Die Ableitung der zeitliche Verlauf der Glutamate Ausverkauf mit Dekonvolutionsanalyse von Astrozytäre Transporter Currents

Summary

Wir beschreiben eine analytische Methode, um die Lebensdauer von Glutamat an astrozytären Membranen schätzen von elektrophysiologischen Ableitungen von Glutamat-Transporter Ströme in Astrozyten.

Abstract

Die höchste Dichte von Glutamat-Transporter im Gehirn in Astrozyten gefunden. Glutamattransporter Paar die Bewegung von Glutamat durch die Membran mit dem Co-Transport von 3 Na ⁺ und H ⁺ 1 und der Gegenelektrode Transport von 1 K ^+. Das stöchiometrische Strom, der durch den Transport Prozess erzeugt wird, kann mit whole-cell Patch-Clamp-Aufnahmen von Astrozyten überwacht werden. Der zeitliche Verlauf der aufgezeichneten Strom wird durch den zeitlichen Verlauf der Glutamatkonzentration Profil auf die Astrozyten ausgesetzt sind, die Kinetik der Glutamat-Transporter, und die passive elektrotonischen Eigenschaften von Astrozyten Membranen geformt. Hier beschreiben wir die experimentellen und analytischen Methoden, die verwendet werden, um Glutamattransporter Ströme in Astrozyten erfassen und isolieren den zeitlichen Verlauf der Glutamat-Clearance von allen anderen Faktoren, die die Wellenform der Astrozyten-Transporter Ströme formen kann. Die hier beschriebenen Methoden können verwendet werden, um die Lebensdauer o abzuschätzenf Flash-uncaged und Glutamat in Astrozyten Membranen in jeder Region des zentralen Nervensystems bei Gesundheit und Krankheit synaptisch-released.

Introduction

Astrozyten sind eine der am häufigsten vorkommenden Zelltypen im Gehirn mit sternförmigen Morphologie und feine Membran Vorsprünge, die in der gesamten Neuropils erweitern und erreichen benachbarten synaptische Kontakte ^1,2. Die Astrozyten 'Zellmembran ist dicht mit Glutamat-Transporter-Moleküle ³ verpackt. Unter physiologischen Bedingungen Glutamattransporter schnell binden Glutamat an der extrazellulären Seite der Membran und überträgt es auf Zytoplasma der Zelle. Auf diese Weise erhalten die Transporter günstig die basale Konzentration von Glutamat in den extrazellulären Raum ^4. Glutamat-Transporter in feine Astrozytenfortsätze....

Protocol

1. Scheibe Vorbereitung

1. Bereiten Sie 500 ml Schneiden / Storage-Lösung, die (in mm): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl _2, 1,3 MgSO ₄ · 7H ₂ O, 4 MgCl _2, 26.2 NaHCO _3, 1 NaH ₂ PO ₄ und 22 Glucose, 320 mOsm, pH 7,4
2. Verwenden Sie einen 250 ml-Becher, ein Untertauchen Kammer für die Scheiben vorzubereiten, füllen Sie es mit 200 ml Schneiden / Storage-Lösung, warm es in einem Wasserbad bei 34 ° C und blase sie mit 95% O _2, 5% CO _2.
3. Halten Sie die restlichen Scheiben / Storage-Lösung in einer Glasflasche bei 4 ° C.
4. Verwenden Sie einen Cyanac....

Results

Der Erfolg der analytischen hier beschriebene Ansatz hängt entscheidend von hoher Qualität zu erhalten elektrophysiologischen Ableitungen von Transporter Ströme von Astrozyten in jeder Region des zentralen Nervensystems. In akuten Maus Hippocampus kann Astrozyten leicht unter Dodt Beleuchtung oder IR-DIC werden wegen ihrer kleinen Zellkörper (Ø = 10 um) und prominente Kern (Abbildung 1) identifiziert. Ihre markante sternförmige Morphologie mit Epifluoreszenz, konfokale oder Zwei-Photonen-Laser-Scanning-.......

Discussion

Hier haben wir einen experimentellen Ansatz zur elektrophysiologischen Ableitungen von Astrozyten erhalten beschreiben, leiten ein analytisches Protokoll Glutamattransporter Ströme in Astrozyten isolieren und eine mathematische Methode, um den zeitlichen Verlauf der Glutamat-Clearance von Astrozyten-Transporter Ströme.

Der Erfolg der Analyse beruht auf der Fähigkeit, hochwertige Patch-Clamp-Aufnahmen von Astrozyten zu erhalten und auf die Genauigkeit der Anpassungsalgorithmen verwendet, um d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CGP52432	Tocris	1246
(R,S)-CPP	Tocris	173
DPCPX	Tocris	439
LY341495 Dinatriumsalz	Tocris	4062
MSOP	Tocris	803
NBQX Dinatriumsalz	Tocris	1044
D,L-TBOA	Tocis	1223
Picrotoxin	Sigma	P1675
MNI-L-Glutamat	Tocris	1490
Alexa 594	Life Technologies	A10438	Optionale
Matrixelektroden	Frederick Haer Company	MX21AES(JD3)
Kapillaren aus Borosilikatglas	World Precision Instruments	PG10165-4
Zweistufiger Mikropipettenabzieher aus Glas	Narishige	PC-10
Loctite 404 Sekundenkleber	Ted Pella	46551
Xe Lampe	Rapp OptoElectronic	FlashMic
Igor Pro 6	Wavemetrics