Methodenartikel

Eine quantitative Assay für Zellmigration Murine Enteric neuralen Vorläuferzellen

DOI:

10.3791/50709

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18. September 2013

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1Molecular Genetics of Development Laboratory, Biological Sciences, UQAM

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir stellen ein ex vivo-Assay, der die Zellmigration präzise Quantifizierung der ente Neuralleistenzellen Migrationspotential in Gegenwart von verschiedenen Wachstumsfaktoren ermöglicht.

Zusammenfassung

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Neuralleistenzellen (NCC) sind eine vorübergehende und multiZellPopulation, die aus dem dorsalen Neuralrohr stammt und ausgiebig wandert in den Entwicklungswirbeltierembryo. Neben der Bereitstellung von peripheren Neuronen und Glia, NCC erzeugen Melanozyten sowie die meisten der Schädel-Gesichtsskeletts. NCC Migration und Differenzierung wird durch eine Kombination ihrer axialen Ursprung entlang des Neuralrohrs und ihrer Ausrichtung auf regional unterschiedliche extrazelluläre Signale gesteuert. Ein solcher Beitrag der extrazellulären Liganden bei der Bildung des enterischen Nervensystem (ENS), einem komplexen Netzwerk von miteinander verbundenen neuralen Ganglien, die lokal steuert (unter anderem) Darmmuskelbewegung und Darmmotilität besonders deutlich. In einem rostral Schwanz fashion - - über die gesamte Länge des zukünftigen Darm meisten der ENS wird aus einer kleinen Anfangs Pool von NCC, die eine lange Reise, um zu kolonisieren verpflichten abgeleitet. Unter mehreren Signalwege bekanntbeeinflussen ente NCC Kolonisation wird GDNF / RET-Signalisierung als wichtigste anerkannt. Tatsächlich ist zeitlich und räumlich gesteuert Sekretion des RET-Liganden GDNF durch den Darm Mesenchym vor allem für die Attraktivität und Anleitung von RET-exprimierenden ente NCC nach und in der embryonalen Darm verantwortlich. Hier beschreiben wir ein ex vivo Zellmigrationsassay unter Verwendung einer transgenen Mauslinie, die über fluoreszenzmarkierten NCC, die genaue Quantifizierung von ente NCC Migrationspotential in Gegenwart von verschiedenen Wachstumsfaktoren, einschließlich GDNF ermöglicht.

Einleitung

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Neuralleistenzellen (NCC) sind eine Übergangszelltyp spezifisch für Wirbeltiere, die während der Embryonalentwicklung viele Derivate bildet. Diese Zellpopulation entsteht am Rand des neuronalen Platte, benachbart zu nicht-neuralen Ektoderm 1. Während Neurulation, Biegen der Neuralplatte NCC Orten entlang der dorsalen Rand der bildenden Neuralrohr. NCC laufen dann eine epitheliale-mesenchymale Transition, Trennung und die Migration weg von dem Neuralrohr. NCC besiedeln verschiedenen embryonalen Strukturen, einschließlich des Verdauungstraktes, wo sie den gesamten enterische Nervensystem (ENS) zu bilden, ein zusammenhängendes Netzwerk von Nervenknoten in der....

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Protokoll

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Ethik-Erklärung

Experimente mit Mäusen wurden folgende Kanadischer Rat der Tierpflege-Richtlinien für die Versorgung und Manipulation von Tieren in der medizinischen Forschung durchgeführt. Protokolle, die die Manipulation der Tiere wurden von der Ethikkommission der Universität von Quebec in Montreal genehmigt (Comité institutionnel de Protection des Animaux, Referenznummer 0512-R3-650 bis 0513).

1. Herstellung von Kollagen-Gels

Arbeiten Sie in einem steril unter einer Gewebekultur Kapuze.

  1. Bereiten Sie komplette 5x DMEM (Eagle modifiziertem essentiellen Medium) einschließl....

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Ergebnisse

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Die folgenden Ergebnisse sind repräsentativ dafür, was mit dem hier beschriebenen (1)-Technik erhalten werden. Die Verwendung von Wachstumsfaktoren (dh GDNF) stimuliert die Migration der GFP-exprimierenden ente NCC aus dem Darm in das Explantat und Kollagen-Gel (Abb. 2). Obwohl einige Zellen kommen aus dem Explantat in Abwesenheit von Wachstumsfaktoren, sind diese meist nicht GFP-markierten und für passive Eintrag. Es ist notwendig, die Scheibe von dem Darm Kollagen-Gel, um die.......

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Diskussion

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Wir zeigen, wie unser Ex-vivo-Explantatkultur Technik kann verwendet werden, um genau zu quantifizieren ente NCC Migrationspotential in Gegenwart von GDNF werden. Eine solche genaue Quantifizierung wird stark durch Verwendung von 200 um dicke Vibratoms Darmstücke statt große Stücke ungefähre Größe, wie zuvor beschrieben, 11,12,15 erleichtert. Tatsächlich ermöglicht uns das mit einer angemessenen Anzahl von Zellen in einem hoch reproduzierbare Einstellung zu arbeiten. Zu beachten ist, ermöglicht die g.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

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Wir danken Denis Flipo für die Bildverarbeitung und Analyse Beratung und David W. Silver in dessen Labor die Gata4p [5 kb]-GFP-Mauslinie generiert wurde. Die Forschung im Labor wird von Pilon CIHR, NSERC, FRQS und FRQNT finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DMEM PulverWisent219-010-XK 
NaHCO3BioshopSOB999
Steriflip Vakuumfiltrationssystem in Biotechnologiequalität (0,22 Mikron)EMD MilliporeSCGP00525 
Penicilin-Streptomycin-Lösung, 100xWisent450-201-EL 
Fötales RinderserumWisent095-150Hochwertiges
Kollagen IBD biosciences354236 
NaOHBioshopSHY700Verdünnt aus 10 N Stamm, dann sterilfiltriert
GDNFCedarlaneCLCYT305 
Falcon 24-Well-PlatteBD Biowissenschaften353047 
PräparierschereFisher Scientific089515 
Petrischale aus GlasVWR89000-306 
PBSSigmaP5493
PräpariermikroskopLeicaM125 
Dumont #5 PinzettenFine Science Werkzeuge11251-20 
AgaroseBioshopAGA001
Chirurgische Klingein21 
Allzweck Instant Krazy Kleber StiftKrazy GlueKG824 
HM 650V Mikrotom mit vibrierender KlingeThermo Scientific920110 
ParaformaldehydSigma-AldrichP6148 
DAPISigma-AldrichD9564 

Tabelle der spezifischen Reagenzien und Ausrüstung.

für Zellkulturen Biotechnologiequalität Feder

Referenzen

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  1. Bronner, M. E., Le Douarin, N. M. Development and evolution of the neural crest: An overview. Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).
  2. Bergeron, K. F., Silversides, D. W., Pilon, N. The developmental genetics of Hirschsprung's disease. Clin. Genet. 83 (1), 15-22 (2013).
  3. Oberma....

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Schlagwörter

Fluoreszierende NeuralleistenzellenVibratomInkubation in KollagengelFluoreszenzmikroskopieGDNF SignalisierungPr paration des embryonalen DarmsEinbettung in AgaroseWachstumsfaktorstimulation

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