Neuronen stellen die komplexe Schaltung für die Funktion des zentralen und peripheren Nervensystem durch die Ausarbeitung Dendriten und Axone, um Informationen, die oft recht lang, um mit nachgeschalteten Neuronen kommunizieren. Neuritenwachstum spielt eine fundamentale Rolle in der Embryonalentwicklung und neuronalen Differenzierung und Erhaltung von Neuriten kritisch unterstützt die Funktion des Nervensystems. Neuritische Prozesse verfügen kritisch in neuronalen Verletzungen und Regeneration sowie Erkrankungen des Nervensystems. Die Untersuchung der neuronalen Architektur ist entscheidend, sowohl die normalen und erkrankten Gehirn zu verstehen. Glücklicherweise gibt es physiologisch relevanten neuronalen Zellkultur-Systeme, dass komplexe und heterogene Zellstrukturen rekapitulieren kann. Auf der Grundlage der experimentellen Aufklärung der festen Plattformen effektive Visualisierung Strategien, die qualitativen und quantitativen Analysen der neuronalen Morphologie ermöglichen benötigt. Besonders nützlich wäreist eine detaillierte Methode, die eine einheitliche Plattform zur Visualisierung von Neuriten, beide Axonen und Dendriten im Nanometerbereich enthält.
Traditionelle Elektronenmikroskopie erfordert die Verwendung von organischen Lösungsmittels während der Dehydratisierung und Harzeinbettung, die Verzerrungen in den Proben von ihrem wahren Zustand induzieren kann. So die Interpretation der Ergebnisse 4,9,25 Begrenzung - Bis heute sind die meisten strukturellen Charakterisierung auf der Nanometerskala auf größere Zellen oder Geweben, die zu solchen aggressiven Chemikalien ausgesetzt sind, basiert. Darüber hinaus für die Elektronenstrahldurch, Schnitte für Organismen oder Zell Vorsprünge aufweist eine Dicke von mehr als 1 um 12 erforderlich. Schließlich, geschnitten oder gefräst Gewebe Ergebnisse in der Sammlung von diskreten Scheibe spezifischen Datensätzen, so schwerfällig die Definition des Lang Funktion von Neuriten. Selbst für Kryo-EM, in der Schnitt eine tiefgefrorenen Probe möglich ist, stellt die Methode Kompression Artifwirkt ein.
In den letzten Jahren haben die Forscher gelernt, wie Neuronen im Hippocampus direkt auf EM-Gitter und Flash-Einfrieren in flüssigem Ethan zu Neuriten mit Kryo-ET 8,10,18,23 anschließend visualisieren wachsen. Doch solche Studien entweder eine Sonderanfertigung 10,23 oder mangelnde Informationen über die Löschschritt zum Erzeugen dünn genug glasigen Eis für Routine-Visualisierung 8,18. Zum Beispiel empfiehlt eine Studie, die Verwendung von 30-40 sec für Abtupfen der EM Gitter 10, jedoch ist dieser Wert nicht für den allgemeinen Gebrauch optimiert, sondern ist spezifisch für diese maßgeschneiderte Tauchgefriergerät. Mit einer Sonderanfertigung, anstatt einen handelsüblichen 17 ein für die Aufrechterhaltung der Luftfeuchte vor stürzen Gefrieren der Probe kann eine Hürde für die weit verbreiteten Reproduzierbarkeit darstellen.
Während diese Studien haben bei der Visualisierung von Neuriten Kryo-ET bahnbrech wurde, haben wir einen Schritt weiter, um die ap erkundenbarkeit der Kryo-ET zu einer Vielzahl von neuronalen Proben (hippocampalen und dorsalen Wurzelganglienneuronen). Darüber diskutieren wir beide optimale und suboptimale Ergebnisse sowie die möglichen Artefakte, die auftreten können mit einem Kryo-ET für solche Proben.
Definieren einer detaillierten Technik für die Erhaltung und Visualisierung ganze Neuriten im Nanometerbereich in einer nahezu nativen Zustand würde die Fähigkeit für mehr Forscher zur Durchführung von ultrastrukturellen Studien zu verbessern. Zu diesem Zweck wird mit kommerziell erhältlichen Ausrüstung, um nicht fixierte, ungefärbten Neuronen vorzubereiten, zu visualisieren Neuriten beschreiben wir eine effektive und detaillierte Protokoll. Dies ist ein wichtiger erster Schritt zur Detaillierung der Ultrastruktur von gesunden Neuriten und den Grundstein für das Verständnis, was strukturelle Unterschiede im Nervensystem Modelle Krankheit vorliegen legen. Seit Kryo-ET kann nicht fixierten, ungefärbten Neuriten-Funktionen in 3-D auf der Nanometerskala zu beheben, wird das Verfahren machen es möglich, wie nieVordergrund zu neuritische Architektur 12 zu definieren.