Zellbasierte Assay-Protokoll für die prognostische Prognose der idiopathischen Skoliose Mit Cellular dielektrischer Spektroskopie

Zusammenfassung

Eine strukturierte Protokoll für ein Assay auf Zellbasis als Funktionstest zur Vorhersage der idiopathischen Skoliose vorher mit Mobil dielektrischen Spektroskopie (CDS) dargestellt. Der Assay kann mit frischem oder gefrorenem peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) durchgeführt werden und das Verfahren wird in 4 Tagen abgeschlossen.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die experimentelle und analytische Verfahren für einen Assay auf Zellbasis in unserem Labor als Funktionstest zur Vorhersage der idiopathischen Skoliose bei asymptomatischen betroffenen Kinder und vorauszusagen. Der Test besteht aus der Bewertung der Funktionszustand und Gi Gs-Proteine ​​in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs), die durch Mobil dielektrischen Spektroskopie (CD), unter Verwendung eines automatisierten CDS-basierten Instrument und die Klassifizierung von Kindern in drei Funktionsgruppen (FG1 , FG2, FG3) in Bezug auf das Profil des Ungleichgewichts zwischen dem Grad der Reaktion auf und Gi Gs-Proteine ​​Stimulation. Die Klassifizierung wird durch die unterschiedliche Wirkung von Osteopontin (OPN) auf Reaktion auf Stimulation Gi zwischen Gruppen und die starke Progression der Krankheit wird durch FG2 verwiesen bestätigt. Ungefähr wird ein Volumen von 10 ml Blut benötigt, um PBMCs durch Ficoll-Gradienten und Zellen extrahiert werden dann in flüssigem Stickstoff gelagert. Die ausreichende Anzahl von PBMC zur Durchführung des Assays nach zwei Tagen Zellkultur erhalten. Im Wesentlichen werden die Zellen zunächst mit phytohemmaglutinin (PHA) inkubiert. Nach 24 h Inkubation wird das Medium durch eine PHA-freien Kulturmedium für zusätzliche 24 Stunden vor der Zellaussaat und OPN-Behandlung ersetzt. Zellen werden dann spektroskopisch ihre Reaktionen auf Somatostatin und Isoproterenol, die jeweils zu aktivieren und Gi Gs-Proteine ​​durch ihre verwandten Rezeptoren gescreent. Sowohl Somatostatin und Isoproterenol gleichzeitig mit integrierter Fluidik-System injiziert und die Reaktionen der Zellen werden für 15 min überwacht. Der Assay kann mit frischem oder gefrorenem PBMCs durchgeführt werden und das Verfahren wird in 4 Tagen abgeschlossen.

Einleitung

Idiopathische Skoliose ist eine Fehlstellung der Wirbelsäule unbekannter Ursache in der Regel als eine seitliche Krümmung größer als 10 Grad begleitet von einer Wirbelrotation ¹ definiert. Die Krankheit betrifft 4% der pädiatrischen Population und wird am häufigsten im Alter zwischen 9 und 13 Jahren zwischen ^2,3,4 diagnostiziert. Die Diagnose ist in erster Linie der Ausgrenzung und erst nach Ausschluss anderer Ursachen von Wirbelsäulenverformung, wie etwa Wirbelfehlbildung, neuromuskuläre Erkrankungen oder syndromale gemacht. Traditionell wird die trunkal Asymmetrie von Adams Vorbeugen Test ergab, und mit Skoliometer während der körperlichen Prüfung ⁵ gemessen. Die Diagnose kann dann durch radiologische Beobachtung der Kurve und der Winkelmessung unter Verwendung des Cobb-Methode ⁶ bestätigt werden.

Einmal diagnostiziert, ist das Hauptanliegen für Ärzte in der Verwaltung skoliotischen Kinder, ob die Kurve weiter voran. Tatsächlich ist der Kurvenverlauf oft unvorhersehbar undist häufiger bei Mädchen als bei Jungen beobachtet, ^7. Wenn unbehandelt, kann die Kurve dramatisch fortschreiten, wodurch erhebliche körperliche Missbildung und sogar Herz-Lungen-Probleme. Diese Manifestationen lebensbedrohlich werden, wenn die Kurve 70 ° ^8,9 übersteigt. Die aktuellen Behandlungsmöglichkeiten zu verhindern oder zu stoppen Kurvenverlauf sind Verstrebungen und Chirurgie. In der Regel ist für die Reizkurven zwischen 25-40 ° empfohlen, während der Operation ist für Kurven größer als 45 ° oder reagieren nicht auf Verstrebungen vorbehalten.

Ungefähr 10% der Kinder mit idiopathischer Skoliose diagnostiziert Kurvenverlauf erfordern korrigierende Eingriffe ^10. Derzeit gibt es keine bewährte Methode oder Test zur Verfügung, um diese Kategorie von Patienten zu identifizieren. Dementsprechend werden alle Kinder diagnostiziert, mehrere Röntgenaufnahmen über mehrere Jahre unterzogen, in der Regel, bis sie Skelettreife zu erreichen. Es wird geschätzt, dass die typischen Patienten mit Skoliose wirdetwa 22 radiologischen Untersuchungen über einen Zeitraum von 3 Jahren ^11. Wegen der möglichen Gefahr der Mehrfachröntgenuntersuchungen, die alternative Ansätze, durch die Durchführung der Prognose der idiopathischen Skoliose ohne dass Kinder auf ionisierende Strahlung sind stark erwünscht. Mit der Absicht, diesen Bedarf haben wir vorher eine zellbasierte Screening-Test entwickelt als prognostischer Test, um die asymptomatischen Kindern früher erkennen die Gefahr der Entwicklung idiopathischen Skoliose. Der Test sagt die klinischen Ergebnisse in beiden betroffenen Kinder asymptomatisch und durch Untersuchung der Funktionszustand der Gi-Proteine ​​und Klassifizieren von Kindern in drei Funktionsgruppen (FG1, FG2 und FG3) entsprechend dem Grad der maximalen Reaktion auf Stimulation ¹² Gi-Protein, wie durch CDS gemessen -basierten System. Dieses System wird weitgehend verwendet, um die Signaltransduktion durch G-Proteine ​​in verschiedenen Zelltypen ^13,14,15,16 beurteilen. Es liefert Informationen über dieGesamt integriert Reaktion der Zellen auf die Außenreize durch Messen von Änderungen in der Impedanz nach der Aktivierung von Zelloberflächenrezeptoren. Zellen werden in Mikrotiterplatten ausgesät, die Elektroden enthalten, am Boden der Vertiefungen und das System legt eine kleine Spannung, die extrazelluläre und trans Ströme induzieren. Nach Injektion der Verbindung in den Brunnen, sind Zelloberflächenrezeptoren stimuliert und Signaltransduktion Ereignisse eintreten, die zu zellulären Veränderungen, die den Fluss von extrazellulären und transzellulären Ströme beeinflussen und damit die gemessene Größe beeinflussen. Mit diesem Ansatz werden die Skoliosepatienten und Kinder ein höheres Risiko der Entwicklung von Skoliose sind weniger auf Gi-Protein Stimulation, wenn sie mit gesunden Kontrollpersonen verglichen und die Einstufung auf dem Prozentsatz der Reduktionsgrad relativ zur Kontrollgruppe basiert. Die Klassifizierungsbereiche sind zwischen 10 und 40% für FG3, 40 und 60% für FG2, und 60 und 90% für FG1 ¹² befestigt.

In jüngerer Zeit haben wir diesen Ansatz zeigt, dass die drei funktionellen Gruppen eindeutig entsprechend dem Profil des Ungleichgewichts zwischen Abhängigkeit und Gi Gs Stimulation unterschieden werden modifiziert. Tatsächlich fanden wir, dass als Reaktion auf Stimulation Gi überwog in FG3, während keine offensichtliche Ungleichgewicht in FG2 beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigten FG1 Vorherrschaft für die Reaktion auf Gs Stimulation. Darüber hinaus haben wir den Beweis, dass die Patienten FG2 gehören, sind mehr an der Gefahr der fortschreit bis zur Operation benötigen ¹⁷ vorgesehen. Die Präzision dieser Einstufungstest weiter durch den Nachweis einer Differenz Wirkung von Osteopontin (OPN) auf Gi Reaktion auf Stimulation unter funktionellen Gruppen verbessert.

Hier dokumentieren wir die einzelnen Schritte der experimentellen und analytischen Verfahren dieser Funktionsprüfung, wie sie derzeit in unserem Labor durchgeführt.

Protokoll

Das gesamte Verfahren wird unter sterilen der biologischen Haube ausgeführt und alle Lösungen und Geräte in Kontakt mit Zellen müssen steril sein.

1. Vorbereitung wichtiger Lösungen

1. Werden die Lösungen gemäß Tabelle 1.
2. Halten ausgewogene Salzlösung (BSS) bei Raumtemperatur und allen anderen Lösungen bei 4 ° C bis zum Zeitpunkt der Verwendung.
3. Warm kalt Medien auf 37 º C im Wasserbad für einige Minuten vor der Verwendung.

2. Vorbereitung und Lagerung von PBMCs

1. Sammeln Sie 10 ml Vollblut in EDTA-behandelten Sammelröhrchen zu zwei Teilmengen von PBMCs vorbereiten mit 5 ml für jedes Aliquot.
2. Übertragungs 5 ​​ml Vollblut aus der EDTA-behandelte Sammelröhrchen in ein 50 ml Röhrchen.
3. Gleiches Volumen von BSS und mischen Probe durch vorsichtiges Pipettieren auf und ab.
4. Platz 3 ml Ficoll in zwei 15 ml Falcon-Röhrchen.
5. Vorsichtig Schicht 4,5 mlvon Blut-Gemisch verdünnt über den Ficoll in jeder Röhre.
6. Lassen Sie die Röhrchen Ruhe für bis zu 5 min, um eine klare Trennung von Blut und Ficoll begünstigen.
7. Zentrifugieren der Röhrchen bei 400 × g für 30 min bei Raumtemperatur ohne Bremse.
8. Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge zu entfernen, um die Schichtung nicht stören. Die PBMCs sind an der BSS / Ficoll-Schnittstelle sichtbar.
9. Ernten Sie die trübe Schicht von PBMCs an der Schnittstelle der beiden Rohre mit einer Pipette und übertragen auf ein neues 50-ml-Tube.
10. 20 ml Vollmedium.
11. Das Röhrchen bei 288 x g für 7 min bei Raumtemperatur.
12. Entfernen Sie den Überstand durch Aspiration.
13. Zellpellet in 500 ul zusätzlichen Medien.
14. Gleiches Volumen des Einfrierens Medien.
15. Übertragen der Zellsuspension auf eine Kryoröhrchen.
16. Legen Sie die Kryoröhrchen in ein cryofreezing Behälter mit Isopropanol.
17. Lagern Sie den Gefrierbehälter bei -80 ° C über Nacht.
18. Transfer die gefrorenen PBMC Aliquot von flüssigem Stickstoff zur Langzeitlagerung.

3. Functional Test

1. Tag 1

1. Platzieren Aliquot von flüssigem Stickstoff in einem Wasserbad bei 37 ° C für eine Minute oder bis abgetaut.
2. Übertragen der Zellsuspension in ein 50 ml-Röhrchen mit einer sterilen Pipette.
3. 15 ml komplette Medien-und Spin die Zellen nach unten bei 200 xg für 5 min bei Raumtemperatur.
4. Entfernen Sie den Überstand durch Aspiration.
5. Leicht suspendieren Zellpellet in 1 ml PHA Medien.
6. Füllen Sie das Volumen auf 20 ml mit der gleichen Medien.
7. Das Röhrchen locker, damit die Luft gelangen.
8. Verlassen das Rohr über Nacht bei 37 ° C in einem CO _2-Inkubator, damit Ruhe Lymphozyten in schnell proliferierenden Lymphoblasten zu transformieren.

2. Tag 2

1. Nehmen Sie die Röhre aus dem Inkubator, die Verschlüsse vollständig und drehen Sie die Zellen nach unten bei 200 xg für 5 minbei Raumtemperatur.
2. Entfernen Sie den Überstand durch Aspiration.
3. Sanft auszusetzen Zellpellet in 1 ml Vollmedium.
4. Füllen Sie das Volumen auf 20 ml mit der gleichen Medien.
5. Das Röhrchen locker, damit die Luft gelangen.
6. Verlassen das Rohr über Nacht bei 37 ° C in einem CO _2-Inkubator, um die Zellzahlen zu erweitern.

3. Tag 3

1. Holen Sie sich das Rohr aus dem Inkubator, die Verschlüsse vollständig und drehen Sie die Zellen nach unten bei 200 xg für 5 min bei Raumtemperatur.
2. Entfernen Sie den Überstand durch Aspiration.
3. Waschen der Zellen zweimal mit 10 ml RPMI-1640 durch Zentrifugation bei 200 × g für 5 min bei Raumtemperatur.
4. Resuspendieren vorsichtig das Zellpellet in 600 ul RPMI-1640.
5. Messen Sie die Zellkonzentration und Lebensfähigkeit, mit einem automatisierten Zellzähler und Lebensfähigkeit-Analysator.
6. Hinzufügen geeigneten Volumen RPMI-1640 zu einer Zellkonzentration von 1,5 × 10 ⁵ Zellen/20 &mgr; l einzustellen.
7. Gönnen Zellen mit rekombinanten OPN (rOPN) oder Vehikel (PBS) in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen.
   1. Transfer von 100 &mgr; l der Zellsuspension in zwei sterile 1,5 ml-Eppendorf-Röhrchen.
   2. Hinzufügen rOPN in ein Rohr bis zu einer Endkonzentration von 0,5 ug / ml.
   3. Ein gleiches Volumen PBS in der zweiten Röhre.
   4. Vorsichtig mischen jede Bedingung, die durch Auf-und Abpipettieren zweimal mit einer sterilen Pipette eingestellt auf 100 ul.
8. Bereiten Sie die kleine Probe 96-Well-Mikroplatten.
   1. In 5 ul RPMI-1640 in jede Vertiefung.
   2. Zentrifugieren Sie die Platte bei 200 g für 3 min, um Luftblasen zu entfernen.
9. Samen der unbehandelten Zellen als auch Zellen mit rOPN oder PBS behandelt.
   1. Vor der Übertragung der Zellen von Rohr zu Mikro sanft auf und ab pipettieren einmal, um eine gleichmäßige Suspension der Zellen zu gewährleisten.
   2. In 40 ul Zellsuspension pro Well in vierfacher Ausfertigung für die unbehandelten Zellen, in zweifacher Ausfertigung für rOPN oder PBS behandelten Zellen. ReFER für den Entwurf 1. Diese Konstruktion ermöglicht es 12 Patienten auf der Mikrotiterplatte getestet werden.
   3. Lassen Sie die Zelle Platte unter dem sterilen Abzug für 5 Minuten, sodass die Zellen, um sich auszuruhen und, bevor sie in den Inkubator absetzen gleichmäßig auf den Boden der Mulde.
10. Inkubiere die Platte für 18 Stunden bei 37 ° C in einem CO _2-Inkubator, um die Wirkung von OPN zu optimieren.

4. Tag 4

1. Führen Sie die Platte mit Verbindungen.
   1. Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und lassen Sie es bei Raumtemperatur für etwa 30 min.
   2. Bereiten 1 ml 100 uM Somatostatin und Isoproterenol in RPMI-1640 durch Zugabe von 10 ul der Stammlösung (10 mM) in 990 ul RPMI-1640.
   3. Füllen Sie die Verbindung Platte durch den Verzicht auf 20 ul in entsprechenden Vertiefungen, wie in Abbildung 2 angegeben.
   4. Decken Sie die Verbindung mit einem vorgeschnittenen Platte Stechdichtung, Veränderungen in Verbindung Konzentration vor durch Verdunstung zu vermeidenoder während der Inkubation in der CDS-basierten System.
   5. Wägezelle Platte, Pipettenspitzen, und die Verbindung Platte in den CDS-basierten System.
   6. Nennen Sie die Platte in der CDS-basierten Gerätesoftware.
   7. Wählen Sie das entsprechende Protokoll. Die für die Klassifizierung mit PBMCs bearbeitet Protokoll "Agonist Non-adhärenten Zellen Kleine Probenplatte RT 15 min" genannt. Gehen Sie auf die Protokoll-Box und wählen Sie dieses Protokoll in der Liste der Protokolle
   8. Starten Sie das Protokoll, indem Sie auf "Start".
   9. Die integrierten Flüssigkeitssystem gleichzeitig addiert die Verbindungen zu allen Vertiefungen durch Injizieren 5 ul pro Vertiefung in einer Endkonzentration von 10 &mgr; M in einem Gesamtvolumen von 50 &mgr; l zu erreichen.
   10. Die CDS-basierten System sammelt automatisch die Daten für 15 min nach Zugabe der Verbindung.
2. Datenanalyse
   1. Wählen niedrigen und hohen Frequenzbereiche bei der Berechnung der extrahierten Werte für die nicht zu benutzenadhärenten Zellen.
   2. Wählen Driftkorrektur, um die lineare Veränderung der Ausgangsimpedanzmessungen über die Zeit zu korrigieren.
   3. Wählen Sie die Datenfilterung, um Variationen in der kinetischen Gangmessung durch elektronische Rauschen und Verbindung zusätzlich zu reduzieren.
   4. Wählen Sie die Max-Min-Methode für das Gesamtanalysezeit.
   5. Exportieren von Daten in Excel unter der Option Plattenformat.
   6. Berechnen delta G (&Dgr; G) durch Subtrahieren der durchschnittlichen Größe der Reaktion auf Stimulation Gi (RMGI) aus dem Mittelwert der Antwort Größenordnung Gs Stimulation (RMG) unter Verwendung der folgenden Formel:
      &Dgr; G = RMGI - RMGs
   7. Der prozentuale Anteil der fache Wirkung (Fe) von OPN auf Gi-vermittelte Reaktion durch Division der durchschnittlichen Größe der Antwort auf Gi Stimulation in Gegenwart von OPN (RmGiOPN) mit der mittleren Größe der Reaktion auf die Stimulation in Anwesenheit von PBS (GI RmGiPBS) unter Verwendung der folgenden Formel:
      Fe = 100 x (RmGiOPN / RmGiPBS)
   8. Siehe TLage 2, um Patienten zu klassifizieren.

Ergebnisse

Lebensfähigkeit der Zellen war bei allen Proben mit Werten konsistent in dem Bereich von 86 und 96% vergleichbar. Im Gegensatz dazu wurden große Schwankungen bei den Zellzahlen unter den Proben (Tabelle 3) beobachtet. Von den 32 Proben, zwei hatten unzureichende Anzahl von Zellen und nicht klassifiziert. Ein Beispiel der Ergebnisse der Funktionsklasse nach dem Grad des Ungleichgewichts zwischen Gs und Gi-Signalisierung ist in Fig. 3 gezeigt. Die vertikale Achse dieser Figur ist in drei Abschnitte Abgrenzung der funktionellen Gruppen mit dynamischen Bereiche als> +10 FG3 fest zwischen +10 und -10 für FG2 <-10 für FG1 unterteilt, und schließlich. Unter 30 Patienten hier getestet wurden 14, 6, und 5 Patienten deutlich in FG3 klassifiziert, FG2, FG1 und jeweils während fünf Patienten, insbesondere 345, 353, 370, 371 und 382 wurden bei der Grenzbereiche. Die Bewertung der Auswirkungen auf die OPN Reaktion auf Stimulation Gi hatte ergeben, dass OPN erhöht die Antwort in pa353 und 371 Patienten. Im Gegensatz dazu war die Antwort von mehr als 50% der Patienten 345 und 382 und von weniger als 50% der Patienten 370 folgenden rOPN Behandlung reduziert. Also, nach unseren Einstufungskriterien (Tabelle 2), waren wir in der Lage, Patienten, 353 und 371 in FG1 kategorisieren, 345 und 382 Patienten in FG2 und Patienten 370 in FG3. Parallel dazu wurden alle Patienten für ihre Reaktion auf Gi-Protein Stimulation gezeigt und im Vergleich zu Kontrollpersonen. Wie erwartet, waren alle Patienten weniger auf als Kontrollpersonen und Patienten in der gleichen funktionellen Gruppe durch unser neues Verfahren klassifiziert zeigten ähnliche Niveaus der maximalen Reaktion (Abbildung 5). Darüber hinaus Unterschiede zwischen den Patienten der einzelnen funktionellen Gruppe war im Einklang mit unseren klassischen Bereich der Klassifikation ^12, Validierung unserer neuen Verfahren. Die Klassifizierung einer großen Kohorte von Patienten skoliotischen regelmäßig in unserem Spezialklinik in Sainte-Justine-Krankenhaus verfolgt hat, ergab, dass die dreifunktionellen Gruppen wurden in ähnlicher Weise bei den mittelschweren Fällen verteilt, während der FG2 vorherrschend war unter schweren Fällen (Abbildung 6), Identifizierung von Patienten in diese funktionelle Gruppe kategorisiert wie ein höheres Risiko für schwere Fortschreiten der Krankheit und darauf hinweist, dass diese Klassifizierung Test sinnvoll sein, in der Prognose der idiopathischen Skoliose.

Lösung A	Wasserfreie D-Glucose	0,1%
	CaCl 2 · 2H 2 O	0,05 mM
	MgCl 2	0,98 mM
	KCl	5,4 mM
	Tris	145 mM
Lösung B	NaCl	140 mM
Balanced Salt Solution (BSS)	Lösung A	1 Volumen
	Lösung B	9 Volumen
RPMI-1640	500 ml
Antibiotika-Antimykotikum	1%
FBS	10%
Ergänzende Medien	RPMI-1640	50 ml
	Antibiotika-Antimykotikum	1%
	FBS	40%
Einfrieren Medien	RPMI-1640	50 ml
	Antibiotika-Antimykotikum	1%
	FBS	40%
	DMSO	20%
PHA Medien	RPMI-1640	500 ml
	Antibiotika-Antimykotikum	1%
	FBS	10%
	Phytohämaglutinin	1%

Tabelle 1. WesentlicheLösungen.

Dynamische Bereiche mit &Dgr; G	Funktionelle Gruppen	Dynamische Bereiche mit Fe
&Dgr; G <-10	FG1	Fe> 100%
-10 <&Dgr; G <10	FG2	Fe <50%
&Dgr; G> 10	FG3	50%

Tabelle 2. Kategorisierung von funktionellen Gruppen nach mit &Dgr; G und Fe etablierten dynamischen Bereichen.

Patienten	Die Lebensfähigkeit (%)	Zellkonzentration (× 10 6 / ml)	Kommentare
343	88,7	11,64
344	90,5	13,6
345	94,4	8,54
346	94,3	25.79
347	94,2	27.36
348	94,6	8,52
349	91,2	0,82	Unzureichende Anzahl von Zellen
350	90,3	8,92
352	92,6	8,28
353	91,3	12.75
354	86,9	7,62
355	91,2	7,51
356	90,3	9,36
358	95,1	16.94
359	92,3	13.89
360	89,4	7,67
361	93,5	7,84
365	86,5	2.2	Unzureichende Anzahl von Zellen
368	92,6	15.69
369	93,4	10,9
370	92,5	19.93
371	88,8	10.68
374	93,9	16.86
376	92,9	15,67
377	93,1	9,99
378	93,6	13.57
379	92,6	19,86
380	91,1	8,46
381	93,9	14,82
382	92,1	23.06
383	92,9	11.82
384	89,1	7,73

Tabelle 3. Prozent Lebensfähigkeit und Zellkonzentration als mit einem automatisierten Zellzähler und Lebensfähigkeit Analysator bestimmt.

Abbildung 1. Entwurf für Zellaussaat.

2.Entwerfen Sie für die Abgabe Verbindungen.

Abbildung 3. Dynamischer Bereich der funktionellen Klassifikation mit der CDS-basierten System. Graph zeigt Werte für den Grad des Ungleichgewichts zwischen Reaktionen auf Gs und Gi Stimulation in PBMCs von Patienten mit idiopathischer Skoliose erhalten. -Werte wurden durch die CDS-basiertes System in Antwort auf 10 uM Somatostatin und Isoproterenol gemessen. Jeder Punkt stellt den &Dgr; G der beiden Reaktionen in zweifacher Ausfertigung.

Abbildung 4. Wirkung von rOPN auf Antwort auf Gi Stimulation in PBMCs. 18 h wurden die Zellen unter Serummangel in Gegenwart oder Abwesenheit von 0,5 ug / ml rOPN und dann mit 10 angeregt 56, M von Somatostatin-Gi-vermittelte zelluläre Antwort auslösen. Daten im Diagramm wurden vom Maximum-Minimum-Impedanz erzeugt und entsprechen dem Mittelwert der Reaktion im Duplikat.

Abbildung 5. Funktionszustand von Gi-Protein in PBMCs von Kontrolle und scoliostic Themen. PBMCs von Probanden und Patienten wurden skoliotischen steigenden Konzentrationen von Somatostatin an Gi-Proteine ​​über endogene Somatostatin-Rezeptor stimulieren ausgesetzt. Die zelluläre Reaktion wurde durch CDS-basiertes System, wie in dem Abschnitt Verfahren beschrieben, gemessen. Kurven wurden von Maximum-Minimum-Impedanz erzeugt. Jede Kurve stellt die nichtlineare Regression. Daten wurden auf maximale Antwort in Zellen aus der Kontrollgruppe normalisiert und jeder Punkt entspricht dem Mittelwert der Reaktion im Duplikat./ 50768/50768fig5large.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen.

6. Verteilung funktioneller Gruppen unter den verschiedenen Phasen der Skoliose. Eine große Kohorte von 794 Patienten mit Skoliose moderat (Krümmungen zwischen 10-44 ° C) und 162 schwere (Krümmung größer als 45 °) Fällen regelmäßig in Sainte-Justine-Krankenhaus folgte, wurden nach dem Grad des Ungleichgewichts zwischen Reaktion auf Gi und Gs klassifiziert Stimulation. Reaktionen wurden durch die CDS-basiertes System in Antwort auf 10 uM Somatostatin und Isoproterenol gemessen.

Diskussion

Wir haben eine detaillierte Prozedur eines zellbasierten Prognosetest für idiopathische Skoliose, die für mononukleare periphere Blutzellen (PBMCs) wurden frisch isolierte oder konservierte für bis zu einem Jahr in flüssigem Stickstoff eingefroren beschrieben. Da mit frisch isolierten PBMCs ist umständlich beim Testen große Anzahl von Personen wurde das Verfahren mit gefrorenen PBMCs, die eine praktische Alternative in der klinischen Einstellung bieten vorgestellt. Doch Probleme mit Zellverklumpung nach dem Auftauen wurden die auftreten, wenn gefrorene PBMCs wurden ursprünglich verwendet, was manchmal zu Inter-Assay-Variabilität. Um Assay-Reproduzierbarkeit zu maximieren, empfehlen wir, die Vermeidung von Frost-Tau-Zyklus und mit der gefrorenen Probe nur einmal. Das Verfahren ist sehr einfach und ermöglicht eine genaue Erfassung von defekten Gi-Protein-Funktion in einer kurzen Zeit. Mit diesem Verfahren können asymptomatisch und skoliotischen Kinder leicht eingestuft werden, ihre klinischen Ergebnisse besser vorherzusagen, ohne Gefahr für ihre Gesundheit. HoWever, bei der Durchführung Einstufung nach dem Grad der maximalen Reaktion auf Gi-Stimulation im Vergleich zu den gesunden Kontrollpersonen ^12, mehrere Anforderungen für die Kontrollpersonen sollten erfüllt werden. In der Tat, um einen angemessenen Vergleich Kohorte haben, die Kontrollpersonen müssen Alter und Geschlecht abgestimmt sein, nicht auf jede Art von Medikamenten zu sein, und bieten privaten Informationen wie Vergangenheit einzelne / familiäre Krankengeschichte. Diese Anforderungen können ein wichtiges Hindernis für die Einstellung von Kontrollpersonen darstellen. Daher Klassifikation durch Ausführen der Grad der Ungleichheit zwischen Ansprechen auf Gi und G-Protein-Stimulation bei demselben Individuum ist ideal, um die Notwendigkeit der Verwendung von Steuersubjekten zu beseitigen.

Die Verwendung der CDS-basierten System, um dieses Prognosetest durchzuführen ist im Hinblick auf gleichzeitig eine Gi-und Gs-vermittelte Zellreaktionen im gleichen Assay signifikant. Obwohl viele Patienten ohne Uhr klassifiziert werdenbiguity mit der für diesen Test festDynamikBereich, eine kleine Anzahl von Patienten werden Werte an der Grenze der Bereiche zeigen, wie die Ergebnisse des vorliegenden Berichts dargestellt. Diese Personen zu unterscheiden, haben wir die Bewertung der Wirkung von OPN auf Gi Reaktion auf Stimulation durch den Nachweis, dass OPN induziert eine differentielle Wirkung auf Gi-vermittelte zelluläre Antwort auf die drei funktionellen Gruppen eingeführt. Tatsächlich haben wir festgestellt, dass in Gegenwart von OPN, Gi Antwort auf Erhöhungen der Stimulations FG1, FG2, während es in und FG3 abnimmt, in einem höheren Ausmaß in FG2. Trotz der hohen Kosten von OPN ist die Verwendung dieses Chemokin wichtig, eindeutigen Fällen zu unterscheiden, und somit die Genauigkeit der Klassifizierung Assay. Hat dieser Test jedoch den Nachteil, daß ein Minimum von 1,5 × 10 ⁵ Zellen pro Vertiefung erforderlich ist, um die zelluläre Antwort mit der CDS-basierten System unter unseren experimentellen Bedingungen beobachtet. Bestimmte Patientenproben nicht eine ausreichende Anzahl von habenZellen getestet werden. In diesem Fall ist es notwendig, die Patienten für weitere Blutentnahme, die für die Medizin-und Laborpersonal besorgniserregend für Familien und frustrierend sein kann zu erinnern. Prospektive Studien werden in unserem Labor geplant, um dieses Problem anzugehen.

Dennoch setzt das aktuelle Protokoll auf einfache und bewährte Methoden, um Zellen herzustellen, während der Tests mit einem validierten markierungsfreie System ^{13, 14,} um Antworten der Zellen zu überwachen automatisiert. Die Testplattform ist relativ preiswert, wenn sie mit genetischen Plattform für die Prognose von anderen Krankheiten verfügbar verglichen. Auch die Kosten für alle Einwegmaterialien, einschließlich der Blutsammelröhrchen, Tipps, die besondere Elektroden Mikrotiterplatten, sowie konische und Eppendorf-Röhrchen, nicht sehr teuer ist und bei weniger als 3.000 $ geschätzt, um eine Prüfung auf etwa tausend Patienten abzuschließen. Obwohl diese Schätzung nicht enthalten vor allem Kosten für die Vorbereitung von Probenund die Durchführung der Prüfung, bleibt dieser Test deutlich günstiger als Next-Generation-Sequencing-Plattformen. Bemerkenswert ist nicht nur die Kosten gegenüber genetischen Plattformen, aber insbesondere auf dem Gebiet der AIS verwandt ist, ist die Kosten für radiologische Bildgebung verbunden. Heute sind mehr als eine Million Kinder in den USA etwa 100.000 Kinder in Kanada mit idiopathischen Skoliose diagnostiziert, und die Gesamtkosten der Diagnose und Überwachung von Kindern, die von der Skolioseröntgenaufnahme als 2,5 Milliarden Dollar pro Jahr in Nordamerika. Somit wäre zu erwarten zellbasierten Assay-Verfahren für Routineuntersuchungen und Überwachung von Kindern mit idiopathischen Skoliose ohne Gesundheitsrisiko und kostengünstiger zu sein.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Materials
RPMI	Wisent, Inc	350-005-CL
FBS	Therno Scientific Hyclone	SH3007103
DMSO	Sigma Aldrich	D2650
Ficoll-Plaque Plus	GE Healthcare	17144003
Antibiotikum-Antimykotikum	Invitrogen	15240-062
Phytohämagglutinin	Invitrogen (Gibco)	10576-015
Rekombinantes humanes Osteopontin	R& D Systems, Inc	1433-OP/CF
Somatostatin	Tocris	1157
Isoproterenol	Tocris	1743
PBS	Wisent, Inc	311-010-CL
Sterile Pipettenspitzen	Axygen Scientific	301-06-451
Sterile Eppendorf-Röhrchen	Ultident	24-MCT-150-C
50 ml konisch Röhrchen	VWR International	89039-658
Cellkey kleine Probe 96W Mikroplatte	Molekulare Geräte	1026496
Cellkey Spitzen	Cybio	OL3800-25-559N
Vorgestanzte durchstechbare Dichtungen	Excel Scientific, Inc	XP-100<
Vicell XR	Beckman Coulter	731050	Automatisierter Zellzähler
Zellkulturhaube	Forma Scientific	1284	Klasse II
Lagerung von flüssigem Stickstoff	Thermo Scientific	CY5093570
Wasserbad	VWR International	89032-204
Standardlichtmikroskop	Leica Microsystems	DMIL LED
Zellkultur-Inkubator	Thermo Scientific	51019557	5% CO2 bei 37 &Grad; C
Zentrifuge mit niedriger Drehzahl	Thermo	Scientific 75004364
Cellkey-System	Molekulare Bauelemente	1019185	CDS-basiertes Instrument