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Summary

Die NMR-Lösungsstruktur eines Metallochaperon-Modellpeptids mit Cu (I) wurde bestimmt, und ein detailliertes Protokoll von der Probenvorbereitung über die 1D- und 2D-Datenerfassung bis hin zu einer dreidimensionalen Struktur beschrieben.

Abstract

Die Bindung von Kupfer (I) durch Metalllochaperon-Transportproteine verhindert die Kupferoxidation und die Freisetzung von toxischen Ionen, die an schädlichen Redoxreaktionen teilnehmen können. Der Cu(I)-Komplex des Peptidmodells eines Cu(I)-bindenden Metallochaporon-Proteins, das die Sequenz MTCSGCSRPG (unterstrichen ist konserviert) enthält, wurde in Lösung unter inerten Bedingungen mittels NMR-Spektroskopie bestimmt.

NMR ist eine weithin akzeptierte Technik zur Bestimmung von Lösungsstrukturen von Proteinen und Peptiden. Aufgrund der Schwierigkeit bei der Kristallisation, Einkristalle bereitzustellen, die für die Röntgenkristallographie geeignet sind, ist die NMR-Technik äußerst wertvoll, zumal sie Informationen über den Lösungszustand und nicht über den Festkörper liefert. Darin beschreiben wir alle Schritte, die für eine vollständige dreidimensionale Strukturbestimmung mittels NMR erforderlich sind. Das Protokoll umfasst die Probenvorbereitung in einem NMR-Röhrchen, die Erfassung und Verarbeitung von 1D- und 2D-Daten, die Zuweisung und Integration von Peaks, molekularmechanische Berechnungen und die Strukturanalyse. Wichtig ist, dass die Analyse zunächst ohne voreingestellte Metall-Liganden-Bindungen durchgeführt wurde, um eine zuverlässige Strukturbestimmung auf unvoreingenommene Weise zu gewährleisten.

Introduction

Peptide werden häufig als Proteinmodelle, potenzielle Wirkstoffe und eigenständige Therapeutika verwendet. Ihre geringe Größe und ihr hohes Maß an Flexibilität schließen jedoch aufgrund von Schwierigkeiten bei der Kristallisation oft eine Strukturbestimmung durch Röntgenstrahlen aus.

Kernspinresonanz (NMR) kann verwendet werden, um Peptidstrukturen und Wechselwirkungen zu bestimmen. Die Methode kann Informationen über die lokale und Gesamtstruktur, die Bindung und die Wechselwirkungen mit niedrigerer Affinität liefern und ist auf schwierige Proben anwendbar, da sie im Lösungszustand durchgeführt werden kann.

Der Kupfertransport in biologischen Systemen wird durch intrazelluläre Kupfer-Metallochaperon-Proteine erreicht, die spezifisch Cu (I)-Ionen binden und sie durch eine Reihe von Protein-Protein-Wechselwirkungen an ihre Zielproteine abgeben, um die Ionen vor Oxidation zu schützen und die Freisetzung von giftigem Kupfer^2-5 zu verhindern. Die Bindungsstelle ist durch die konservierte Sequenz MXH/TCXanyXanyC gekennzeichnet, von der sowohl durch NMR als auch durch Kristallographie gezeigt wurde, dass sie das Cu(I) durch die weichen Thiolato-Liganden der beiden Cysteinreste bindet, obwohl auch ein zusätzlicher externer Ligand vorgeschlagen wurde^6-8. Die Struktur-Funktions-Beziehung dieser Proteine ist Gegenstand intensiver Forschung⁹.

In der hier vorgestellten Studie wurde ein Peptidmodell, das die konservierte Sequenz von Kupfer-Metallochaperonen enthält, synthetisiert und mit Cu (I) in einer inerten Umgebung umgesetzt. Das vorgestellte Protokoll beschreibt die Schritte der Strukturbestimmung mittels NMR, einschließlich Probenvorbereitung, Datenerhebung, Datenverarbeitung, Strukturgenerierung und Strukturanalyse. Die Analyse erfolgte in zwei Schritten: Es wurden erste Strukturen erzeugt, die keine Informationen über die Art und Weise der Bindung des Peptids an das Kupferion enthielten. Nachdem der Bindungsmodus empirisch etabliert war, wurden diese Einschränkungen eingeführt, um eine hochauflösende Struktur bereitzustellen. Die Art der Bindung ist der wesentliche Punkt im Modell und wurde daher unvoreingenommen bestimmt.

Die NMR-Strukturbestimmung von Modellpeptiden ist eine äußerst wertvolle Technik, die häufig von Chemikern und Biologen verwendet wird. Es kann relativ einfach auf verschiedene Peptide unter verschiedenen Bedingungen angewendet werden und kann somit Licht auf relevante Mechanismen werfen¹⁰. Das Verständnis des Prozesses der Strukturaufklärung ermöglicht ein besseres Verständnis der Stärken und Schwächen der vorgeschlagenen Strukturen.

Protocol

1. Probenvorbereitung

1. Apo-Probe: Lösen Sie etwa 1-2 mg des Peptids in 450-500 μl deuteriertem Lösungsmittel in NMR-Qualität (die bevorzugten Lösungen für biologische Proben sind 10 % D2O in Wasser oder d6-DMSO ^11-12, wenn sich die Probe nicht in Wasser auflöst oder mit Wasser reagiert).
2. Kupfer-reagierte Probe: Lösen Sie etwa 1-2 mg des Peptids mit einer äquimolaren Menge Metallsalz in 450-500 μl des NMR-Lösungsmittels.
3. Filtrieren Sie die Lösung mit einem Sinterglas, Filterpapier oder einer anderen Technik, die für die zu untersuchenden Verbindungen geeignet ist und diese nicht adsorbiert. Dies ist wichtig, um metallische Partikel zu entfernen, die die Homogenität beeinträchtigen.
4. Füllen Sie die Lösung in ein NMR-Röhrchen und verschließen Sie es. Achten Sie darauf, dass die Rohrqualität zur verwendeten Magnetstärke passt (weitere Details siehe Gerätetabelle).
5. Wenn die Probe sauerstoffempfindlich ist, müssen diese Schritte in einer inerten Umgebung durchgeführt und das Röhrchen verschlossen werden, um eine Oxidation zu verhindern.

2. NMR-Datenerfassung und -verarbeitung¹³

1. Aufzeichnung von 1D ^1HSpektren der apo- und kupferreagierten Proben und Vergleich. Das kupferhaltige Peptidspektrum sollte eine signifikante Änderung der chemischen Verschiebung im Amidbereich aufweisen und die Peaks wurden aufgelöst, da das Apo-Peptid flexibel ist und einen Durchschnitt an Konformationen aufweist, aber bei der Reaktion mit Kupfer haben die gebundenen Peptidamide eine einzige Struktur (Abbildung 2).
   1. Wenn das Spektrum unverändert ist, wird davon ausgegangen, dass die Reaktion fehlgeschlagen ist.
   2. Wenn sich die Probe grün färbt, ist das Kupfer in der Atmosphäre oxidiert, was seine Bindungseigenschaften verändern kann.
   3. In beiden Fällen muss die Probe neu erstellt werden.
2. Finden Sie optimale Temperaturbedingungen für die NMR-Messungen, die eine minimale Überlappung der Amidrückstände bei schmalen Linienbreiten ermöglichen.
3. Richten Sie die NMR-Experimente COSY¹⁴, TOCSY¹⁵ und NOESY¹⁶ oder ROESY¹⁷ unter identischen Bedingungen (Temperatur, pH-Wert usw.) ein und laufen Sie nacheinander ab.
   1. Die Experimente COSY (Abbildung 3) und TOCSY (Abbildung 4) werden Durchgangsbindungswechselwirkungen benachbarter bzw. benachbarter Proton-Proton-Wechselwirkungen mit größerer Reichweite nachweisen. Das COSY-Spektrum gibt Auskunft über HN-Hα-Korrelationen, während das TOCSY-Spektrum zusätzlich Informationen über HN und andere aliphatische H-Protonen korrelierter Reste liefert.
   2. NOESY- und ROESY-Experimente (Abbildung 5) weisen die räumliche Nähe ohne Abhängigkeit von Bindungen nach, um strukturelle Informationen zu erhalten. Die Wahl zwischen den beiden hängt von der effektiven Größe der Verbindung und der Feldstärke ab. Einige dieser Kombinationen liefern theoretische Nullsignale (Abbildung 6), und es muss ein ROESY-Experiment durchgeführt werden, um NOE-Wechselwirkungen^{zu erkennen 10,18}.
   3. Wenn sich die Probe in Wasser befindet, müssen die Experimente eine Komponente der Wasserunterdrückung enthalten. Dies wird am effizientesten mit Hilfe der Farbverläufe¹⁹ erreicht. In diesem Fall ist es vorteilhaft, die Probe nach der Zuweisung in reinem D₂O erneut laufen zu lassen, um Wechselwirkungen zu und zwischen den Hα-Wasserstoffatomen zu erhalten.
   4. Optimieren Sie die Dauer der TOCSY- und NOESY- oder ROESY-Mischzeiten, indem Sie eine Reihe kurzer Experimente durchführen, um einen maximalen Signalaufbau mit minimalem Verlust der Spindiffusion zu finden. Stellen Sie sicher, dass dies der lineare Bereich der Aufbaukurve ist. Zu den üblichen Werten für Peptide bei 600 MHz Feldern gehören Mischzeiten von etwa 100 ms für TOCSY und 150 ms für NOESY- oder ROESY-Experimente.
   5. Führen Sie zwischen den einzelnen Experimenten 1D-Experimente durch, um sicherzustellen, dass die Probenzusammensetzung während der gesamten Datenerfassung konstant bleibt (Abbildung 7).
4. Verarbeiten Sie die Spektren mit geeigneten Apodisierungsfunktionen, um eine maximale Auflösung bei minimalem Verlust der Signalstärke zu erhalten, indem Sie die Nullfüllung in der t1-Dimension hinzufügen.
   1. Korrigieren Sie die Grundlinie in der Dimension F2 und dann F1 mit einer quadratischen Polynomfunktion.
   2. Kalibrieren Sie die chemische Verschiebung der Spektren sorgfältig entsprechend der Restwasser- bzw. DMSO-Peaks in den jeweiligen Lösungsmitteln entsprechend ihrer Verschiebung zu bekannten Standards (TMSP bzw. TMS).

3. Peakzuweisung und Integration mit SPARKY²⁰

1. Bereiten Sie einen Satz von COSY- und TOCSY-Spektren vor, die das NOESY- oder ROESY-Spektrum überlagern (Abbildung 8).
2. Ordnen Sie alle NOE-Peaks im Spektrum gemäß der von Wüthrich entwickelten sequentiellen Zuordnungsmethode^{zu 21}.
   1. Beginnen Sie mit der Zuweisung von Peaks, die TOCSY-Signale im Fingerabdruckbereich überlappen, da dies die spätere Eingabe der Peak-Zuweisung mit dem SPARKY-Programm erleichtert (Abbildung 9). Registrieren Sie die Zuordnung der chemischen Verschiebung (Abbildung 10) und ³JHNHα-Werte (Abbildung 11).
3. Übersetzen Sie Peaks in Entfernungsbeschränkungen und ³JHNHα-Werte in Flächenwinkel.
   1. Dies kann erreicht werden, indem die Peaks aus dem Programm integriert und in Entfernungsbeschränkungen übersetzt werden, indem eine Wechselwirkung aus bekannter Entfernung (z. B. der Abstand zwischen zwei Protonen der Methylengruppe oder aromatischen Wasserstoffatomen einer aromatischen Aminosäure)
   verwendet wird.
   2. Wenn sich die Peaks überlappen und Integrationsmethoden nicht verwendet werden können, können sie durch visuelle Schätzung als stark-mittel-schwach-sehr schwach gekennzeichnet werden, und diese Bezeichnungen können in Entfernungen von bis zu 2,5, 3,5, 4,5 bzw. 5,5 Å übersetzt werden. Dies ist am effektivsten bei der Arbeit mit Peptiden.
   3. ³JHNHα-Werte sind Richtwerte für Flächenwinkel gemäß der Karplus-Gleichung, wobei die meisten gegebenen Kopplungswerte aus mehr als einem Flächenwinkel resultieren können. Diese können auf die Sekundärstruktur (Helices oder Bleche), die zufällige Spirale oder deren Konformationsdurchschnitte hinweisen. Daher ist es wichtig, die Randbedingungen vorsichtig zu verwenden oder sie als Bestätigung von Konformationsergebnissen zu verwenden.

4. Molekularmechanische Berechnungen zur Generierung eines Strukturensembles mit XPLOR22

1. Importieren Sie die Abstandsbeschränkungen und Flächenwinkel mit dem richtigen Format für XPLOR. (Abbildung 12, nur Intersidual-Constraints). XPLOR wird den Konformationsraum durchsuchen, um Strukturen zu finden, die zusätzlich zu den experimentell gefundenen Abstandsbedingungen kanonischen geometrischen chemischen Nebenbedingungen wie Bindungslängen, Winkeln, Chiralität usw. entsprechen, um ein Ensemble zu erzeugen, in dem keiner der oben genannten Parameter verletzt wird. Dieses bildet das Ausgangsensemble.
2. Der erste Lauf zur Strukturbestimmung erfolgt ohne Abhängigkeiten für das Metall. So kann ohne Bias gezeigt werden, welche Rückstände an der Metallbindung beteiligt sind. Fahren Sie mit Schritt 4.4 fort.
3. Zusätzlich zu den NMR-abgeleiteten Abstandsbeschränkungen fügen Sie den ermittelten Resten Metallbindungsbeschränkungen hinzu.
   1. Fügen Sie geeignete Parameter hinzu, um das Metallion und seine Topologie zu beschreiben.
   2. Die entsprechenden physikalischen Informationen (Masse, Bindungslängen mit anderen Atomen, Winkel und nicht bindende Abstoßungsparameter) müssen in die Parameterdatei eingegeben werden.
   3. Fügen Sie der Topologiedatei die Bindungsinformationen hinzu: Welche Bindungen gebildet und unterbrochen werden und welche formalen Ladungen als Ergebnis der Bindung geändert werden.
4. Erstellen Sie ein kleines Ensemble von in der Regel 10 Mitgliedern.
   1. Führen Sie die Einschränkungen schrittweise ein, beginnend mit Backbone-zu-Backbone-Interaktionen, dann Backbone-zu-Sidechain-Interaktionen, dann Sidechain-zu-Sidechain-Interaktionen und von intraresidualen, sequenziellen zu zunehmend weitreichenden Interaktionen. Dies erleichtert das Erkennen von Fehlern bei der Zuordnung.
   2. Die NOE-Energie wird als Rechteckpotential mit einer konstanten Kraftkonstante von 50 kcal/mol•Å² eingeführt. Das simulierte Glühen sollte mit 1.500 3-fsec-Schritten bei 1.500 K und 3.000 1-fsec-Schritten während des Abkühlens auf 500 K durchgeführt werden. Minimieren Sie schließlich die Strukturen mit Hilfe der Energieminimierung des konjugierten Gradienten für 4.000 Iterationen. Dies sind Variablen, die innerhalb von XPLOR geändert werden können.
5. Erstellen Sie ein endgültiges Ensemble von in der Regel 50 Mitgliedern. Führen Sie die Schritte aus Schritt 4.4 für das gesamte Ensemble aus.
   1. Geben Sie die Anzahl der einzelnen Arten von NOE-Wechselwirkungen an, die gefunden wurden, wie in Abbildung 13 dargestellt.
6. Erstellen Sie ein Ensemble von Strukturen, die sich an die kanonische chemische Geometrie und die empirischen NMR-abgeleiteten Einschränkungen halten.
   1. Geben Sie die Gesamtzahl der Konformationen, die Anzahl dieser Konformationen mit Verletzungen der NMR-abgeleiteten Einschränkungen und den RMSD des gesamten Ensembles, sowohl des Rückgrats als auch aller RMSD-Werte für schwere Atome an.

5. Strukturanalyse

1. Das gelöste Ensemble stellt den Konformationsraum dar, den das Peptid während der NMR-Messung einnimmt. Die lokale Flexibilität kann sich in verschiedenen Regionen des Moleküls ändern, was auf strukturelle oder funktionelle Gründe zurückgeführt werden kann (der Zweck der Strukturanalyse besteht darin, die strukturelle Basis für die Stabilität und den Wirkmechanismus zu bestimmen).
   1. Importieren Sie alle Konformationen der Struktur in das MolMol-Programm23, um ein Startensemble zu erstellen (Abbildung 14).
2. Untersuchen Sie das Ensemble, um die lokale Stabilität des Moleküls zu bestimmen.
   1. Bestimmen Sie die RMSD-Werte für das Backbone und die Sidechain, indem Sie nachfolgende Bereiche mit vier Resten entlang der Sequenz auswählen und das Programm den RMSD auf die niedrigste Energiestruktur oder den Mittelwert berechnen lassen.
   2. Bestimmen Sie, welche Regionen des Moleküls lokale Stabilität aufweisen (Abbildung 15), indem Sie den lokalen RMSD als Funktion der Sequenz darstellen.
   3. Überlagern Sie das Ensemble entlang dieser Region des Moleküls und verwenden Sie dieses Ensemble für die weitere Analyse (Abbildung 16).
3. Wählen Sie Konformationen mit niedriger Energie, die den NMR-abgeleiteten Einschränkungen entsprechen (nicht verletzt). Diese bilden das “Niedrigenergie-Ensemble”.
   1. Anzugeben sind die Anzahl der Konformationen im Ensemble, die Kriterien für deren Auswahl und die RMSD-Werte, wie in Schritt 4.6.1 definiert.
   2. Wenn der Metallbindungsmodus bereits bestimmt wurde, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Ansonsten: Analysieren Sie das niederenergetische Ensemble und bestimmen Sie, welche Restseitenketten in korrekter Nähe zueinander stehen, um das Metallion binden zu können. Sobald diese bestimmt wurden, gehen Sie zurück zu Schritt 3.3 und wiederholen Sie die Analyse einschließlich der Kupferbindungsdaten (Abbildung 17 für das Ensemble und Abbildung 18 für das Konformer mit niedriger Energie).
4. Untersuchen Sie das Ensemble und bestimmen Sie die lokale Sekundärstruktur innerhalb des Moleküls mit den Standardsuchparametern des MolMol-Programms. Sekundärstrukturen werden durch Wasserstoffbrückenbindungen gehalten und weisen auf stabile Bereiche des Moleküls hin.
   1. Bestimmen Sie die Sekundärstruktur jedes Konformers (Abbildung 19).
      1. Erstellen Sie eine Tabelle mit dem Prozentsatz der Konformeren des Ensembles, die die einzelnen Sekundärstrukturen anzeigen.
      2. Bestimmen Sie, ob die Bereiche der Sekundärstruktur die Bereiche überlappen, die durch local-RMSD als stabile Bereiche bestimmt wurden. Dies ist häufig der Fall.
5. Bestimmen Sie Abstände und Wasserstoffbrückenbindungen innerhalb des Moleküls.
   1. Importieren Sie das Ensemble in Chimera²⁴.
   2. Verwenden Sie Chimera, um intramolekulare Abstände zwischen Atomen zu bestimmen, bei denen der Verdacht auf Metallbindung besteht. Berechnen Sie die durchschnittlichen Entfernungen im Ensemble.
   3. Verwenden Sie Chimera, um intramolekulare Wasserstoffbrückenbindungen in jedem Konformer des Ensembles zu bestimmen (Abbildung 20), wobei die standardmäßigen gelockerten Wasserstoffbrückenbrückenparameter (um 20%) des Programms verwendet werden.
   4. Erstellen Sie eine Tabelle mit dem Prozentsatz der Konformere des Ensembles, die jede Wasserstoffbrückenbindung anzeigen. Wasserstoffbrückenbindungen, die in einem Großteil der Konformationen wiederkehren, deuten auf eine stabile Bindung hin, die zur Stabilität der Struktur beiträgt.
6. Bestimmen Sie elektrostatische Wechselwirkungen innerhalb des Moleküls.
   1. Identifizieren Sie Wechselwirkungen zwischen geladenen Sidechains.
   2. Erstellen Sie eine Tabelle mit dem Prozentsatz der Konformere des Ensembles, die jede elektrostatische Wechselwirkung anzeigen.
7. Berechnen Sie die elektrostatische Potentialverteilung mit dem Kraftfeld Amber²⁵ innerhalb des Programms Delphi²⁶.
   1. Wählen Sie eine einzelne repräsentative Konformation aus dem Ensemble aus, an der die Berechnungen des elektrostatischen Potentials durchgeführt werden sollen.
   2. Leiten Sie das elektrostatische Potential unter Verwendung der Poisson-Boltzman-Gleichung und einer vollständigen Coulomb-Berechnung ab. Zu den erforderlichen Parametern gehören die Ionenstärke der Lösung, die dielektrischen Werte der Lösung (80 für Wasser; 40 für DMSO); das interne Peptid (normalerweise um 5,0); die Grösse des Rasters (in der Regel 65’65’65 Punkte); und der minimale Abstand zwischen dem Peptid und dem Rand des Gitters (10 Å). Die Ergebnisse sind in Bezug auf diese Werte in der Regel recht robust, da das Hauptergebnis vom Peptid selbst bestimmt wird (Abbildung 21).
   3. Untersuchen Sie das elektrostatische Potential, das auf der Van-der-Waals-Oberfläche des Peptids abgebildet ist (Abbildung 22).
   4. Untersuchen Sie die elektrostatischen Potential-Iso-Oberflächen, die Positionen mit gleichem Potential beschreiben. Finden Sie Isooberflächen, die auf biologische Relevanz hindeuten, wie z. B. ausgedehnte positive oder negative Oberflächen, die andere Proteine oder Liganden anziehen oder abstoßen könnten, oder Verteilungen, die auf Signifikanz hinweisen, wie z. B. amphipathische Verteilung oder Flecken mit unterschiedlichen Eigenschaften (Abbildung 23).
8. Fassen Sie alle strukturellen Erkenntnisse zusammen, um zu sehen, wie sie sich gegenseitig verstärken.
9. Wiederholen Sie gegebenenfalls die Schritte 4.3 bis 5.7.4.

Representative Results

Discussion

The contribution of structural information to understand binding mechanisms is well-accepted. Peptides are useful as models for protein binding and interactions; however they are not amenable to the main method for structure determination, X-ray crystallography. NMR is particularly useful for these systems, since the structures can be readily solved in solution. This is especially for the case of metallochaperone-mimetics that additionally require structure determination under an inert environment to prevent oxidation of the metal ion.

The MTCSGCSRPG peptide, containing the conserved MT/HCXXC motif, bound Cu (I) as was evident by the significant change of spectrum from the apo-form to the peptide reacted with copper. The need for a ROESY experiment at the field of 600 MHz, due to a spectrum with null interactions in the NOESY spectrum, indicates a compact peptide, since our experience shows that smaller peptides of 6-7 residues fall in the null signal of the NOESY regime, but peptides of this size usually give adequate signal. In the ROESY spectrum 81 cross-peaks were observed, N of these were inter-residue cross-peaks and (81-N) were intra-residue cross-peaks. This is a small number of peaks compared to proteins, but is expected in small peptides; Particularly cyclic peptides, which tend to give a small number of interactions since all the sidechains point outward and undergo little interaction with one another.

As the metal itself cannot be detected directly by the ¹H NMR measurements, one must conclude on the metal binding residues from the distances obtained between suspected donor atoms. To assure a reliable structure, no metal-ligand binding constraints should be added to the initial calculations. Previous studies have shown that forcing metal binding in an incorrect form may still lead to reasonable structural factors even if the structure is incorrect¹⁰.

The experiments gave highly nonviolated conformations in an ensemble of low RMSD. The low RMSD of a potentially flexible peptide lends further support for copper binding, which would reduce the conformational flexibility of the molecule. The RMSD values of the binding region were reduced to values around 0.05 Å, which shows tremendous stabilization as expected by the ring closure. The secondary bend and hydrogen-bonding found in the 3-7 region, also indicated binding in this region.

The negative charge obtained when two thiols bind the copper (I) peptide is offset by the N-terminal amine that was held proximate to the bound copper.

When inspecting the resulting distances between potential donor atoms, including the two cysteine residues and the methionine group, the ones located at positions most probable to bind metal were the sidechains of Cys3 and Cys6. Therefore, binding constraints were added between these residues and the metal center, and the resulting structure was evaluated. To further support the resulting structure, various additional control measurements that include preset bonds to other residues may be performed and the structural factors compared. This is especially important where the result of the model is unexpected. In previous studies using similar measurements using protein-mimetic peptides, unusual binding modes were observed, including methionine instead of cysteine⁷.

Excess copper is toxic to biological systems and copper transport is very tightly controlled. Therefore, it is interesting and mechanistically important to understand how copper is transferred from one protein to another. The transport cannot depend on simple release and acquire mechanism, but must somehow include both stronger and weaker modes of binding, much like how one would transfer an object carefully from the fingers of one hand to another. This type of study provides much information regarding the mechanism of copper binding in biological systems and can be used to further investigate many different aspects of metallochaperone activity in nature. The systems may be easily mutated and manipulated to mimic many different aspects of copper-binding in nature, and may be analyzed without using prior assumptions of the binding mode.

Materials

Avance DMX 600 MHz Spectrometer	Bruker
NMR sample tubes 	Wilmad	535-PP
Glove box	MBraun	LM05-019
Lyophilizer  	VirTis	benchtopK
Peptide	BioChemia	Custom made	>95% purity
Copper (1) chloride	Aldrich	224332
Hydrochloric acid	BioLab	231-595-7
Sodium hydroxide	Gadot	1310-73-2
d<sub>6</sub>-Dimethylsulfoxide	Aldrich	236926
Deuterium oxide	Aldrich	151882