Wir stellen ein ex vivo-Assay, der die Zellmigration präzise Quantifizierung der ente Neuralleistenzellen Migrationspotential in Gegenwart von verschiedenen Wachstumsfaktoren ermöglicht.
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Methodenartikel
Eine quantitative Assay für Zellmigration Murine Enteric neuralen Vorläuferzellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Neuralleistenzellen (NCC) sind eine vorübergehende und multiZellPopulation, die aus dem dorsalen Neuralrohr stammt und ausgiebig wandert in den Entwicklungswirbeltierembryo. Neben der Bereitstellung von peripheren Neuronen und Glia, NCC erzeugen Melanozyten sowie die meisten der Schädel-Gesichtsskeletts. NCC Migration und Differenzierung wird durch eine Kombination ihrer axialen Ursprung entlang des Neuralrohrs und ihrer Ausrichtung auf regional unterschiedliche extrazelluläre Signale gesteuert. Ein solcher Beitrag der extrazellulären Liganden bei der Bildung des enterischen Nervensystem (ENS), einem komplexen Netzwerk von miteinander verbundenen neuralen Ganglien, die lokal steuert (unter anderem) Darmmuskelbewegung und Darmmotilität besonders deutlich. In einem rostral Schwanz fashion - - über die gesamte Länge des zukünftigen Darm meisten der ENS wird aus einer kleinen Anfangs Pool von NCC, die eine lange Reise, um zu kolonisieren verpflichten abgeleitet. Unter mehreren Signalwege bekanntbeeinflussen ente NCC Kolonisation wird GDNF / RET-Signalisierung als wichtigste anerkannt. Tatsächlich ist zeitlich und räumlich gesteuert Sekretion des RET-Liganden GDNF durch den Darm Mesenchym vor allem für die Attraktivität und Anleitung von RET-exprimierenden ente NCC nach und in der embryonalen Darm verantwortlich. Hier beschreiben wir ein ex vivo Zellmigrationsassay unter Verwendung einer transgenen Mauslinie, die über fluoreszenzmarkierten NCC, die genaue Quantifizierung von ente NCC Migrationspotential in Gegenwart von verschiedenen Wachstumsfaktoren, einschließlich GDNF ermöglicht.
Einleitung
Neuralleistenzellen (NCC) sind eine Übergangszelltyp spezifisch für Wirbeltiere, die während der Embryonalentwicklung viele Derivate bildet. Diese Zellpopulation entsteht am Rand des neuronalen Platte, benachbart zu nicht-neuralen Ektoderm 1. Während Neurulation, Biegen der Neuralplatte NCC Orten entlang der dorsalen Rand der bildenden Neuralrohr. NCC laufen dann eine epitheliale-mesenchymale Transition, Trennung und die Migration weg von dem Neuralrohr. NCC besiedeln verschiedenen embryonalen Strukturen, einschließlich des Verdauungstraktes, wo sie den gesamten enterische Nervensystem (ENS) zu bilden, ein zusammenhängendes Netzwerk von Nervenknoten in der Darmwand eingebettet. Wie kürzlich Bewertung 2,3 haben viele Gene in der Entwicklung dieser komplizierten Struktur beteiligt.
Die meisten der ENS wird aus einem kleinen Pool von NCC mit Ursprung aus dem Vagus Neuralrohr (dh rund um die potenziellen Hinterhirn / Rückenmark-Grenze) abgeleitet 4.Diese neuronalen Vorläuferzellen erreichen die Vorderdarm um embryonalen Tag (e) 9,0 bei Mäusen und dann kaudal wandern im Darm Mesenchym bis ca. EUR 15,0 um die ganze embryonalen Darm zu kolonisieren. Eine kleinere Teilmenge von Kolon neuralen Vorläuferzellen wird auch durch sakrale NCC, die den hinteren Darm in die entgegengesetzte Richtung bis zum Blinddarm 4 eindringen vorgesehen. Sowohl Vagus-und sakralen NCC erfordern mehrere migrations, Proliferation-, Überlebens-und Differenzierungsfördernde Hinweise, um vollständige Bildung des ENS zu gewährleisten. In dieser Hinsicht Tiermodellen - vor allem gentechnisch veränderte Mäuse - haben maßgeblich bei der Identifizierung von mehreren wesentlichen extrazellulären Liganden: GDNF (Glia-Zellen-derived neurotrophic factor), Endothelin-3, Neurotrophin-3, BMPs (Bone morphogenetische Proteine), Netrin sowie Sonic und Indian Hedgehog (Shh und Ihh) 10.05. Von diesen ist GDNF Signal durch die Transmembran-Rezeptor-Tyrosin-Kinase RET (während der Transfektion Rearranged) als th erkanntE kritischen Weg für die Anziehung und Führung von NCC nach und in der embryonalen Darm. GDNF ist durch den Darm ausgeschieden und Mesenchym bildet eine raumzeitlich gesteuert rosrrocaudal Gradienten, die direkt chemoattractive zu ente NCC, die ausdrücken, RET ist 11,12.
Neben anderen Funktionen steuert der ENS Bewegung im Verdauungstrakt durch seine Wechselwirkung mit der glatten Muskulatur in der Darmwand. Abwesenheit von neuralen Ganglien im Anschlussbereich der Darm Ergebnisse in Hirschsprung-Krankheit: tonische Kontraktion des betroffenen Segments führt zu Verstopfung stromauf Anhäufung von aufgeschlossenen Material und massive Ausdehnung des Darms und Bauch. Hirschsprung-Krankheit tritt in etwa einem von 5.000 Lebendgeburten. Die rostro-kaudale Migrationsmuster von magensaft NCC ist vermutlich die wichtigsten Einflussfaktor auf die Ätiologie der Hirschsprung-Krankheit sein. Der Doppelpunkt, die am weitesten von der Quelle der Migration NCC und letzte Teil Bowel besiedelt zu werden, ist besonders anfällig für Mängel in der ENS-Bildung. In Übereinstimmung mit ihrer entscheidenden Rolle bei magensaftresistenten NCC Migration ist Störung der GDNF / RET Signalisierung der Haupt bekannte genetische Ursache von Morbus Hirschsprung 13.
Um besser zu studieren, NCC und ENS Entwicklung, erzielten wir eine transgene Mauslinie - mit Namen Gata4p [5 kb]-GFP 14 -, in dem Migrations NCC mit Green Fluorescent Protein (GFP) markiert. Als nächstes perfektioniert ein ex vivo Zellmigrationsassay, durch andere Gruppen 11,12,15 aus veröffentlichten Arbeiten ausgelegt, die jetzt ermöglicht eine präzise Quantifizierung der ente NCC Migrationspotential in Gegenwart von verschiedenen Wachstumsfaktoren, wie GDNF.
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Protokoll
Ethik-Erklärung
Experimente mit Mäusen wurden folgende Kanadischer Rat der Tierpflege-Richtlinien für die Versorgung und Manipulation von Tieren in der medizinischen Forschung durchgeführt. Protokolle, die die Manipulation der Tiere wurden von der Ethikkommission der Universität von Quebec in Montreal genehmigt (Comité institutionnel de Protection des Animaux, Referenznummer 0512-R3-650 bis 0513).
1. Herstellung von Kollagen-Gels
Arbeiten Sie in einem steril unter einer Gewebekultur Kapuze.
- Bereiten Sie komplette 5x DMEM (Eagle modifiziertem essentiellen Medium) einschließlich Standard-Antibiotika. Man löst 3,37 g DMEM-Pulver und 0,925 g NaHCO 3 in 20 ml Wasser. Sterilisiert, indem sie durch ein 0,22 um-Filter. Hinzufügen von 2,5 ml sterilem 100x Penicillin / Streptomycin und 25 ml sterile hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum. Lagern bei 4 ° C
- Auf Eis, mischen Sie 800 ulvon Collagen-I-Lösung (3,77 mg / ml in 0,02 N Essigsäure, filtersterilisiert), 600 ul 5x vollständigen DMEM und 17 &mgr; l 1 N NaOH. Verdünnt mit sterilem Wasser auf ein Endvolumen von 3 ml. Fügen Sie relevanten Wachstumsfaktoren in der Mischung. Wir verwenden in der Regel GDNF bei 10 ng / ml zu ente NCC Migration anzuregen.
- Kaution ca. 480 ul in jede Vertiefung einer einzelnen Zeile in einer 24-Well-Platte. Vermeiden Sie Luftblasen. Die restlichen Zeilen verwendet werden, um die Wirkung anderer Wachstumsfaktoren auf die Zellmigration testen.
- Das Kollagen zu polymerisieren lassen mindestens 1 Stunde in einem sterilen Inkubator bei 37 ° C.
2. Präparation der Tiere 16
- Richten Sie Paarungen und überprüfen Vaginalpfropf am nächsten Morgen. Tag E0.5 als Uhr am Tag der vaginale Stecker gefunden wird, isolieren die weibliche und warten Sie 12 Tage bis E12.5.
- Anesthetize schwangere Mäuse mit Isofluran und einschläfern durch CO 2-Inhalation.
- Sprühen Sie die Maus mit 70% Ethanol. Heben Sie die Bauch skin und öffnen Sie den Bauch Hohlraum mit Dissektionsscheren.
- Entfernen der Gebärmutter in eine Glaspetrischale mit eiskaltem PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) gefüllt. Schneiden Sie die Gebärmutter quer zwischen den einzelnen deciduum Schwellungen, jeden Embryo Implantationsstelle zu isolieren.
- Die Arbeiten an jeder Implantationsstelle separat in einem anderen Glaspetrischale mit eiskaltem PBS gefüllt. Unter einem Binokular, feinen Pinzette verwenden, um die Muskelschicht der Gebärmutter zu entfernen.
- Öffnen Sie die viszerale Dottersack und Amnion, um den Embryo zu offenbaren. Achten Sie beim Abtrennen der Blutgefäße Beitritt der Embryo mit der Plazenta / viszeralen Dottersack, da sie mit den Entwicklungs Darm verflochten.
- Sever Kopf des Embryos am Hals.
- Legen Sie eine geschlossene Zange in der Bauchhöhle des Embryos, knapp über dem dunklen rot gefärbten Leber und lassen Sie die Zange geöffnet von sich selbst (mehr anwenden Druck), um eine Queröffnung in den Bauch Hohlraum zu machen. Ziehen Sie die Zange geöffnet nach unten in Richtungdas hintere Ende des Embryos, um den Bauch vollständig zu öffnen.
- Schnappen Sie sich das Bindegewebe hinter der Leber und aus dem Bauch ziehen den Mut, man aufpassen, nicht zu brechen, den Darm (der Dickdarm bis zum Anus beigefügt).
- Schneiden Sie den Doppelpunkt, um die Eingeweide aus dem Rest des Embryos zu befreien. Der Schnitt kann an jeder Stelle entlang des Dickdarms werden. Reservieren Sie den Schwanzteil für später.
- Herauszuarbeiten, die das Bindegewebe von der Blinddarm, dann den Rest des Darms. Achten Sie darauf, um den Darm gewickelt, während dies zu tun.
- Schneiden Sie die Leber und Magen (auf dem rostralen Ende des Dünndarms), sowie die Urniere und Genitalleisten, wenn einige vorhanden sind.
- Isolieren Sie den Dünndarm. Auch darauf achten, nicht um den Darm zu ersticken. Von nun an kann der rosrrocaudal Ausrichtung des Darmgewebe unter Verwendung des auf der rostralen Ende vorhanden scharfen Krümmung verfolgt werden. Lassen Sie den Dünndarm in PBS bei Raumtemperatur für so kurze Zeit wie möglich vor emBettwäsche (siehe Schritt 3.3).
- Schließlich notieren die Anzahl der Schwanz Somiten für jeden Embryo das Stadium der embryonalen Entwicklung genau zu bestimmen.
3. Schnitte von embryonalen Darm
- Bevor Sie mit Embryo Dissektionen fortfahren, schmelzen 1,5 g Agarose in 100 ml PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) und halten bei 50 ° C
- Gießen Agarose in eine Einbettungsform geschmolzen (zB ein geschlossener 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, die längs geschnitten auf etwa 1/4 der Rohrwand herausgeschnitten). Lassen Sie die Agarose abkühlen auf ca. 42-45 ° C, sollte es nur leicht warm an.
- Betten Sie die embryonalen Darm, kurz bevor die Agarose erstarrt (dies kann mit einer Pinzette Tipps ausgewertet und 36-38 ° C um auftreten). Halten Sie den Darm mit einer Zange durch die gefaltete rostralen Ende, ziehen Sie es sehr langsam durch die Agarose entlang der Länge der Form. Dies hilft, den Darm gerade, während die Agarose-Sets zu halten. Lassen Sie die Tausgeben, sobald sie beginnt, zu wider bewegt. Verfolgen Sie die rostral-kaudale Ausrichtung der Darm.
- Legen Sie die Form in einem Kühlschrank 2-3 Minuten, um zu gewährleisten, die Agarose wurde komplett eingestellt.
- Nehmen Sie die Agarose aus der Form (indem Sie sie aus dem geöffneten Eppendorf-Röhrchen). Mit einer Klinge, nehmen Sie die überschüssige Agarose an beiden Enden, Kürzungen senkrecht auf den Darm.
- Kleben Sie den rostralen Ende des Darms / Agarose blockieren Sie auf die Metallphase eines Mikrotom mit vibrierender Klinge. Schneiden Sie die überschüssige Agarose an den Seiten des Darms / Agarose-Block.
- Montieren Sie den Metall Bühne, auf der vibrierenden Mikrotom Kammer. Wenn nötig, stellen Sie den Winkel der Bühne, so ist der Darm so senkrecht wie möglich (also senkrecht zur Klinge). Decken Sie die Probe mit eiskaltem PBS. Bringen Sie die Mikrotomklinge bis auf wenige Millimeter unter der Oberfläche Puffer.
- Stellen Sie 200 um Vibratoms Querschnitte der Schwanz-die meisten Dünndarm, sicherzustellen, dass die each Agarose-Scheibe enthält eine vollständige Darmabschnitt.
4. Kultur der Darm Explantate
- Sanft legen das frisch geschnittene Darm / Agarose-Scheiben flach auf den Kollagen Gele mit einer Pinzette, indem eine Scheibe in die Mitte von jedem gut.
- Inkubiere 3 Tage bei 37 ° C in einer feuchten 5% CO 2-Atmosphäre, um die Migration von NCC aus dem Explantat ermöglichen.
- Nehmen Sie die Darm / Agarose-Scheiben aus dem Kollagen-Gel sehr vorsichtig mit einer Pinzette. Achten Sie darauf, um das Gel unter beschädigen.
- Vermeiden direkt während der nachfolgenden Inkubation und Waschschritte, um Berühren der Kollagen-Gel, um sicherzustellen, dass die Zellmigrationsmuster nicht gestört wird. Fix mit 500 ul 4% PFA (Paraformaldehyd) (in PBS) pro Vertiefung 1 Stunde bei Raumtemperatur.
- Ersetzen Sie das Fixiermittel mit 500 ul DAPI (4 ',6-Diamino-2-phenylindol)-Lösung (5 pg / ml in PBS) pro Vertiefung und Inkubation 10 Minuten bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie jede Vertiefung 3xmit 500 ul PBS für 5 min.
- Fotografieren Sie die fluoreszierenden Zellen (GFP und DAPI-Kanäle) in der Kollagen-Gel in jedem gut eingebettet.
5. Bildanalyse
Wir haben umfangreiche Verwendung von ImageJ 17 zu verarbeiten und zu quantifizieren, die nach Explantatkultur erzeugten Bilder.
- Beginnen Sie mit der Abbildung einer Mikrometer-Objektträger mit der gleichen Vergrößerung wie die fluoreszierenden Zell Fotografien. Messen Sie die Länge von einem Mikrometer in Pixeln (mit der Straight Line Tool).
- Stellen Sie die Skala (Analyse / Set-Skala; Eingang Anzahl der Pixel / Mikron).
- Für jedes Foto GFP-Fluoreszenz, ändern Sie das Bildformat auf 8-Bit-Graustufen (Image/Type/8-bit).
- Passen Sie Intensität des Signals (Bild / Anpassen / Helligkeit / Kontrast).
- Subtrahieren Sie die Hintergrundgeräusche, falls erforderlich (Prozess / Subtrahieren Hintergrund; stellen Sie den rollenden Ball Radius).
- Stellen Sie eine Schwelle, um Zellen und Zellklumpen (Bild / Anpassen / Threshold), markieren Sie dieeinen Wende n anwenden, um die Klumpen (Process / Binary / Watershed) teilen.
- Analysieren Teilchen Regionen von Interesse (ROI) zu spezifizieren und generieren Zellzahl-Statistik (Analyse / Analysieren Partikel; Set-Größe Mindest, um die verbleibenden Pixel auszuschließen).
- Stellen Messoptionen zu Feret-Durchmesser (Analyse / Set Maße) enthalten.
- Gruppe ROIs und messen als Ganzes der Feret-Durchmesser zu bestimmen, die Angabe der Zellausbreitung (Analysieren / Tools / ROI-Manager / Mehr / OR, dann ROI-Manager / Hinzufügen und ROI-Manager / Measure).
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Ergebnisse
Die folgenden Ergebnisse sind repräsentativ dafür, was mit dem hier beschriebenen (1)-Technik erhalten werden. Die Verwendung von Wachstumsfaktoren (dh GDNF) stimuliert die Migration der GFP-exprimierenden ente NCC aus dem Darm in das Explantat und Kollagen-Gel (Abb. 2). Obwohl einige Zellen kommen aus dem Explantat in Abwesenheit von Wachstumsfaktoren, sind diese meist nicht GFP-markierten und für passive Eintrag. Es ist notwendig, die Scheibe von dem Darm Kollagen-Gel, um die...
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Diskussion
Wir zeigen, wie unser Ex-vivo-Explantatkultur Technik kann verwendet werden, um genau zu quantifizieren ente NCC Migrationspotential in Gegenwart von GDNF werden. Eine solche genaue Quantifizierung wird stark durch Verwendung von 200 um dicke Vibratoms Darmstücke statt große Stücke ungefähre Größe, wie zuvor beschrieben, 11,12,15 erleichtert. Tatsächlich ermöglicht uns das mit einer angemessenen Anzahl von Zellen in einem hoch reproduzierbare Einstellung zu arbeiten. Zu beachten ist, ermöglicht die g...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Wir danken Denis Flipo für die Bildverarbeitung und Analyse Beratung und David W. Silver in dessen Labor die Gata4p [5 kb]-GFP-Mauslinie generiert wurde. Die Forschung im Labor wird von Pilon CIHR, NSERC, FRQS und FRQNT finanziert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| DMEM Pulver | Wisent | 219-010-XK | |
| NaHCO3 | Bioshop | SOB999 | |
| Steriflip Vakuumfiltrationssystem in Biotechnologiequalität (0,22 Mikron) | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Penicilin-Streptomycin-Lösung, 100x | Wisent | 450-201-EL | |
| Fötales Rinderserum | Wisent | 095-150 | Hochwertiges |
| Kollagen I | BD biosciences | 354236 | |
| NaOH | Bioshop | SHY700 | Verdünnt aus 10 N Stamm, dann sterilfiltriert |
| GDNF | Cedarlane | CLCYT305 | |
| Falcon 24-Well-Platte | BD Biowissenschaften | 353047 | |
| Präparierschere | Fisher Scientific | 089515 | |
| Petrischale aus Glas | VWR | 89000-306 | |
| PBS | Sigma | P5493 | |
| Präpariermikroskop | Leica | M125 | |
| Dumont #5 Pinzetten | Fine Science Werkzeuge | 11251-20 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001 | |
| Chirurgische Klinge | in | 21 | |
| Allzweck Instant Krazy Kleber Stift | Krazy Glue | KG824 | |
| HM 650V Mikrotom mit vibrierender Klinge | Thermo Scientific | 920110 | |
| Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 | |
Tabelle der spezifischen Reagenzien und Ausrüstung. |
Referenzen
- Bronner, M. E., Le Douarin, N. M. Development and evolution of the neural crest: An overview. Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).
- Bergeron, K. F., Silversides, D. W., Pilon, N. The developmental genetics of Hirschsprung's disease. Clin. Genet. 83 (1), 15-22 (2013).
- Obermayr, F., Hotta, R., Enomoto, H., Young, H. M. Development and developmental disorders of the enteric nervous system. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 10 (1), 43-57 (2012).
- Sasselli, V., Pachnis, V., Bursn, A. J. The enteric nervous system. Dev. Biol. 366 (1), 64-73 (2012).
- Sanchez, M. P., Silos-Santiago, I., et al. Renal agenesis and the absence of enteric neurons in mice lacking GDNF. Nature. 382 (6586), 70-73 (1996).
- Baynash, A. G., Hosoda, K., et al. Interaction of endothelin-3 with endothelin-B receptor is essential for development of epidermal melanocytes and enteric neurons. Cell. 79 (7), 1277-1285 (1994).
- Chalazonitis, A., Pham, T. D., et al. Neurotrophin-3 is required for the survival-differentiation of subsets of developing enteric neurons. J. Neurosci. 21 (15), 5620-5636 (2001).
- Goldstein, A. M., Brewer, K. C., Doyle, A. M., Nagy, N., Roberts, D. J. BMP signaling is necessary for neural crest cell migration and ganglion formation in the enteric nervous system. Mech. Dev. 122 (6), 821-833 (2005).
- Jiang, Y., Liu, M. T., Gershon, M. D. Netrins and DCC in the guidance of migrating neural crest-derived cells in the developing bowel and pancreas. Dev. Biol. 258 (2), 364-384 (2003).
- Ramalho-Santos, M., Melton, D. A., McMahon, A. P. Hedgehog signals regulate multiple aspects of gastrointestinal development. Development. 127 (12), 2763-2772 (2000).
- Natarajan, D., Marcos-Gutierrez, C., Pachnis, V., de Graaf, E. Requirement of signaling by receptor tyrosine kinase RET for the directed migration of enteric nervous system progenitor cells during mammalian embryogenesis. Development. 129 (22), 5151-5160 (2002).
- Young, H. M., Hearn, C. J., et al. GDNF Is a chemoattractant for enteric neural cells. Dev. Biol. 229 (2), 503-516 (2001).
- Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J. Med. Genet. 45 (1), 1-14 (2008).
- Pilon, N., Raiwet, D., Viger, R. S., Silversides, D. W. Novel pre- and post-gastrulation expression of Gata4 within cells of the inner cell mass and migratory neural crest cells. Dev. Dyn. 237 (4), 1133-1143 (2008).
- Nagy, N., Goldstein, A. M. Endothelin-3 regulates neural crest cell proliferation and differentiation in the hindgut enteric nervous system. Dev. Biol. 293 (1), 203-217 (2006).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersen, K., Behringer, R. Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. , 3rd ed, CSH Press. Cold Spring Harbor. 209-250 (2003).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Byth, K. F., Thomas, A., et al. AZD5438, a potent oral inhibitor of cyclin-dependent kinases 1, 2, and 9, leads to pharmacodynamic changes and potent antitumor effects in human tumor xenografts. Mol. Cancer Ther. 8 (7), 1856-1866 (2009).
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Nachdrucke und Genehmigungen
