Hier beschreiben wir ein in-vivo-Mutagenese-Assay für eine kleine Anzahl von gereinigten hämatopoetischen Zellen unter Verwendung des lacI transgenen Mausmodell. Die LacI Gen isoliert, um die Häufigkeit, Ort und Art der DNA-Mutanten entstanden spontan oder nach der Exposition zu Genotoxinen bestimmen.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Identifizierung von DNA-Mutationen in hämatopoetischen Stammzellen Gereinigtes / Vorläuferzellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
In den letzten Jahren hat es sich gezeigt, dass genomische Instabilität fest mit vielen Entwicklungsstörungen, Krebs und Alterung. Da die Stammzellen für die Gewährleistung Gewebshomöostase und Reparatur des gesamten Lebens verantwortlich sind, ist es vernünftig zu vermuten, dass die Stammzellpopulation ist für die Erhaltung der genomischen Integrität der Gewebe. Deshalb hat großes Interesse an der Beurteilung der Auswirkungen von endogenen und Umweltfaktoren auf die genomischen Integrität in Stammzellen und deren Nachkommen, mit dem Ziel, die Ätiologie der Stammzellen basierte Krankheiten zu verstehen entstanden.
LacI transgenen Mäuse tragen eine erzielbare λ-Phagenvektor lacI-Reportersystems, wobei das lacI-Gen dient als Reporter-Mutation kodiert. Das Ergebnis einer mutierten lacI-Gen ist die Herstellung von β-Galactosidase spaltet ein chromogenes Substrat, Drehen blau. Die LacI Reportersystem ist durch in alle Zellen, einschließlich Stammzellen / Vorläuferzellen und können problemlos wiederhergestellt und verwendet werden, um anschließend zu infizieren E. werden coli. Nach Inkubation infizierten E. coli auf Agarose, die das richtige Substrat enthält, können Plaques erzielt werden; blaue Plaques zeigen eine Mutante LacI Gen, während klare Plaques Hafen-Wildtyp. Die Häufigkeit von blau (unter klar) Plaques zeigt die Mutationsrate in der ursprünglichen Zellpopulation wurde die DNA extrahiert aus. Sequenzierung der mutierten lacI-Gen wird die Position der Mutationen in dem Gen, und die Art der Mutation anzuzeigen.
LacI transgenen Mausmodell wird als ein in vivo-Mutagenese-Assay etabliert. Außerdem werden die Mäuse und die Reagenzien für den Assay sind im Handel erhältlich. Hier beschreiben wir detailliert, wie dieses Modell geeignet ist, die Frequenz von spontan auftretenden DNA-Mutanten in Stammzell-angereichertem Lin messen - IL7R - Sca-1 + + + cKit (LSK) Zellen und anderen Subpopulationen des hämatopoetischen Systems.
Einleitung
In den meisten Geweben, differenzierte Zellen haben eine begrenzte Lebensdauer. Um funktionale Integrität zu erhalten, langlebig, gewebespezifische Stammzellen kontinuierlich Vorläuferzellen, die wiederum führen zu den ausdifferenzierten Zellen, die für die Funktion des jeweiligen Gewebes erforderlich. Stammzellen ihre eigene Fach durch einen Prozess namens Selbsterneuerung auch wieder aufzufüllen. So, für die Aufrechterhaltung der Funktionsfähigkeit des Gewebes, sie wohnen in. Deshalb verantwortlich sind Stammzellen, ist es unerlässlich, dass sie mit robusten Mechanismen ausgestattet, um zu erfassen und möglicherweise reparieren beschädigte DNA. Wenn nicht, können s....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Leukozyten aus LacI transgenen Mäuse auf einer C57BL / 6 Hintergrund nicht exprimieren Sca-1 (Abbildung 1). Deshalb, wenn Sca-1 ist ein Marker für Zellreinigung verwendet wird, müssen diese Mäuse mit einer entsprechenden Belastung für Sca-1-Expression zu gewinnen gekreuzt werden, in diesem Protokoll die F1 einer Kreuzung zwischen normalen C57BL / 6 (B6) Mäuse und LacI (C57BL / 6)-transgenen Mäusen (lacI) verwendet wurde (Fig. 1). Von den Zellpopulationen in diesem Protokoll verwendet, und LSKS CMPs stellen die kleinsten Populationen im Knochenmark. Um zu reinigen, mindestens 2 x 10 je 5 / Art, ko....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Die in vivo-Mutagenese-Assay misst eine seltene Ereignis (Mutante PFUs) unter vielen Ereignissen (alle PFUs). Durch Durchführen des Assays mit einer kleinen Anzahl von Zellen ist es möglich, dass das Ergebnis erheblich falsch-positive und falsch-negative Ergebnisse beeinflusst. Um dieses Problem zu adressieren wir führten eine serielle Verdünnungsexperiment mit unfraktioniertem Knochenmarkzellen, aus drei verschiedenen Tieren geerntet. Wir maßen die Mutationsrate in dem Knochenmark der Tiere mit 1,4 × 10 .......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Die hierin beschriebenen in-vivo-Mutagenese-Assay basiert auf der ursprünglich von 18 Dieses Modell verwendet einen λ-Phagenvektor, der eine lac-Reportergens Kohler et al. Erzeugt LacI transgenen Mausmodell. Die beiden cos-Stellen flankieren die Vektor ermöglichen eine relativ einfache Rückgewinnung und anschließende Verpackung in infektiöse Phagenpartikel, verwendet, um E. infizieren coli. Eine blaue Plakette wird durch Phagen-infizierten E.<.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Danksagungen
Wir möchten David R. Rodriguez, MA für die Grafik-Design und Fotografie in diesem Manuskript danken. Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem GCCRI, dem NIH / NIA (5R21AG033339) und dem Cancer Center Support Grant (P30CA054174) an die UTHSCSA Durchflusszytometrie Core-Anlage und der UTHSCSA Erweiterte Nucleic Acids Core Facility unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| LacI transgene Mäuse | BioReliance Corporation | ||
| RecoverEase DNA-Isolationskit, einschließlich des RNace-It-Ribonuklease-Cocktails | Agilent Technologies (Stratagene) | 720202 | |
| Transpack-Verpackungsextrakt, einschließlich der orangefarbenen und blauen Transpack-Röhrchen und der SCS-8 E. coli | Agilent Technologies (Stratagene) | 200221 | |
| DNA-Größenstandards – Lambda-Leiter | Bio Rad | 170-3635 | |
| 0,025 mM Membranen mit Porengröße | Fisher (Millipore) | VSWP 025 00 | |
| 245 mm2 Bioassay-Schalen (Tabletts) | Fisher (Corning) | 07-200-600 | |
| NZY Bouillon (Pulver) | Fisher (Teknova) | N1144 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| Agarose | Fisher | E-3120-500 | |
| N,N-Dimethylformamid | Fisher | AC34843-5000 | |
| X-gal | Research Products Intl Corp (RPI) | B71800-10.0 | |
| Proteinase K | Roche | 3-115-852 | |
| PCR Extender Taq Polimerase Kit | 5 PRIME | 2200500 | |
| Agencourt AMPure XP Aufreinigungskit | Beckman/Coulter | A63880 |
Referenzen
- Maslov, A. Y., Vijg, J. Genome instability, cancer and aging. Biochim. Biophys. Acta. 1790 (10), 963-969 (2009).
- Aguilera, A., Gomez-Gonzalez, B. Genome instability: a mechanistic view of its causes and consequences. Nat. Rev. Genet. 9 (3), 204-217 (2008).
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
