Fluoreszenz-Mikroskopie-Methoden zur Bestimmung der Lebensfähigkeit der Bakterien in Verbindung mit Säugerzellen

Summary

Zentral auf das Gebiet der bakteriellen Pathogenese ist die Möglichkeit, festzulegen, ob und wie Mikroben nach Einwirkung von eukaryotischen Zellen überleben. Dieser Artikel beschreibt Protokolle für den Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen, die die Lebensfähigkeit der einzelnen Bakterien im Inneren und mit Wirtszellen assoziiert offenbaren.

Abstract

Zentral auf das Gebiet der bakteriellen Pathogenese ist die Möglichkeit, festzulegen, ob und wie Mikroben nach Einwirkung von eukaryotischen Zellen überleben. Aktuelle Protokolle, um diese Fragen zu beantworten sind Koloniezahl-Assays, Gentamicin-Schutztests und Elektronenmikroskopie. Koloniezahl und Gentamicin-Schutztests beurteilen nur die Lebensfähigkeit der gesamten Bakterienpopulation und sind nicht in der Lage, einzelne Lebensfähigkeit der Bakterien zu bestimmen. Elektronenmikroskopie verwendet werden, um die Lebensfähigkeit der Bakterien zu bestimmen und einzelne Informationen hinsichtlich ihrer Lokalisation in Wirtszellen. Allerdings Bakterien zeigen oft eine Reihe von Elektronendichten, was eine Bewertung der Rentabilität schwierig. Dieser Artikel beschreibt Protokolle für den Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen, die die Lebensfähigkeit der einzelnen Bakterien im Inneren und mit Wirtszellen assoziiert offenbaren. Diese Tests wurden ursprünglich entwickelt, um das Überleben von Neisseria gonorrhoeae in primären humanen neutrophilen Granulozyten zu bewerten, sondern sollte einpplicable einem Bakterium-Wirt-Interaktion. Diese Protokolle kombinieren membranpermeablen Fluoreszenzfarbstoffen (SYTO9 und 4 ',6-Diamino-2-phenylindol [DAPI]), die alle Bakterien färben, mit Membran-undurchlässig Fluoreszenzfarbstoffen (Propidiumiodid und SYTOX Grüne), die nur zugänglich sind nicht lebensfähige Bakterien. Vor der eukaryotischen Zelle Permeabilisierung wird ein Antikörper oder fluoreszierenden Reagens zugegeben, um extrazelluläre Bakterien zu identifizieren. So sind diese Tests unterscheiden die Lebensfähigkeit der Bakterien an und innen eukaryotischen Zellen haften. Ein Protokoll wird auch für die Verwendung der Lebensfähigkeit Farbstoffe in Kombination mit fluoreszierenden Antikörpern gegen eukaryotische Zellmarker, um die subzelluläre Lokalisierung von einzelnen Bakterien zu bestimmen. Die in diesem Artikel behandelt bakterielle Lebensfähigkeit Farbstoffe sind eine sensible Ergänzung und / oder Alternative zu traditionellen Mikrobiologie Techniken, um die Lebensfähigkeit der einzelnen Bakterien zu bewerten und Informationen, wo Bakterien in Wirtszelle überlebens.

Introduction

Es ist eine dynamische Interaktion und Ko-Evolution zwischen Bakterien und den Gastgebern in dem sie wohnen. Bakterien haben die Einhaltung Organellen, die Sekretion Systeme und / oder die Fähigkeit, Giftstoffe, die ihre produktiven Infektion von Wirts phagocytic und nicht-Fresszellen aktivieren produzieren entwickelt. Die Bakterien müssen auch Erkennung und antimikrobiellen Aktivitäten von dem Immunsystem des Wirts zu kämpfen. Das Immunsystem des Wirts wird der angeborenen und erworbenen Komponenten einschließlich der physikalischen und chemischen Barrieren, Immunzellen, die das Komplementsystem und andere Komponenten, der humoralen Immunität besteht. Während viele ....

Protocol

1. Beurteilung der Lebensfähigkeit der Bakterien mit Propidiumiodid und SYTO9

1. Infect adhärenten Zellen, die bis 12 mm Durchmesser kreisförmigen Deckgläsern in 24-Well-Platten mit Bakterien von Interesse sind. Beheben Sie NICHT die Zellen mit Aldehyden oder organischen Lösungsmitteln.
2. Spülen Zellen einmal vorsichtig in 0,1 M 3 - (N-Morpholino) propansulfonsäure (MOPS), pH 7,2, enthaltend 1 mM MgCl ₂ (MOPS / MgCl _2).
3. Zellen, Inkubation für 10 min im Dunkeln bei Raumtemperatur mit Alexa Fluor 647-gekoppelten Antikörper oder Lectin, der den Bakterienspezies von Interesse bindet, in MOPS / MgCl _2,<....

Results

Die skizzierten Protokolle wurden verwendet, um das Überleben von N. prüfen gonorrhoeae nach Einwirkung von primären humanen Neutrophilen ^5,26. Neutrophile wurden mit N. infiziert gonorrhoeae und verarbeitet mit Protokoll 1, mit dem grün-fluoreszierenden Farbstoff SYTO9 Lebensfähigkeit und die rote fluoreszierende Propidiumiodid (Abbildung 4A). Die Farbstoffe wurden in Gegenwart von Saponin, die Cholesterin sequestriert, um vorzugsweise permeabilisiert Wirt.......

Discussion

Präsentiert hier sind zwei Protokolle, die DNA-Bindung und Lebensfähigkeit Farbstoffe in Verbindung mit einem fluoreszierenden Lektin zu lebenden und toten Bakterien und menschlichen Zellen im Inneren angebracht identifizieren zu verwenden. Da beide Protokolle effektiv live aus toten Bakterien zu unterscheiden, deren Wahl-Protokoll zu verwenden, hängt von dem Ziel des Experiments. Das erste Protokoll verwendet Propidiumiodid zu nicht lebensfähigen Bakterien und SYTO9 intakte Nachweis von Bakterien zu erkennen. In

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
21 G 3/4 Schmetterlingsnadeln für die Blutentnahme	Becton Dickinson 367251
Blutentnahmeröhrchen mit Natriumheparin 10 ml	Becton Dickinson	366480
Steriles Wasser für die Bewässerung	Baxter	07-09-64-070
Dextran 500	Sigma	31392
Natriumchlorid	Fisher Scientific	S641
Dextrose	Ricca Chemical Company	RDCD0200
Dulbecco's PBS no Ca2+ oder Mg2+	Thermo	Scientific SH3002802
Ficoll-Lösung	GE Healthcare	17-1440-03
Essigsäure	Fisher Scientific	BP2401
12 mm runde Glasdeckgläser	Fisher Scientific	12-545-80 12CIR-1
24-Well-Platten	Corning Incorporated	3524
Gepooltes Humanserum	Sigma	S7023
RPMI	Mediatech	15-040-CV
Fötales Rinderserum	Thermo Scientific	SH3007103
Humanes Interleukin-8	R& D Systems	208-IL/CF
MOPS	Sigma	M3183
MgCl2	Fisher Scientific	BP214
Propidiumiodid	Life Technologies	L7007 oder L7012
SYTO9	Life Technologies	L7007 oder L7012
Saponin	Fluka Analytisch	47036
Alexa Fluor 647-gekoppeltes Sojabohnen-Lektin	Life Technologies	L-32463
DAPI	Sigma	D8417
SYTOX Green	Life Technologies	S7020
Maus Anti-CD63	Entwicklungsstudien Hybridom Bank	H5C6
Alexa Fluor 555 Antikörper-Markierungskit	Life Technologies	A20187
Hämazytometer Bright Line	Hausser Scientific	1492
Pinzette	EMS	78320
Sorvall Legend RT + Zentrifuge	Thermo Scientific	75004377