Herstellung von primären Neuronen für die Visualisierung von Neuriten in einem tiefgefrorenen Zustand unter Verwendung von Kryo-Elektronentomographie

Sarah H. Shahmoradian; Mauricio R. Galiano; Chengbiao Wu; Shurui Chen; Matthew N. Rasband; William C. Mobley; Wah Chiu

doi:10.3791/50783

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Methodenartikel

Herstellung von primären Neuronen für die Visualisierung von Neuriten in einem tiefgefrorenen Zustand unter Verwendung von Kryo-Elektronentomographie

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DOI:

10.3791/50783

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12. Februar 2014

Sarah H. Shahmoradian¹ , Mauricio R. Galiano² , Chengbiao Wu³ , Shurui Chen⁴ , Matthew N. Rasband² , William C. Mobley³ , Wah Chiu⁴

¹Department of Molecular Physiology and Biophysics, Baylor College of Medicine, ²Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine, ³Department of Neuroscience, University of California at San Diego, ⁴National Center for Macromolecular Imaging, Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baylor College of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Neuronale Prozesse zur ultrastrukturellen Analyse zu erhalten, beschreiben wir ein Protokoll für die Beschichtung von primären Neuronen auf Elektronenmikroskopie Gitter gefolgt von einem Blitzgefrieren, wodurch Proben in einer Schicht von glasartigem Eis suspendiert. Diese Proben können mit einer Kryo-Elektronenmikroskop auf Strukturen im Nanometerbereich sichtbar zu prüfen.

Zusammenfassung

Neuriten, beide Dendriten und Axone sind neuronale zelluläre Prozesse, die die Leitung der elektrischen Impulse zwischen den Neuronen zu ermöglichen. Festlegen der Struktur von Neuriten ist entscheidend für das Verständnis, wie diese Prozesse bewegen, Materialien und Signale, die synaptische Kommunikation unterstützen. Elektronenmikroskopie (EM) wurde traditionell verwendet, um die ultrastrukturelle Merkmale in Neuriten beurteilen, jedoch kann die Exposition gegenüber organischen Lösemittel während der Dehydratisierung und Harzeinbettungsstrukturen verzerren. Ein wichtiges Ziel ist die unerfüllte Formulierung von Verfahren, die für die strukturelle Auswertungen nicht durch solche Artefakte beeinflusst ermöglichen. Hier haben wir eine detaillierte und reproduzierbare Protokoll für wachsende und Schockgefrieren ganze Neuriten von verschiedenen primären Neuronen auf Elektronenmikroskopie Gitter gefolgt von deren Untersuchung mit Kryoelektronentomographie (Kryo-ET) eingerichtet. Diese Technik ermöglicht 3-D-Visualisierung von gefrorenen, hydratisierten Neuriten in Nanometer-Auflösung, die Erleichterung assessment ihrer morphologischen Unterschiede. Unser Protokoll liefert eine beispiellose Ansicht der Hinterwurzelganglien (DRG) Neuriten und eine Visualisierung des Hippocampus in der Nähe von Neuriten-nativen Zustand. Als solche sind diese Methoden schaffen ein Fundament für zukünftige Studien auf Neuriten der beiden normalen Neuronen und die von neurologischen Erkrankungen betroffen.

Einleitung

Neuronen stellen die komplexe Schaltung für die Funktion des zentralen und peripheren Nervensystem durch die Ausarbeitung Dendriten und Axone, um Informationen, die oft recht lang, um mit nachgeschalteten Neuronen kommunizieren. Neuritenwachstum spielt eine fundamentale Rolle in der Embryonalentwicklung und neuronalen Differenzierung und Erhaltung von Neuriten kritisch unterstützt die Funktion des Nervensystems. Neuritische Prozesse verfügen kritisch in neuronalen Verletzungen und Regeneration sowie Erkrankungen des Nervensystems. Die Untersuchung der neuronalen Architektur ist entscheidend, sowohl die normalen und erkrankten Gehirn zu verstehen. Glücklicherweise gib....