Groß Gene Knockdown in<em&gt; C. elegans</em&gt; Verwenden dsRNA Fütterung Bibliotheken zu Robust Loss-of-function Phänotypen generieren

Kathryn N. Maher; Mary Catanese; Daniel L. Chase

doi:10.3791/50693

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Methodenartikel

Groß Gene Knockdown in

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DOI:

10.3791/50693

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25. September 2013

Kathryn N. Maher¹ , Mary Catanese² , Daniel L. Chase³

¹Molecular and Cellular Biology Program, University of Massachusetts, Amherst, ²Neuroscience and Behavior Program, University of Massachusetts, Amherst, ³Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Massachusetts, Amherst

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Während dsRNA Fütterung in C. elegans ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um Genfunktionen, aktuellen Protokolle für große Bildschirme Fütterung führen zu variablen Zuschlags Effizienz zu beurteilen. Wir beschreiben eine verbesserte Protokoll für die Durchführung groß angelegte RNAi Fütterung Bildschirme, die in hochwirksame und reproduzierbare Zuschlags der Genexpression resultiert.

Zusammenfassung

RNA-Interferenz, indem Würmer Bakterien, die dsRNA ist ein nützliches Werkzeug, um Genfunktionen in C. bewerten elegans. Während diese Strategie funktioniert gut, wenn eine kleine Anzahl von Genen für die Zuschlags gezielte, Groß Fütterung Bildschirme zeigen variable Zuschlagswirkungsgrade, was ihre Verwendbarkeit einschränkt. Wir haben zuvor veröffentlichten Protokollen RNAi Zuschlags zerlegt und festgestellt, dass die Hauptquelle der reduzierten Zuschlags kann zum Verlust von dsRNA kodierende Plasmide aus den an die Tiere verfüttert werden Bakterien zugeschrieben werden. Basierend auf diesen Beobachtungen haben wir eine dsRNA Fütterungsprotokoll, das stark reduziert oder eliminiert Plasmid Verlust effiziente Hochdurchzuschlags erreichen entwickelt. Wir zeigen, dass dieses Protokoll wird robust, reproduzierbar Knock Down von C. produzieren elegans Gene in mehreren Gewebetypen, einschließlich Neuronen und eine effiziente Knockdown in Großbildschirme ermöglichen. Dieses Protokoll verwendet eine kommerziell erhältliche dsRNA ZufuhrBibliothek und beschreibt alle notwendigen Schritte, um die Bibliothek zu kopieren und auszuführen dsRNA-Bildschirme. Das Protokoll erfordert nicht die Verwendung von hoch entwickelten Geräten, und kann daher von einem C durchgeführt werden elegans Labor.

Einleitung

Historisch genetische Screens in C. elegans durch die Behandlung von Tieren mit einem chemischen Mutagen wie Ethylmethansulfonat um zufällige Mutationen in DNA erstellen durchgeführt worden. Nachkommen-oder grandprogeny mutagenisierter Tiere werden dann isoliert, die Ausstellung eines gewünschten abnorme Phänotyp. Der zum Bewirken des Phänotyps verantwortlich Mutation in einem arbeitsintensiven Abbildungsverfahren oder durch Sequenzierung der mutierten Wurm gesamte Genom identifiziert. Es gibt viele Vorteile bei der Durchführung dieser chemischen Mutagenese-Läsionen, wie sie permanent innerhalb des Genoms, die Schnecke in beiden gain-of-function-und Verlust-....