung eines Annealing-Temperatur von 58 ° C und 35 Zyklen.
  7. Führen Sie 20 ul each Reaktion auf einem 1% (w / v) Agarose-Gel, enthaltend 0,015% (v / v) Ethidiumbromid. Visualisieren Sie mit einem Transilluminator mit geeigneten Augenschutz und Handschuhe Nitril Labor. (ACHTUNG: Ethidiumbromid ist ein starkes Mutagen.) Fotografieren Sie das Gel und Entsorgung von kontaminiertem Material richtig (6A und 6B).
  8. Wenn die Amplikons sind einzelne Produkte, und nicht aus einem leeren Vektor (Produkt läuft in der Nähe von 100 bp auf einem 1% (w / v) TAE-Agarose-Gel, 6A und 6B Pfeile), reinigen Sie die restlichen 30 ul für die Verwendung als Sequenzierung Vorlage. Wenn nicht ein einziges Produkt auf dem Gel (6B, Plaque 15), schneiden Sie die prominenteste Band (e) aus dem Gel und extrahieren die DNA aus dem Gel mit einem Kit.
  9. Reihenfolge die Amplikons, die nicht leer sind Vektoren unter Verwendung der T7-UP Grundierung.
  10. Untersuchen jeder Sequenz der Linker-Arme, und aus dieser Information bestimmen, wo der Beginn des Einsatzes befindet. Verwenden Sie die Basic Local Alignment Search Tool (BLAST, die National Library of Medicine), um die Identität der kodierten cDNA zu bestimmen, ob der Einsatz in dem Rahmen, und wenn ja, was ist Teil der Protein-kodierende Sequenz (CDS), die durch die angezeigt wurden und gefangen Köder.

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Ergebnisse

Die Möglichkeit, die Kapazität des Köders mit Phagen präsentierten Proteinen interagieren (metabolisch Vergiftung der Köder) beeinträchtigen eine starke negative Kontrolle für diese Technik. Es ist auch ratsam, um zu bestimmen, wenn der Köder, wenn sie auf die Mikrotiterplatte gebunden ist, behält seine Funktion. Beide Prüfungen werden das Vertrauen, das die Interaktion, auf Phagen-Proteine ​​durch die nonpoisoned Köder erholt sind legitim zu erhöhen.

Probenahme drei dreifach aus jeder Verti...

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Diskussion

Indem das Experiment in drei replizierten Vertiefungen, kann einzeln erfasst Phagen des gleichen Proteins, das an dem Köder zu unterscheiden, selbst wenn sie die gleichen Klon (dh kein Unterschied in der Nukleotidsequenz der CDS-Region, die erfasst worden ist, aber diese haben sich von unabhängigen Brunnen abgerufen). Ansonsten ist der einzige Weg, um unter den gleichen Phagen-Protein-Bindung an den Köder kodiert, zu unterscheiden, ob sie unabhängig voneinander revers transkribiert Regionen, die in einem Teil d...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Hatch, McIntire-Stennis (AD421 CRIS), USDA Seed Grant (2011 bis 04375) und Sir Frederick McMaster-Forschungsstipendium, um ABD; Dieses Projekt wurde teilweise durch einen NSF IOS (0849230) gefördert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
TryptonBecton Dickinson Co.
HefeextraktBecton Dickinson212750
AgarBecton Dickinson214010
NatriumchloridFisher ScientificBP358-10
AgaroseResearch Products InternationalA20090
BlockierungsreagenzEMD Chemicals Inc.69064
Tween 20Fisher ScientificBP337-100
NatriumhydroxidFisher ScientificBP359-212
NatriumdodecylsulfatFisher ScientificBP166-500
Tris BaseFisher ScientificBP152-5
ChloroformFisher ScientificBP1145-1
Escherichia coli BLT5403EMD Chemicals Inc.BLT5403Genotyp: F- ompT hsdSB (rB> - mBgal dcm pAR5403 (AmpR)
Ampicillin, NatriumsalzForschungsprodukte InternationalA40040
EthidiumbromidFisher ScientificBP102-1
Rinderserumalbumin (BSA)Sigma-Aldrich Corp.A-9647
Penta-HIS primärer AntikörperQiagen Inc.34660
Ziegen-Anti-Maus-Alkali-PhosphatierungskonjugatSigma-Aldrich Corp.A-5153
para-NitrophenylphosphatSigma-Aldrich Corp.N-7653
T7-UP GrundierungEMD Chemicals Inc.5'-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3'T7-DOWN
GrundierungEMD Chemicals Inc.5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'Qiaquick
PCR-AufreinigungskitQiagen Inc.28104
Qiaquick Gel-Extraktionskit Qiagen Inc.28706
Big Dye Terminator v3.1 Zyklus-SequenzierungskitInvitrogen Life Technologies4336917
HeizblockPierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.)18780
96-Well-ZellkulturplattenCorningCostar 3590
Isotemp Inkubator OfenFisher Scientific516D
Pasteur-Pipetten, 5 ¾ inFisher Scientific13-678-20A
ChromaView TransilluminatorUVP Inc.TS-15
UV ShieldOberon071AF
Handschuhe, NitrilFisher Scientific19-170-010C
Sterile 1,5 ml RöhrchenUSA Scientific Inc1615-5500
10 ml BorosilikatpipettenFisher Scientific13-678-25E
Borosilikat-KulturröhrchenFisher Scientific14-961-27
Uniskan I, ELISA-Platten-ReaderLabsystem and Flow Laboratories, Helsinki, FinnlandTyp 362
211705

Referenzen

  1. Georgieva, Y., Konthur, Z. Design and screening of M13 phage display cDNA libraries. Molecules. 16, 1667-1681 (2011).
  2. Beghetto, E., Gargano, N. Lambda-display: a powerful tool for antigen discovery. Molecules. 16, 3089-3105 (2011).
  3. Li, W. ORF phage display to identify cellular proteins with different functions. Methods. 58, 2-9 (2012).
  4. Willats, W. G. Phage display: practicalities and prospects. Plant Mol. Biol. 50, 837-854 (2002).
  5. Konthur, Z., Crameri, R. High-throughput applications of phage display in proteomic analyses. Targets. 2, 261-270 (2003).
  6. Chen, T., et al. Substrates of the Arabidopsis thaliana protein isoaspartyl methyltransferase 1 identified using phage display and biopanning. J. Biol. Chem. 285, 37281-37292 (2010).
  7. Jung, S., Honegger, A., Pluckthun, A. Selection for improved protein stability by phage display. J. Mol. Biol. 294, 163-180 (1999).
  8. Battaglia, M., Olvera-Carrillo, Y., Garciarrubio, A., Campos, F. The enigmatic LEA proteins and other hydrophilins. Plant Physiol. 148, 6-24 (2008).
  9. Egli, D. B., Bruening, W. P. Source-sink relationships, seed sucrose levels and seed growth rates in soybean. Ann. Botany. 88, 235-242 (2001).
  10. Badotti, F., et al. Switching the mode of sucrose utilization by Saccharomyces cerevisiae. Microb. Cell Fact. 7, 4 (2008).
  11. Kushwaha, R., Lloyd, T. D., Schafermeyer, K. R., Kumar, S., Downie, A. B. Identification of Late Embryogenesis Abundant (LEA) Protein Putative Interactors Using Phage Display. Int. J. Mol. Sci. 13, 6582-6603 (2012).
  12. Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli. Microb. Cell Fact. 4, 2859 (2005).
  13. Gasser, B., et al. Protein folding and conformational stress in microbial cells producing recombinant proteins: a host comparative overview. Microb. Cell Fact. 7, 11 (2008).
  14. Daly, R., Hearn, M. T. W. Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production. J. Mol. Recognit. 18, 119-138 (1002).
  15. Davis, T. R., et al. Comparative recombinant protein production of eight insect cell lines. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 29, 388-390 (1993).
  16. Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).
  17. Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 4730-4735 (2007).
  18. Popescu, S. C., Snyder, M., Dinesh-Kumar, S. Arabidopsis protein microarrays for the high-throughput identification of protein-protein interactions. Plant Signal Behav. 2, 416-420 (2007).
  19. Al-Fageeh, M. B., Marchant, R. J., Carden, M. J., Smales, C. M. The cold-shock response in cultured mammalian cells: Harnessing the response for the improvement of recombinant protein production. Biotechnol. Bioeng. 93, 829-835 (2006).
  20. Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat. Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).

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