Die zunehmende Verwendung von Zebrafisch als Tiermodell erfordert die Entwicklung effektiver Methoden für die Lieferung von bekannten Mengen von Verbindungen und Lösungen. Die Magensonde unten beschriebene Verfahren ermöglicht die orale Verabreichung von genauen Volumina der Lösung zuverlässig, sicher und effizient zu erwachsenen Zebrafisch.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Der Zebrafisch ist zu einem wichtigen in vivo-Modell in der biomedizinischen Forschung. Effektive Methoden müssen entwickelt und verwendet werden, um Verbindungen oder Mittel in Lösungen für die wissenschaftliche Forschung zu liefern. Aktuelle Methoden zur Verabreichung von Verbindungen oral erwachsenen Zebrafisch sind ungenau wegen Variabilität in freiwilligen Verbrauch von den Fischen. Eine Magensonde Verfahren wurde entwickelt, um präzise Mengen von Infektionserregern zu liefern für das Studium in der biomedizinischen Forschung Zebrafisch. Adult Zebrafisch über 6 Monate alt waren betäubt mit 150 mg / l gepuffert MS-222 und eine Sonde mit 5 ul-Lösung mit flexiblen Katheter-Implantation Schlauch an einem Schnitt 22-G-Nadel Spitze. Der Schlauch wurde in die Mundhöhle des Zebrafisch abgesenkt, bis die Spitze des Schlauches verlängert an den Kiemen (etwa 1 cm). Die Lösung wurde anschließend langsam in den Darmtrakt injiziert. Diese Methode wirksam war 88% der Zeit, mit Fisch erholt ereignislos. DieseVerfahren ist auch effizient, wie eine Person 20-30 Fisch in einer Stunde eine Magensonde. Diese Methode kann verwendet werden, um genau zu verwalten Agenten für Infektionskrankheiten Untersuchungen oder aus Untersuchungen von anderen Verbindungen in erwachsenen Zebrafisch werden.
Einleitung
Aktuelle Methoden zur Verabreichung von Verbindungen oral Zebrafisch umfassen Verabreichung von Verbindungen top-Beschichtung auf Futtermittel, gemischt in Gelatine Diäten 1. bioencapsulated in Salzlösunggarnele 2, gemischt mit Lipid verkapselten Diäten 3, Wachs Spray Perlen 4 und über Gluten-basierte Ernährung. 5 Einschränkungen der diese Methoden der oralen Verabreichung umfassen hohe Auslaugraten und unvollständiger oder unvorhersehbare Verbindung Verbrauch für die einzelnen Fische. Diese Variablen sind problematisch, weil im Bereich der Infektionskrankheiten Studien, wohl wissend, die infektiöse Dosis verabreicht, um den Fisch kann entscheidend sein für das Studium Erfolg. Auch hat früheren Arbeiten gezeigt, dass bestimmte Verbindungen in Wasser Bäder verabreicht toxisch Läsion führen zu Kiemen, bevor die intestinale Wirkungen, die unter Studie sein kann auftreten Zebrafisch. 6
Gavage ist ein Standard-Verfahren in anderen Labor Tierarten verwendet werden, um präzise Mengen eines Produktes mit ak verwaltennown Konzentration für das Studium in der biomedizinischen und pharmazeutischen Forschung. Erst vor kurzem haben Methoden zur gavaging Zebrafisch wurde in der Literatur beschrieben. Eine Technik beschrieben ist ein Zwei-Personen-Verfahren unter Verwendung einer 24-G Katheterhülle an einem 2-20 ul Pipette bis 5 ul Lösung zu liefern. 7 Das beschriebene Verfahren hatte eine Sterblichkeitsrate von 8,7% und 39% auf dem ersten und zweiten Studie sind; die meisten der Sterblichkeit wurde trächtige Weibchen zugeschrieben. Die zweite Sonde beschriebene Technik verwendet stumpfen Sonde Spritzen bis 5 ul Lösung Medakas (Oryzias latipes). 8 Informationen zu Sterblichkeit wurde nicht zur Verfügung gestellt und den genauen Prozess der Durchführung der Magensonde wurde nicht beschrieben verwalten. Nach Angaben der kanadischen Rates über Animal Care und dem Labor Zebrafisch, bis zu 1% des Fisches Körpergewicht kann über eine Magensonde verabreicht werden. 9,10 Unser Ziel war es, eine reproduzierbare, sichere und effiziente Methode der Bereitstellung von genauen Volumina von com entwickelnPfund oral erwachsenen Zebrafisch von beiden Geschlechtern und in allen Phasen der Reproduktion. Dieses Verfahren anwendbar wäre für jede Studie, in der genaue oraler Gabe einer Verbindung erforderlich ist.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
1. Vorbereiten des Betäubungsmittel-Lösung
- Bereiten Sie eine Lösung von 150 mg / L von MS-222 in System Wasser entweder aus einer Stammlösung oder aus der Pulverform.
- Überprüfen Sie den pH-Wert mit einem pH-Meter.
- Puffer mit Natriumbicarbonat wie nötig, bis der pH-Wert zwischen 7-7,5.
- Bereiten Sie einen Behälter des Systems Wasser frei von MS-222 für die Fische zu erholen in. die Recovery-Zeit ist in der Regel weniger als 1 min.
2. Vorbereiten des Gavage Vorrichtung
- Schneiden Sie die klaren 22-G Implantation Schlauch an ein wenig mehr als ungefähre Länge von der Mündung bis zur Darm-Glühlampe der Fische. Zunächst empfehlen wir anesthetizing einen Fisch für jede neue Gruppe genutzt, um die bestmögliche Schätzung der Länge brauchte.
- Stecken Sie das abgeschnittene klare Implantation Schlauch auf der ½-Zoll 22-G-Nadel bis es sicher ist und es besteht keine Gefahr des Abnehmens. Wenn ein 22 ½-C Nadel nicht verfügbar ist, schneiden eine längere Nadel Approximately dass Länge.
- Wenn Sie fertig sind, sollte der Katheter-Implantation Schlauch etwa 1 cm von der Spitze der Nadel, oder kürzer, wenn die Fische kleiner sind verlängern.
- Bringen Sie die 22-G-Nadel-Hub zu einem 1-cc luerlok Spritze.
3. Vorbereitung für Gavage
- Schneiden Sie eine Nut in einem Schwamm mit einem Skalpell.
- Genießen Sie den Schwamm in Wasser-System frei von MS-222.
- Setzen Sie den angefeuchteten Schwamm auf einer ebenen Fläche.
- Erarbeiten die geeigneten 5 ul Lösung für eine Magensonde in den 22-G-Katheter-Schlauch und einer 1-ml-Spritze.
4. Anästhesie und Gavage
- Schnell die Fische mindestens 24 Stunden vor dem Eingriff.
- Den Fisch in der MS-222-Lösung, bis es seine Aufrichtungsreflexes verliert und nicht zu einer Schwanzflosse Prise reagieren, sondern unterhält opercular Bewegung. Dies dauert in der Regel ca. 2-3 min.
- Entfernen Sie den Fisch aus der Narkose Lösung und legen Sie sie indie Nut in der Schwamm mit dem Kopf ein wenig vor dem Schwamm, aber die Kiemen der Schwamm bedeckt.
- Bewegen Sie den Schwamm in eine vertikale Position.
- Öffnen Sie den Zebrafisch Mund mit der 22-G-Katheter-Schlauch.
- Schieben Sie den Schlauch, bis die Spitze ist an den Kiemen (ca. 1 cm oder die Länge der Schläuche). Die Implantation Schläuche sollten nicht gezwungen werden. Widerstand schlägt die Röhre kann das Drücken der Kiemenbogens oder Herz.
- Wenn es Widerstand gibt, vorsichtig zurückziehen, neu und versuchen Sie es erneut.
- Injizieren Sie das Material langsam.
- Während Injektion, stellen Sie sicher, dass die Lösung nicht über die Kiemen oder den Mund verlassen.
- Entfernen Sie den Fisch aus dem Schwamm und Ort in den Schmutzwassertank.
- Wiederherstellung tritt typischerweise in weniger als 1 min und wird durch die Fische schwimmen aufrecht und Erhalt des Gleichgewichts angegeben.
- Überwachen Sie Fisch für Aufstoßen durch Visualisierung der Fisch aktiv vertreiben m gezeigtaterial aus seinem Mund, oder ohne opercular Bewegung.
- Fische können wieder zu ihrem regulären Tank zurückgegeben werden, sobald sie sich erholt haben.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Beide Geschlechter von Fischen, darunter trächtige Weibchen wurden erfolgreich eine Sonde (Abbildung 1). Eine erfolgreiche Vorgang dauert weniger als eine Minute ohne Flüssigkeit gesehen Verlassen der Kiemen oder den Mund. Der Schlauch tritt leicht, ohne Gewalt, ohne Blut auf Katheterentfernung gesehen. Das Verfahren ist schnell, erfordert etwa 10 min auf 3 bis 4 Fisch Magensonde, mit einem Durchschnitt von 30-45 sec pro Fisch.
Zebrafisch sollte nicht mit mehr als 5 ul jeder...
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Bedeutung
Diese Technik ist eine Verbesserung und bietet mehrere Vorteile gegenüber den beiden zuvor beschriebenen Techniken für gavaging erwachsenen Zebrafisch. Zunächst ermöglicht die Verwendung eines Schwamms, um die Fische zurückzuhalten einer Person, das Verfahren durchzuführen, wie in einem zuvor beschriebenen Technik, die zwei Personen gegenüber. 7 Zweitens ist Katheterimplantation Schlauch flexibler als Venenkatheter, die helfen können, minimiert die durch Trauma zu einer Per...
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Die Rockefeller University Vergleichende Bioscience Center geliefert Unterstützung für dieses Projekt. Wir danken Janelle Monnas für technische Unterstützung.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Ausrüstung | |||
| A Schwamm | |||
| 1 cc Luer-Lock-Spritze | Becton Dickinson Co | ||
| 22-G Micro-Renathane Implantationsschlauch (geschnitten) | Braintree Scientific, Inc. | ||
| 1 22-G-Nadel (bei Bedarf schneiden) | Becton Dickinson Co | ||
| pH-Messgerät | Hanna-Sonde | ||
| 1 Skalpellklinge | |||
| [header] | |||
| Reagenz/Material | |||
| MS-222 (Finquel) | Argent Laboratories |
Referenzen
- Royes, J. -A. B., Chapman, F. Preparing Your Own Fish Feeds. , Department of Fisheries and Aquatic Sciences, Florida Cooperative Extension Service, Insitute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida. (2009).
- Gomez-Gil, B., Cabanillas-Ramos, J., Paez-Brambila, A., Roque, A. Standardization of the bioencapsulation of enrofloxacin and oxytetracycline in Artemia fransciscana Kellogg. Aquaculture. 196, 1-12 (1906).
- Langdon, C. Microparticle types for delivering nutrients to marine fish larvae. Aquaculture. 227, 259-275 (2003).
- Langdon, C., Nordgreen, A., Hawkyard, M., Hamre, K. Evaluation of wax spray beads for delivery of low-molecular weight, water soluble nutrients and antibiotics to Artemia. Aquaculture. 284, 151-158 (2008).
- Zang, L., Morikane, D., Shimada, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A Novel Protocol for the Oral Administration of Test Chemicals to Adult Zebrafish. Zebrafish. 8, 203-210 (2011).
- Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think Small: Zebrafish as a Model System of Human pathology. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , (2012).
- Tysnes, K. R., Jorgensen, A., Poppe, T., Midtlyng, P. J., Robertson, L. J. Preliminary expermients on use of zebrafish as a laboratory model for Giardia duodenalis infection. Acta Parasitologica. 57, 1-6 (2012).
- Marie, B., Huet, H., et al. Effects of a toxic cyanobacterial bloom (Planktothris agardhii) on fish: Insights from histopathological and quantitative proteomic assessments following the oral exposure of medaka fish (Oryzias latipes). Aquatic Toxicology. 114-115, 39-48 (2012).
- Canadian Council on Animal Care. CCAC guidelines on: the care and use of fish in research, teaching and testing. , CCAC. Ottawa, Ontario, Canada. (2005).
- Harper, C., Lawrence, C. The Laboratory Zebrafish. , CRC Press. Boca Raton, Florida, USA. (2011).
- De Tolla, L. J., Srinivas, S., et al. Guidelines for the Care and Use of Fish in Research. ILAR Journal. 37 (4), (1995).
- Topic Popovic, N., Strunjak-Perovic, I., et al. Tricaine methane-sulfonate (MS-222) application in fish anaesthesia. Journal of Applied Ichthyology. 28, 553-564 (2012).
- Field, H. A., Kelley, K. A., Martell, L., Goldstein, A. M., Serluca, F. C. Analysis of gastrointestinal physiology using a novel intestinal transit assay in zebrafish. Neurogastroenterology & Motility. 21, 304-312 (2009).
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
