Isolierung und Differenzierung von Th17 Naive CD4-T-Lymphozyten

Zusammenfassung

Mit Effektor-Funktionen deutlich von anderen T-Zell-Untergruppen, Th17-Zellen wurden zentral bei entzündlichen Autoimmunerkrankungen in Verbindung gebracht. Diese in vitro-Differenzierung Th17-Protokoll bietet die Möglichkeit, festzustellen, ob naiven CD4 +-T-Lymphozyten in Th17-Zellen zu differenzieren und ihre Rolle in der Autoimmun-und Wirtsantwort weiter zu prüfen.

Zusammenfassung

Th17-Zellen sind eine eindeutige Untergruppe von T-Zellen, die gefunden wurden, Interleukin 17 (IL-17), und unterscheiden sich in Abhängigkeit von den anderen T-Zell-Subpopulationen einschließlich Th1, Th2 und regulatorischen T-Zellen. Th17-Zellen als zentrale Täter in übereifrigen entzündlichen Immunreaktionen bei vielen Autoimmunerkrankungen assoziiert entstanden. Bei dieser Methode reinigen wir T-Lymphozyten aus der Milz und den Lymphknoten von C57BL / 6 Mäusen, und fördern gereinigten CD4 + T-Zellen unter Kontrolle und Th17-induzierende Umgebung. Die Th17-induzierende Umgebung umfasst Stimulation in Gegenwart von Anti-CD3 und Anti-CD28-Antikörper, IL-6 und TGF-β. Nach einer Inkubationszeit von mindestens 72 Stunden und für bis zu fünf Tage bei 37 ° C werden die Zellen anschließend für die Fähigkeit, IL-17 durch die Strömung zu erzeugen Zytometrie, qPCR und ELISAs analysiert. Th17 differenzierten CD4 + CD25-T-Zellen können genutzt werden, um weitere Aufklärung der Rolle, die Th17-Zellen bei der Entstehung und Progression von Autoimmun-und Host-de spielenfense. Darüber hinaus können Th17 Differenzierung von CD4 + CD25-Lymphozyten aus unterschiedlichen murinen Knockout / Krankheitsmodelle zu unserem Verständnis des Zellschicksals Plastizität beitragen.

Einleitung

CD4 +-T-Lymphozyten (T-Zellen) spielen eine entscheidende Rolle bei der Immunsystem-vermittelte Abwehr gegen infektiöse Mikroorganismen. Umgekehrt T-Zellen sind auch eng mit dem Auftreten und Fortschreiten von Autoimmunkrankheiten wie Typ-1-Diabetes, systemischer Lupus erythematodes und rheumatoide Arthritis. CD4 +-T-Lymphozyten aktiviert werden durch eine Kombination von T-Zell-Rezeptor (TCR)-Wechselwirkungen mit verwandten Antigen / II-Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC II)-Moleküle, und CD28-Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen mit B7.1/B7.2 ^15. Neben der Bereitstellung der TCR-Stimulation und CD28-Co-Stimulierung, Antigen-präsentierende Zellen zudem e....

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Protokollen der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss genehmigt durchgeführt.

1. Herstellung von Mischungen und Medien

1. Sterile PBS pH 7,3 (1 l)
   0,23 g NaH ₂ PO ₄
   1,15 g Na ₂ HPO ₄
   9,0 g NaCl
   Nehmen Sie Volumen mit DI-Wasser. Sterilisieren mit Autoklaven.
2. Zellkulturmedium (100 ml)
   89 ml RPMI
   10 ml 10% FBS
   1 ml Antibiotika-Antimykotika (ABAM) 100 ug 50 mM 2-Mercaptoethanol (3,5 ug Lager 2-Mercaptoethanol in 96,5 ug ....

Ergebnisse

Diese Th17 Differenzierung Protokoll beginnt mit der Entnahme der Milz und dem Achsel, brachialis, mesenterialen, Gebärmutterhalskrebs und inguinalen Lymphknoten. Eine Darstellung der Orte der jeweils in den Fig. 2 und 3 entnommen werden. Fig. 1 und 5 sowohl eine visuelle Darstellung der in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren.

Diese Th17-Protokoll konzentriert sich auf die Differenzierung von CD4 + CD25-T-Lymphozyten-Population. Es ist .......

Diskussion

Hier haben wir das Protokoll, das in vitro Th17 Differenzierung zu erreichen beschrieben. Die Studie von Th17 Differenzierung wichtig ist, die Differenzierung von T-Lymphozyten in das Th17 Menge ist für die wirksame Eliminierung von menschlichen Pathogenen ^13. Umgekehrt hat IL17-Produktion mit Autoimmunkrankheitsverlauf ¹³ in Verbindung gebracht. Das Verfahren von Th17 Differenzierung ist für viele Forschungseinstellungen, wie es zahlreiche verschiedene murine Modelle der Immunregulation u.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Reagenz/Material
Sterile Petrischale aus Polyestrene	Fisher Scientific	0875713A	60 mm x 15 mm
autoMACS Laufpuffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
Premium Objektträger, mattiert	Fisher Scientific	12-544-3	3" x 1"1 mm
5 ml 21G1 latexfreie Spritze und Nadel	BD Biosciences	309632
Corning 15 ml Zentrifugenröhrchen	Sigma-Aldrich	CLS430791
Nylon 40 Mikrometer	Miami Aquakultur	Nylon 40/26
Microtest Gewebekulturplatte 96 Well U Boden	BD Biosciences	35-3077
Corning Costar 24 Well Zellkulturplatten	Sigma-Aldrich	CL3524
Eppendorf Tubes 1,5 ml	Fisher Scientific	05-408-129
Gereinigtes NA/LE Hamster Anti-Maus CD3e	BD Biosciences	553057
Gereinigtes NA/LE Hamster Anti-Maus CD28	BD Biosciences	553294
Maus IL-6 Rekombinantes Protein	eBioscience	14-8061-62
TGFbeta	R& D Systems	240-B-002
Trypanblau-Lösung 0,4 %	Sigma-Aldrich	66H2364
Pac Blaue Ratte Anti-Maus CD4	BD Biosciences	558107
APC Ratte Anti-Maus CD8a	BD Biosciences	553035
PE Konjugierte Anti-Maus CD25	eBioscience	E01155-516
Alexa Fluor 700 Ratte Anti-Maus IL-17	BD Biosciences	560820
Starter-Kit für intrazelluläre Zytokin-Färbung - Maus	BD Biosciences	51-2041AK (559311)
MACS CD4+CD25+ regulatorisches T-Zell-Isolationskit, Maus	Miltenyi Biotec	130-091-221
ABAM	Cellgro	30-004-CI
RPMI	Corning, Cellgro	10-040-CM
B 2-Mercapt– thanol	MP Biomedical	194834	Gefährliches
Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA)
Ionomycin Calciumsalz	Sigma-Aldrich	13909-1ML	Gefährliches
Brefeldin A (BFA)	MP Biomedicals	159027
ELISA IL-17A Capture mAb	BD Biosciences	555068
ELISA IL-17A Nachweis mAb	BD Biosciences	555067
ELISA IL-17A Standard	eBioscience	14-8171-80
IL-2 ELISA Kit	BD Biosciences	555148
TMB Substrat Reagenzienset	BD Biosciences	555214
Equipment
autoMACS Pro Zellseparator	Miltenyi Biotec	130-092-545
Sorvall Legend RT+ Zentrifuge	ThermoScientific
Napco Serie 8000 WJ CO2-Inkubator	ThermoScientific
PTC-200 Peltier Thermocycler	Biorad