Hitzeinduzierte Antigengewinnung: Eine effektive Methode zum Nachweis und zur Identifizierung von Vorläuferzelltypen während der adulten Hippocampus-Neurogenese

Zusammenfassung

Während der adulten Hippocampus-Neurogenese wird ein bestimmter Satz genetischer Marker exprimiert, wenn eine ruhende neurale Stammzelle nacheinander fortschreitet und sich zu einem funktionell integrierten Neuron im Schaltkreis entwickelt. Mittels hitzeinduzierter Antigengewinnung werden Vorläuferzelltypen, die sonst schwer zu detektieren sind, mit verbesserter Wirksamkeit identifiziert.

Zusammenfassung

Traditionelle Methoden der Immunhistochemie (IHC) nach Gewebefixierung ermöglichen die Visualisierung verschiedener Zelltypen. Diese gehen typischerweise mit der Anwendung von Antikörpern einher, um Antigene zu binden und Zellen mit Merkmalen zu identifizieren, die eine Funktion der inhärenten Biologie und Entwicklung sind. Die adulte Hippocampus-Neurogenese ist ein sequentieller Prozess, bei dem eine ruhende neurale Stammzelle aktiviert werden und Stadien der Proliferation, Differenzierung, Reifung und funktionellen Integration durchlaufen kann. Jede Phase ist unterschiedlich mit einer charakteristischen Morphologie und Hochregulierung der Gene. Die Identifizierung dieser Phasen ist wichtig, um die Regulationsmechanismen zu verstehen, die im Spiel sind, und alle Veränderungen in diesem Prozess, die der Pathophysiologie von schwächenden Erkrankungen zugrunde liegen. Unser hitzeinduzierter Antigen-Retrieval-Ansatz verbessert die Intensität des detektierten Signals und ermöglicht eine korrekte Identifizierung des Vorläuferzelltyps. Wie in diesem Artikel diskutiert, ermöglicht es uns insbesondere, aktuelle Probleme bei der Detektion bestimmter Vorläuferzelltypen zu umgehen.

Einleitung

Neurogenese, die Erzeugung neuer Neuronen aus neuralen Stammzellen, ist nun dafür bekannt, dass sie bis ins Erwachsenenalter in zwei spezialisierten Regionen des Gehirns ständig stattfindet. Dazu gehören die subventrikuläre Zone (SVZ) des Riechkolbens und die subgranuläre Zone (SGZ) des Gyrus dentatus im Hippocampus. In den letzten zehn Jahren wurden auf dem Gebiet der adulten Hippocampus-Neurogenese bedeutende Arbeiten durchgeführt. Die Region hat großes Interesse geweckt, da neugeborene Neuronen in der SGZ zu einer verbesserten neuronalen Plastizität beitragen, die spezifische Gehirnfunktionen^1-5 aufrechterhalten kann. Es wurde in Verbindung gebracht, dass die Neurogenese des Hippocampus bei Erwachsenen eine wichtige Rolle bei der Stimmungsregulation, der Regeneration sowie dem Lernen und Gedächtnis spielt. Daher gab es konzertierte Anstrengungen, um die Entwicklung und Regulation von Neuronen in dieser reichhaltigen neurogenen Nische zu verstehen.

Ein unvermeidlicher und wichtiger Aspekt bei der Untersuchung der adulten Hippocampus-Neurogenese ist die Identifizierung separater Stadien, die eine aktivierte neurale Stammzelle auf ihrem Weg zu einem voll funktionsfähigen Neuron durchläuft. In diesem Prozess wird die ruhende neurale Stammzelle aktiviert und durchläuft eine Reihe von frühen aktiven und spätaktiven Vorläuferzelltypen (Abbildung 1). Diese unterschiedlichen Populationen neuraler Vorläuferzellen können durch die Morphologie und ihre Expression von molekularen Markern wie MCM2, Nestin, Tbr2 und Doublecortin (DCX) und NeuN identifiziert werden, die die Umwandlung von RGLs in ihre jeweiligen Vorläuferzelltypen steuern. Nestin ist ein intermediäres Filamentprotein, das über die radialen gliaähnlichen Zellen und einige frühe Vorläuferzelltypen exprimiert wird. Ein weiterer Marker ist Tbr2, das spezifisch in den amplifizierenden Vorläuferzellen exprimiert wird. Die Tbr2-Transgenexpression wird zunächst in den Typ-1-Zellen (radial-glia-ähnlich) ausgeschaltet, bei den Typ-2a-, Typ-2ab- und Typ-2b-Vorläuferzellen eingeschaltet und bei den differenzierteren Typ-3- und unreifen Neuronen ausgeschaltet (Abbildung 1). DCX ist ein neuronaler Migrationsmarker, der in den neuronalen Vorläuferzellen Typ-2ab, Typ-2b und Typ-3 exprimiert wird. Mit dieser Kombination von drei Markern können wir unterschiedliche Subtypen von neuronalen Vorläuferzellen markieren. Dazu gehören der Typ-1 (MCM2+Nestin+Tbr2-), Typ-2a (MCM2+Nestin+Tbr2+), Typ-2ab (partiell MCM2+nestin-Tbr2+ und partiell MCM2+Tbr2+DCX-), Typ-2b (MCM2+Tbr2+DCX+) und Typ-3 (MCM2+Tbr2-DCX+). Postmitotische Zellen wie die unreifen und funktionell integrierten Neuronen können mit Hilfe von DCX und dem reifen neuronalen Marker NeuN identifiziert werden.

Traditionelle Methoden der IHC verwenden Antikörper, um Antigene für bestimmte Zelltypen anhand ihrer Genexpression zu identifizieren. Die anschließende Visualisierung durch hochauflösende bildgebende Verfahren wie die konfokale Mikroskopie kann zu ihrer Identifizierung genutzt werden. Derzeit gibt es jedoch Probleme mit diesen Methoden, die keine effiziente Identifizierung der radialen gliaähnlichen Zellen und der frühen Vorläuferzelltypen ermöglichen. Es ist schwierig, diese speziellen Zelltypen zu identifizieren, da der applizierte Antikörper nicht in der Lage ist, das Nestin-Protein zu durchdringen und effizient zu binden. Nestin ist das intermediäre Filamentprotein, das die radialen Prozesse umfasst, die von der radialen gliaähnlichen Zelle produziert werden. Die ineffiziente Bindung eines Antikörpers an das Antigen kann das Ergebnis vieler Faktoren sein, einschließlich der Fixierungszeit, der Temperatur und der verwendeten Technik^6-7. Um solche Probleme zu lösen, haben wir eine Antigen-Retrieval- oder "Boiling"-Methode entwickelt. Neben Nestin verbessert diese Methode der Antigen-Retrieval auch die Färbung für andere Marker wie Ki67, BrdU, gliales fibrilläres saures Protein (GFAP), Tbr2 und MCM2. Unsere Methode kombiniert chemische und physikalische Ansätze. Es handelt sich um die chemische Fixierung des Gewebes in Paraformaldehyd und das anschließende Hochtemperatursieden dünner koronaler Hippocampusschnitte in einem Puffer einer denaturierenden und chaotropen Behandlung. Dies verbessert die Zugänglichkeit des Antigens zum Antikörper, verbessert die Antikörperspezifität und ermöglicht eine verbesserte Identifizierung von Vorläuferzelltypen. Unser Ansatz ist einfach zu handhaben und erfordert meist bereits verfügbare Werkzeuge und Reagenzien im Labor. Wir haben es ausgiebig genutzt, um die Entwicklung neuraler Stammzellen und ihre Regulation über intrinsische genetische oder extrinsische Umweltfaktoren zu untersuchen⁸.

Protokoll

1. Präimmunhistochemie: Perfusion und Histologie

1. Perfundieren Sie Mäuse gemäß einem allgemeinen transkardialen Protokoll, das für Mäuse angepasst ist, und extrahieren Sie das Gehirn in 4 % Paraformaldehyd (PFA)⁹.
2. Lassen Sie das Gehirn über Nacht bei 4 °C in PFA (z. B. in einem 10 ml konischen Röhrchen, das mit PFA gefüllt ist). Mindestens 12-24 Stunden in PFA aufbewahren, nicht länger als 36 Stunden für eine vollständige Fixierung. Nach der Fixierung über Nacht entleeren Sie das PFA aus dem konischen Rohr, aber lassen Sie das Gehirn im Inneren. Gießen Sie 30% Saccharose in die Tube und waschen Sie das Gehirn für kurze 5 Sekunden, um alle PFA-Reste zu entfernen. Zum Schluss das Röhrchen mit dem Gehirn wieder mit 30% Saccharose füllen. Bewahren Sie das Gehirn in Saccharose bei 4 °C auf, bis das Gehirn auf den Boden der Röhre sinkt.
3. Schneiden Sie 40 μm Hirnschnitte auf ein Mikrotom. Konsultieren Sie einen Atlas des Mausgehirns, um Schnitte vom Anfang des Gyrus dentatus bis zu seinem Ende zu sammeln. Bewahren Sie die Abschnitte in Frostschutzlösung auf (ein einfaches Rezept sind 300 g Saccharose in 500 ml 0,1 M PBS und 300 ml Ethylenglykol), bis sie für die Immunhistochemie bereit sind.
4. Montieren Sie das geschnittene Gewebe auf Objektträger, die speziell so konzipiert sind, dass sie stark am Gewebe haften. Diese Objektträger sorgen für einen starken Halt des Gewebes während der Siedephase. Lassen Sie den Objektträger nach dem Montieren des Gewebes bitte 10 min trocknen oder bis er vollständig getrocknet ist. Die Trocknung kann beschleunigt werden, wenn der Objektträger an einer senkrechten Fläche abgelegt wird und die Unterkante des Objektträgers auf einem Papiertuch liegt. Wenn mehr als eine Rutsche montiert wird, können die anderen Rutschen während dieser Zeit (1-2 Stunden sind in Ordnung) trocken bleiben, bis sie mit dem nächsten Schritt fortfahren können.
5. Sobald der Objektträger trocken ist, waschen Sie ihn dreimal für jeweils 5 Minuten mit PBS und trocknen Sie ihn erneut (PBS-Puffer = 0,137 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,0119 M Na₂PO₄). Dadurch wird sichergestellt, dass vorherige Chemikalie (z. B. Glycerin aus Frostschutzlösung) ausreichend entfernt wird und die Haftung des Gewebes am Objektträger nicht beeinträchtigt werden kann.

2. Vorbereitung von Reagenzien und kleinerer Ausrüstung

1. Lösung A (0,1 M oder 19,21 g/l Zitronensäure) und Lösung B (0,1 M oder 24,9 g/l Tris-Natriumcitrat) werden vorbereitet, in denen die Gewebeschnitte gekocht werden.
2. In einem Messzylinder werden 9 ml Lösung A und 41 ml Lösung B vermischt. Zu dieser Mischung werden 450 ml ddH₂O gegeben.
3. Gießen Sie diese Mischung in einen leeren Behälter (z. B. eine leere Pipettenspitzenbox), der mikrowellengeeignet ist.

3. Hitzeinduzierte Antigen-Entnahme

1. Die in Schritt 2 hergestellte Lösung 5 Minuten lang bei Standardeinstellung in einer Standardmikrowelle kochen. Die Lösung beginnt bei oder über 100 °C zu sieden.
2. Sobald das Kochen abgeschlossen ist, nehmen Sie den Behälter vorsichtig aus der Mikrowelle und legen Sie getrocknete Objektträger hinein, wobei Sie sicherstellen, dass die Objektträgerfläche mit den Hippocampus-Abschnitten nach unten zeigt und vollständig der Flüssigkeit ausgesetzt ist. Wenn möglich, platzieren Sie die Objektträger schräg an den Wänden der Box und stapeln Sie andere Objektträger um sie herum. Stellen Sie sicher, dass ihr "Sitz" in der Box fest ist, damit die Folien keinen Platz haben, sich übereinander zu bewegen.
3. Kochen Sie diese Mischung mit Dias 7 Minuten lang bei Standardeinstellungen in der Mikrowelle. Die Lösung siedet während dieser Zeit bei oder über 100 °C.
4. Während dieser Kochphase zwei Eiskübel zur Hälfte mit Eis füllen.
5. Sobald das Kochen in Schritt 3.3 abgeschlossen ist, nehmen Sie den Behälter aus der Mikrowelle und stellen Sie ihn in einen der Eiskübel. Gieße den Rest des Eises aus dem anderen Eimer rund um den Behälter und decke ihn vollständig ab. Lassen Sie es 1 Stunde ruhen.

4. Färbung von Primär- und Sekundärantikörpern

1. Nach Ablauf der 1 Stunde Wartezeit die Objektträger aus dem Behälter nehmen und mit TBS-T Puffer 3x für je 5 min waschen. Für diese Grundwaschungen kann jedes Gerät verwendet werden. (Puffer TBS = 50 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, TBS-T = 0,05 % Triton X-100 TBS Puffer, TBS-TT = 4 % Eselsserum TBS-T Puffer).
2. Lassen Sie die Objektträger nach dem Waschen an einem dunklen Ort trocknen (z. B. in einer Bankschublade, legen Sie ein Papiertuch in die Schublade und kippen Sie die Schiene dagegen) für 5-10 Minuten oder bis die Schiene vollständig getrocknet ist. Bereiten Sie während dieser Zeit eine Kammer für die Färbung von Primärantikörpern über Nacht vor. Eine einfache Färbekammer kann einen Behälter mit großer Oberfläche, gefüllt mit ddH₂O, und eine Stufe im Inneren des Behälters umfassen, auf der der Objektträger über dem ddH₂O abgelegt werden kann.
3. Sobald der Objektträger getrocknet ist, zeichnest du mit einem wasserabweisenden Stift einen Umriss um die Gewebeabschnitte. In Schritt 4.5 wirkt dieser Umriss als Barriere, die ein Überfließen des Antikörpergemisches verhindert.
4. Bereiten Sie die primäre Antikörpermischung in TBS-TT vor. Mindestens 500 μl sind erforderlich, um einen gesamten Objektträger zu bedecken, z. B. wenn der Antikörperbestand eine Konzentration von 1:500 aufweist, fügen Sie 1 μl eines bestimmten Antikörpers zu 500 μl TBS-TT hinzu. Verwenden Sie primäre Antikörper, wie in der Reagenzientabelle erwähnt.
5. Legen Sie den getrockneten Objektträger auf den Tisch in die Färbekammer. 500 μl der Primärantikörper langsam zugeben und vollflächig bedecken. Decken Sie das gesamte Gerät ab und wickeln Sie es in Aluminiumfolie ein, um das Licht von außen zu blockieren. Lassen Sie es über Nacht bei Zimmertemperatur ziehen.
6. Waschen Sie den Objektträger am nächsten Tag dreimal für jeweils 5 Minuten mit TBS-T-Puffer. Lassen Sie es an einem dunklen Ort trocknen, wie in Schritt 4.2 beschrieben.
7. Bereiten Sie eine sekundäre Antikörpermischung ähnlich wie in Schritt 4.4 vor. In der Reagenzientabelle finden Sie Informationen zu Sekundärantikörpern.
8. Legen Sie den getrockneten Objektträger wie in den Schritten 4.2 und 4.5 beschrieben in die Färbekammer. 500 μl der Sekundärantikörper langsam zugeben und vollflächig bedecken. Wickeln Sie die Färbekammer in Alufolie ein, um sie vor äußerem Licht zu schützen. Lassen Sie es abgedeckt und vor äußerem Licht geschützt mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur stehen.
9. Waschen Sie den Objektträger nach Abschluss der Sekundärfärbung dreimal für jeweils 5 min mit TBS-T-Puffer. Lassen Sie die Folie an einem dunklen Ort trocknen. Geben Sie nach dem Trocknen die Montagelösung auf und decken Sie die Folie vorsichtig mit einem Deckglas ab, um das Eindringen von Blasen zu verhindern. Lassen Sie den Objektträger mindestens 2 Stunden lang an einem dunklen Ort liegen, bevor Sie ihn anschließend analysieren.
10. Führen Sie eine Zeitraffer- oder konfokale Analyse des gefärbten Gewebes durch.

Ergebnisse

Die adulte Hippocampus-Neurogenese ist ein sequentieller Prozess, bei dem der repräsentative Vorläuferzelltyp in jedem Stadium mit einer Kombination von Markern identifiziert werden kann. Sorgfältige chemische Fixierung und Antigen-Retrieval verbessern die Wirksamkeit und Zugänglichkeit von Markern, die sonst schwer zu detektieren sind. Eines davon ist Nestin, das unter den radialen gliaartigen neuralen Stammzellen und einigen frühen aktiven Vorläuferzelltypen exprimiert wird. Nestin kann ein Schlüsselprotein bei der Ide...

Diskussion

Die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Antigen-Retrieval und Färbung von Vorläuferzelltypen sind: 1) Verwendung von gut durchblutetem und fixiertem Gewebe mit der optimalen koronalen Dicke; 2) ausreichend Zeit zum Kochen und anschließenden Abkühlen während der Antigengewinnung; 3) Handwerkliches Geschick bei der Montage fester koronaler Abschnitte und der Vermeidung ihrer Beschädigung dabei.

Bei der IHC ist es entscheidend, perfundiertes Gewebe zu verwenden, das ausreichend fixiert, ab...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
SuperFrost Plus Slide	Fisherbrand	12-550-15	Bietet eine starke Haftung am Hippocampusgewebe während des Siedens
PVA/DABCO Eindeckmedien	Sigma Aldrich	10981-100 ml
Nestin (Huhn)	Aves Lab	NES	Marker für neurale Stammzellen
GFAP (Kaninchen)	Dako Nordamerika	Z033401-2	Marker für Astrazyten und neurale Stammzellen
MCM2 (Maus)	BD Transduktionslabor	610701	Proliferationsmarker
DCX (Ziege)	Santa Cruz Biotechnology	SC8066	Unreifer Neuronenmarker
Tbr2 (Kaninchen)	Abcam	Ab23345	Amplifizierender Vorläufermarker
NeuN (Maus)	Millipore	MAB377	Reifer Neuronenmarker
Cy2 (Anti-Kaninchen)	Jackson Immunoresearch	111-226-047
Cy2 (gegen Hühner)	Jackson Immunoresearch	303-165-006
Cy5 (gegen Maus)	Jackson Immunoresearch	315-175-047
Cy5 (gegen Ziege)	Jackson Immunoresearch	305-165-047
DAPI	Life Technologies Corporation	D1306
Dako Pen	S2002	Dako	Wasserabweisender Stift