Identifikation von spezifischen sensorischen Neuronenpopulationen für das Studium der Ausgedrückt Ionenkanäle

Zusammenfassung

Afferente sensorische Neuronen signalisieren sensorische Informationen von der Peripherie an das zentrale Nervensystem. Die Identifizierung spezifischer afferenter Neuronen hilft beim Verständnis ihrer Physiologie. Wir beschreiben eine Methode der retrograden Markierung, um afferente Neuronen zu identifizieren, und untersuchen die spannungsgesteuerten Ionenkanäle in diesen Neuronen mit Hilfe der Patch-Clamp-Elektrophysiologie und Immunzytochemie.

Zusammenfassung

Sensorische Neuronen übertragen Signale von verschiedenen Teilen des Körpers an das zentrale Nervensystem. Das Soma für diese Neuronen befindet sich in den Spinalganglien, die die Wirbelsäule auskleiden. Das Verständnis der Rezeptoren und Kanäle, die von diesen sensorischen afferenten Neuronen exprimiert werden, könnte zu neuartigen Therapien für Krankheiten führen. Der erste Schritt besteht darin, die spezifische Untergruppe der sensorischen Neuronen von Interesse zu identifizieren. Hier beschreiben wir eine Methode zur Identifizierung afferenter Neuronen, die die Muskeln innervieren, durch retrograde Markierung mit einem Fluoreszenzfarbstoff DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyaninperchlorat). Das Verständnis des Beitrags von Ionenkanälen zur Erregung von Muskelafferenzen könnte dazu beitragen, eine übermäßige Erregbarkeit, die durch bestimmte Krankheitszustände wie periphere Gefäßerkrankungen oder Herzinsuffizienz induziert wird, besser zu kontrollieren. Wir verwendeten zwei Ansätze, um die spannungsabhängigen Ionenkanäle zu identifizieren, die von diesen Neuronen exprimiert werden, die Patch-Clamp-Elektrophysiologie und die Immunzytochemie. Während Elektrophysiologie plus pharmakologische Blocker funktionelle Ionenkanaltypen identifizieren können, haben wir die Immunzytochemie verwendet, um Kanäle zu identifizieren, für die spezifische Blocker nicht verfügbar waren, und um das Ionenkanal-Verteilungsmuster in der Zellpopulation besser zu verstehen. Diese Techniken können auf andere Bereiche des Nervensystems angewendet werden, um bestimmte neuronale Gruppen zu untersuchen.

Einleitung

Dorsale Wurzelganglien (DRG) bestehen aus Soma von afferenten Neuronen, die verschiedene Teile des Körpers innervieren, und wichtige Erkenntnisse können durch die Untersuchung sensorischer Neuronen mit unterschiedlichen Innervationszielen gewonnen werden¹. Verschiedene indirekte oder invasive Methoden werden verwendet, um afferente Neuronen zu isolieren und zu identifizieren, z.B. durch Injektion von Markern wie Fluorgold¹ in den Nerv, Injektion von Farbstoff in die Muskeln durch chirurgische Methode². Von den verschiedenen Farbstoffen, die erfolgreich zur Markierung von Neuronen und neuronalen Bahnen verwendet wurden, werden Fluoreszenzfarbstoffe wie DiI aufgrund ihrer schnellen Aufnahme durch Neuronenterminals, der langfristigen Retention in Neuronen und des fehlenden Transfers zwischen Neuronen häufig in neuroanatomischen Tracings verwendet³. Die afferenten Neuronen, die mit DiI markiert sind, können für eine detaillierte Untersuchung leicht mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden. Eine Einschränkung besteht jedoch darin, dass Marker wie DiI während der Zellpermeabilisierung, die für die Immunzytochemie mit intrazellulären Epitopen benötigt wird, aus den Zellen verloren gehen^{können 4}. Hier beschreiben wir eine Methode, bei der DiI in den Skelettmuskel injiziert wird, um muskelafferente Neuronen im DRG zu identifizieren. Wir beschreiben auch eine Zellpermeabilisierungsmethode, die DiI im Neuron hält und gleichzeitig den Antikörperzugang zu intrazellulären Epitopen ermöglicht. Wir demonstrieren die Verwendung sowohl der Patch-Clamp-Elektrophysiologie als auch der Immunzytochemie, um diese identifizierten Neuronen zu untersuchen, und beschreiben die unterschiedlichen Vorteile jeder Technik bei der Untersuchung von Ionenkanälen, die die neuronale Erregbarkeit steuern. Schließlich beschreiben wir mögliche Probleme, die die Interpretation elektrophysiologischer Daten behindern können. Wir haben diese Methoden verwendet, um Muskel- und kutane afferente Neuronen zu identifizieren und die spannungsgesteuerten Natriumkanäle (NaV) zu bestimmen, die in diesen identifizierten Neuronen exprimiert werden⁸. Diese Methoden können jedoch an eine Vielzahl von Präparaten angepasst werden, um identifizierte Untergruppen von Neuronen zu untersuchen, die ein bestimmtes Zielgewebe oder einen bestimmten Hirnkern innervieren.

Protokoll

Hinweis: Alle Tierarbeiten müssen gemäß den Richtlinien der Institution und der Tierpflege durchgeführt werden.

1. Vorbereitung des Tieres und Kennzeichnung

1. Anästhesieren Sie Ratten: Betäuben Sie eine Ratte (typischerweise 150-400 g) mit einer intraperitonealen Injektion einer Mischung aus Ketamin (50 mg/kg Körpergewicht), Xylazin (5 mg/kg) und Acepromazin (1 mg/kg). Überprüfen Sie, ob Reflexe vorhanden sind, indem Sie den Fuß einklemmen, und warten Sie, bis keine Reaktion erfolgt. Da die Anästhesiereaktion von Tier zu Tier unterschiedlich ist, ist es am besten, die Wirkung der Anästhetika durch Testen der Schmerzreflexe zu bestimmen.
2. DiI-Lösung: DiI-Pulver wiegen und in sterilem 100%igem DMSO auflösen, um eine 1,5%ige Lösung (15 mg/ml) zu erhalten. Lagern Sie die Lösung bis zur Verwendung bei Raumtemperatur in trockener Atmosphäre.
3. DiI-Injektionen: Rasieren Sie die Haare über dem Wadenbereich an beiden Beinen der anästhesierten Ratte mit einem Elektrorasierer.
   1. Füllen Sie eine sterile 1-ml-Spritze (11/4 in 27 g Nadel) mit 200 μl 1,5%iger DiI-Lösung. Führen Sie die Nadel langsam parallel zur Längsachse jedes Gastrocnemius-Muskels ein und injizieren Sie 100 μl DiI in den Muskel, während Sie die Nadel langsam aus dem Muskel herausziehen (~10 Sekunden), ohne sich aus dem Muskel zurückzuziehen.
   2. Bevor Sie die Nadel aus dem Muskel ziehen, ziehen Sie den Spritzenkolben zurück, um sicherzustellen, dass der Farbstoff nicht mehr aus der Spitze fließt, warten Sie 10 Sekunden und ziehen Sie dann die Nadel aus dem Muskel zurück. Dieser Schritt verhindert das Austreten von DiI von der Nadel auf die Haut, wodurch kutane Afferenzen markiert werden könnten.
   3. Wiederholen Sie den Vorgang für das andere Bein.
   4. Warten Sie 4-5 Tage, bis der DiI vom Muskel zum DRG transportiert wird.

2. Dissektion und neuronale Isolierung

1. Lösungen:
   1. Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) und Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) nach Herstellerangaben zubereiten, filtrieren, sterilisieren und bei 4 °C lagern.
   2. Nährmedien (MEM Plus): Mischen Sie 89 ml minimal essentielle Medien (MEM), 10 ml fötales Rinderserum (FBS), 1 ml Penicillin-Streptomycin-Lösung, filtrieren, sterilisieren und bei 4 °C lagern.
   3. Polylysinlösung: Poly-L-Lysinhydrobromidpulver (10 mg/100 ml) in 0,1 M Natriumboratlösung, pH 8,4, auflösen, filtrieren, sterilisieren und Aliquote bei -20 °C lagern.
2. Beschichtung von Deckgläsern
   1. Reinigen Sie die Deckgläser (12 mm rund) 3-4 Stunden lang in 70 % Ethanol und trocknen Sie sie in einer sterilen Kulturhaube an der Luft.
   2. Legen Sie die getrockneten Deckgläser in die Polylysinlösung O/N.
   3. Aus der Polylysinlösung nehmen und 2x für jeweils 5 Minuten in sterilem destilliertem Wasser waschen, um überschüssiges Polylysin zu entfernen.
   4. Trennen Sie die Deckgläser, trocknen Sie sie in der Kulturhaube und lagern Sie sie bei 4 ^°C.
3. Vorbereitung für die Präparierung
   1. Ein Becherglas mit 10 ml HBSS, eine 35 mm Petrischale und eine 100 mm Petrischale auf Eis legen.
   2. Wägen Sie die Enzyme ab: 7 mg Kollagenase, 1 mg DNAse und 10 mg Trypsin.
   3. Ein Schüttelwasserbad auf 37 ^°C vorheizen und ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit 10 ml EBSS zum Aufwärmen in das Bad stellen.
4. Dissektion:
   1. Tötete die Ratte gemäß einem von der IACUC genehmigten Protokoll. CArbondioxid wurde verwendet, um die Ratte einzuschläfern.
   2. Entfernen Sie schnell den Rücken, indem Sie die Haut am Rücken aufschneiden, entfernen Sie das Binde- und Muskelgewebe entlang der Wirbelsäule für eine bessere Belichtung und entfernen Sie den Lendenwirbelsäulenabschnitt (Ende der Brustregion bis zum Beckenknochen; Abbildung 1).
   3. Legen Sie die isolierte Wirbelsäule in die 100-mm-Petrischale und tragen Sie mit einer sterilen Pasteur-Pipette gekühlte HBSS-Lösung auf, um das Präparat feucht und kalt zu halten.
   4. Schneiden Sie die Muskeln an den Seiten der Wirbelsäule ab. Führen Sie eine dorsale Laminektomie mit einem Rongeur oder einer Schere durch und entfernen Sie vorsichtig den Knochen, der die Aussparungen umschließt, in denen sich das DRG befindet.
   5. Tragen Sie während dieses Vorgangs wiederholt eiskaltes HBSS (~1 ml) auf.
   6. Isolieren Sie das DRG, indem Sie den peripheren und zentralen Nerv durchtrennen (1-2 mm Nerv verbleiben, um die Handhabung der Ganglien zu erleichtern)
   7. Geben Sie das isolierte DRG in die 35-mm-Petrischale mit eiskaltem HBSS-Puffer.
   8. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle L-4 und L-5 DRG isoliert sind. Thoracic DRG kann isoliert und separat als Negativkontrolle für die DiI-Markierung verarbeitet werden.
   9. Stellen Sie die Schale mit isoliertem DRG unter ein Seziermikroskop und entfernen Sie die überschüssigen Nerven und Blutgefäße mit einer Mikroschere und einer Pinzette.
   10. Schneiden Sie das DRG auf, um den Enzymen besser ausgesetzt zu sein, aber enthüllen Sie das DRG nicht.
5. DRG-Neuronen-Dissoziation:
   1. Geben Sie die Enzyme in das warme EBSS-Medium (im Wasserbad aufbewahrt). Zum Auflösen kurz schütteln und mit dem Filter sterilisieren.
   2. Geben Sie mit einer sterilen Pasteur-Pipette das gesamte DRG in die Enzymlösung. Das Volumen des HBSS, das mit DRG zugesetzt wird, wird auf ein Minimum reduziert, da das HBSS das Enzymgemisch verdünnt. Der Kolben wird 60 Sekunden lang mit 95 % O₂ und 5 % CO₂ begast, bevor der Kolben fest verschlossen wird.
   3. Der Kolben wird im Schüttelwasserbad bei 37 °C für 60 min bei 240 U/min inkubiert.
   4. Am Ende der Inkubation wird der Kolben 50x kräftig geschüttelt, um das DRG⁵ zu dissoziieren.
   5. Unter sterilen Bedingungen werden 5 ml MEM Plus in den Kolben gegeben, um die Enzyme zu stoppen.
   6. Der Kolbeninhalt wird in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und 6 Minuten lang bei 16 x g zentrifugiert.
   7. Den Überstand entfernen und entsorgen, 5 ml MEM Plus zur Probe geben. Zerreiben Sie vorsichtig mit einer Pipette, um das Pellet aufzubrechen.
   8. Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt, entfernen und entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 500 μl MEM Plus hinzu. Mit einer 1-ml-Pipettenspitze auf einer Pipette vorsichtig verreiben, um eine Zellsuspension herzustellen.
   9. Legen Sie ein Deckglas mit Polylysin beschichtet in eine leere sterile 35-mm-Schale. Geben Sie einen Tropfen (~50 μl) der Zellsuspension in die Mitte des Deckglases.
   10. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Zelllösung erschöpft ist.
   11. Stellen Sie die 35-mm-Schalen für 1 Stunde in einen 37 °C und 5 % CO₂ -Inkubator, damit die Neuronen an den Deckgläsern haften können.
   12. Geben Sie weitere 2 ml Medium in jede Schale und kehren Sie in den Inkubator zurück.

3. Patch Clamp Aufnahme

1. Lösungen für die Aufzeichnung: Diese Lösungen sind für die Aufzeichnung von NaV-Strömen vorgesehen. Beispiele für Lösungen mit unterschiedlicher Zusammensetzung finden Sie in diesen Referenzen^5-7.
   1. Externe Lösung: (in mM) 45 NaCl, 100 N-Methyl-d-glukamin (NMG)•Cl, 4 MnCl₂, 10 Na•HEPES und 10 Glukose, mit einem pH-Wert = 7,4 und einer Osmolarität = 320 mOsm.
   2. Innere Lösung: (in mM) 104 NMG•Cl, 14 Kreatin•PO₄, 6 MgCl₂, 10 NMG•HEPES, 5 Tris•ATP, 10 NMG₂•EGTA und 0,3 Tris₂•GTP mit pH 7,4 und Osmolarität = 300 mOsm.
2. Messung von Ionenströmen:
   1. Ziehen Sie Aufzeichnungselektroden aus Glaskapillaren auf einem Elektrodenabzieher und polieren Sie die Spitzen mit einer Mikroschmiede heiß. Der Widerstand der Elektroden beträgt typischerweise 2-3 MΩ
   2. Identifizieren Sie die DiI-markierten DRG-Neuronen mit einem Mikroskop mit Epifluoreszenz und einem TRITC-Würfel. DiI hat eine Anregungswellenlänge von 550 nm und eine Emissionswellenlänge von 570 nm.
   3. Füllen Sie die Glaselektrode mit interner Lösung (feilen Sie nur ~ 1 cm der Elektrodenspitze ab) und klopfen Sie vorsichtig darauf, um eingeschlossene Blasen zu entfernen. Setzen Sie sie in den Elektrodenhalter ein und bewegen Sie sie mit einem Mikromanipulator zur Zelle.
   4. Sobald die Elektrode die Zelle berührt, üben Sie einen sanften Sog über das Saugrohr aus, bis eine dichte Abdichtung gebildet ist (bestimmt durch die Erhöhung des Elektrodenwiderstands).
   5. Klemmen Sie die Membranspannung auf das gewünschte Haltepotenzial (typischerweise -60 bis -120 mV).
   6. Erhalten Sie die Konfiguration der Ganzzell-Patch-Klemme, indem Sie einen stärkeren Sog anwenden, um das Membranpflaster an der Spitze der Elektrode zu entfernen. Der Übergang zur Ganzzellenkonfiguration wird elektrisch als Erhöhung des kapazitiven Stroms^{8-10 beobachtet.}
   7. Kompensieren Sie den Serienwiderstand mit der Kompensationsschaltung des Patch-Clamp-Verstärkers (verwenden Sie mindestens 80 % Kompensation)^8,10.

4. Immunzytochemie

1. Fixieren Sie die Neuronen auf den Deckgläsern mit 4% Paraformaldehyd für 1 h und permeabilisieren Sie dann mit 2% Tween 20 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 10 min.
2. Inkubieren Sie die fixierten Zellen O/N in einer Blockierungslösung (normales Serum oder Rinderserumalbumin) plus den primären Antikörper, bei dem es sich um einen Antikörper handelt, der entwickelt wurde, um an ein spezifisches Antigen von Interesse zu binden.
3. Inkubieren Sie einen Kontrollsatz von Neuronen O/N in einer Blocklösung, der die primären Antikörper fehlen.
4. Waschen Sie die Deckgläser 3x für 5 min mit PBS-Puffer, gefolgt von 2 Wäschen à 5 min mit 1% Tween 20, um den ungebundenen Primärantikörper zu entfernen.
5. Inkubieren Sie Test- und Kontrolldeckgläser mit dem entsprechenden fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper, der an den Primärantikörper bindet, um eine Visualisierung zu ermöglichen.
6. Waschen Sie die Deckgläser 3x 5 Minuten lang mit PBS, um überschüssige Sekundärantikörper zu entfernen.
7. Montieren Sie die Deckgläser mit Montagemedien auf einem sauberen Objektträger.
8. Tragen Sie klaren Nagellack auf den Rand des Deckglases auf, um ihn zu fixieren. Sobald sie getrocknet sind, visualisieren Sie die Neuronen und nehmen Sie Bilder mit der Software auf, die dem Fluoreszenzmikroskop beiliegt.
   Hinweis: In dieser Arbeit wurde ein Nikon-Mikroskop mit der Software NIS-elements BR 3.2 verwendet. Die Belichtungszeit wurde optimiert und für Kontroll- und Testpräparate gleich gehalten.
9. Messen Sie die Fluoreszenzintensität und Zellgröße einzelner Neuronen mit Bildgebungssoftware wie ImageJ (rsbweb.nih.gov/ij/index.html).

Ergebnisse

Mit der hier beschriebenen Methode haben wir muskelafferente Neuronen in DRG identifiziert und die spannungsgesteuerten Natriumkanäle (NaV) bestimmt, die von diesen Neuronen exprimiert werden. DiI-markierte muskelafferente Neuronen (Abbildung 1C) machten mit durchschnittlich 16% der markierten Neuronen (167/1047) einen kleinen Bruchteil der Gesamtpopulation von Neuronen in der DRG aus. Die Quantifizierung erfolgte zunächst durch Messung der Fluoreszenz mit ImageJ und Plotten von Histogrammen der Intensit...

Diskussion

Muskelafferenzen, die aus Trizepsmuskeln (z. B. Gastrocnemius) stammen, wurden in mehreren Studien zur Untersuchung des Trainingsdruckreflexes (EPR) ^verwendet13. Aufgrund des Interesses an der Untersuchung sensorischer Neuronen, die das EPR vermitteln, wurden die Gastrocnemius-Muskeln für die Farbstoffinjektion ausgewählt. DiI wurde aufgrund seiner lipophilen Natur ausgewählt und da es nicht durch Diffusion durch die intakte Plasmamembran aus dem Neuron verloren geht^3,14. Mit dieser Methode...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
NaV 1.8	Abcam	Ab93616
NaV 1.1 / 1.6/ 1.7 und 1.9	Alamone Labs, Jerusalem, Israel	ASC- 001/ 009 /008 /017
Alexa Fluor Sekundärantikörper	Invitrogen
Normales Ziegenserum
Fluor-Gel	Elektronenmikroskopie Sciences	17985