Struktur- und Koordinationsbestimmung von Peptid-Metall-Komplexen mittels 1D und 2D 1h NMR

Summary

Die NMR-Lösungsstruktur eines Metallochaperon-Modellpeptids mit Cu (I) wurde bestimmt, und ein detailliertes Protokoll von der Probenvorbereitung über die 1D- und 2D-Datenerfassung bis hin zu einer dreidimensionalen Struktur beschrieben.

Abstract

Die Bindung von Kupfer (I) durch Metalllochaperon-Transportproteine verhindert die Kupferoxidation und die Freisetzung von toxischen Ionen, die an schädlichen Redoxreaktionen teilnehmen können. Der Cu(I)-Komplex des Peptidmodells eines Cu(I)-bindenden Metallochaporon-Proteins, das die Sequenz MTCSGCSRPG (unterstrichen ist konserviert) enthält, wurde in Lösung unter inerten Bedingungen mittels NMR-Spektroskopie bestimmt.

NMR ist eine weithin akzeptierte Technik zur Bestimmung von Lösungsstrukturen von Proteinen und Peptiden. Aufgrund der Schwierigkeit bei der Kristallisation, Einkristalle bereitzustellen, die für die Röntgenkristallographie geeignet sind, ist die NMR-Technik äußerst wertvoll, zumal sie Informationen über den Lösungszustand und nicht über den Festkörper liefert. Darin beschreiben wir alle Schritte, die für eine vollständige dreidimensionale Strukturbestimmung mittels NMR erforderlich sind. Das Protokoll umfasst die Probenvorbereitung in einem NMR-Röhrchen, die Erfassung und Verarbeitung von 1D- und 2D-Daten, die Zuweisung und Integration von Peaks, molekularmechanische Berechnungen und die Strukturanalyse. Wichtig ist, dass die Analyse zunächst ohne voreingestellte Metall-Liganden-Bindungen durchgeführt wurde, um eine zuverlässige Strukturbestimmung auf unvoreingenommene Weise zu gewährleisten.

Introduction

Peptide werden häufig als Proteinmodelle, potenzielle Wirkstoffe und eigenständige Therapeutika verwendet. Ihre geringe Größe und ihr hohes Maß an Flexibilität schließen jedoch aufgrund von Schwierigkeiten bei der Kristallisation oft eine Strukturbestimmung durch Röntgenstrahlen aus.

Kernspinresonanz (NMR) kann verwendet werden, um Peptidstrukturen und Wechselwirkungen zu bestimmen. Die Methode kann Informationen über die lokale und Gesamtstruktur, die Bindung und die Wechselwirkungen mit niedrigerer Affinität liefern und ist auf schwierige Proben anwendbar, da sie im Lösungszustand durchgeführt werden kann.

Der ....

Protocol

1. Probenvorbereitung

1. Apo-Probe: Lösen Sie etwa 1-2 mg des Peptids in 450-500 μl deuteriertem Lösungsmittel in NMR-Qualität (die bevorzugten Lösungen für biologische Proben sind 10 % D2O in Wasser oder d6-DMSO ^11-12, wenn sich die Probe nicht in Wasser auflöst oder mit Wasser reagiert).
2. Kupfer-reagierte Probe: Lösen Sie etwa 1-2 mg des Peptids mit einer äquimolaren Menge Metallsalz in 450-500 μl des NMR-Lösungsmittels.
3. Filtrieren Sie die Lösung mit einem Sinterglas, Filterpapier oder einer anderen Technik, die für die zu untersuchenden Verbindungen geeignet ist und diese nicht adsorbiert. Dies ist wichtig, um metalli....

Results

Im Rahmen einer laufenden Studie von kupferbindenden Proteinmodellen wurde die Struktur der konservierten Sequenz MT/HCXXC innerhalb des linearen Peptids MTCSGCSRPG mittels NMR im Lösungszustand bestimmt. Das Peptid wurde unter inerter Umgebung mit CuCl umgesetzt und der pH-Wert mit einem Universalstäbchen auf ~3,0 gemessen. Die Amidregion des Peptids zeigte bei der Reaktion mit Kupfer eine Ausdehnung von 6,7-8,5 auf 6,6-9,0 ppm (Abbildung 2). Eine Linienverbreiterung aufgrund leichter Kupferoxidation is.......

Discussion

Der Beitrag struktureller Informationen zum Verständnis von Bindungsmechanismen ist allgemein anerkannt. Peptide sind nützlich als Modelle für Proteinbindungen und -interaktionen; Sie sind jedoch nicht für die Hauptmethode zur Strukturbestimmung, die Röntgenkristallographie, zugänglich. Die NMR ist für diese Systeme besonders nützlich, da sich die Strukturen leicht in Lösung lösen lassen. Dies gilt insbesondere für den Fall von Metallochaperon-Mimetika, die zusätzlich eine Strukturbestimmung in einer inerten Umgebung erf.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Avance DMX 600 MHz Spektrometer	Bruker
NMR-Probenröhrchen	Wilmad	535-PP
Handschuhfach	MBraun	LM05-019
Lyophilisator	VirTis	TischgerätK
Peptid	BioChemia	Sonderanfertigung	>95% Reinheit
Kupfer (1)-chlorid	Aldrich	224332
Salzsäure	BioLab	231-595-7
Natriumhydroxid	Gadot	1310-73-2
d6-Dimethylsulfoxid	Aldrich	236926
Deuteriumoxid	Aldrich	151882