Dieser Artikel beschreibt ein in situ-Hybridisierungsprotokoll für die kolorimetrische Detektion der microRNA Expression in Formalin fixiert Nierenschnitten optimiert.
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In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
In diesem Artikel beschreiben wir eine Methode zur kolorimetrischen Nachweis von miRNA in der Niere durch in-situ-Hybridisierung mit Digoxigenin markierten Sonden microRNA. Dieses Protokoll, das ursprünglich von Kloosterman und Kollegen für eine breite Verwendung mit Exiqon miRNA Sonden 1 entwickelt, wurde modifiziert, um Herausforderungen in der miRNA-Analyse im Nierengewebe zu überwinden. Dazu gehören Themen wie Identifikation und Struktur schwer zu Rest Sonde und Antikörper zu entfernen. Die Verwendung von relativ dünnen, 5 mm dick, Gewebeschnitte erlaubt für klare Visualisierung von Nieren Strukturen, während eine starke Probe-Signal wurde in den Zellen zurückgehalten. Zusätzlich wurden Sondenkonzentration und Inkubationszeit Bedingungen optimiert, um die Visualisierung von microRNA Expression mit niedrigen Hintergrund und unspezifische Signal zu erleichtern. Hier wird die optimierte Protokoll beschrieben, im Anfangsgewebeentnahme und Vorbereitung durch die Montage der Schieber am Ende des Verfahrens. Die Grund components dieses Protokoll kann für die Anwendung auf anderen Geweben und Zellkulturmodelle verändert werden.
Einleitung
MicroRNA sind kleine (ca. 22 Nukleotide lange) nicht-kodierenden RNAs, die endogen produziert werden. Sie funktionieren in der Regel um die Proteinexpression durch translationale Repression oder mRNA-Abbau zu unterdrücken. miRNAs binden an mRNA Ziele mit unvollständigen Komplementarität, die es ermöglicht, eine einzelne miRNA auf mehrere Ziele zu unterdrücken.
Zu verstehen, welche Zelltypen und Strukturen auszudrücken miRNAs ist ein wichtiger Teil der das Verständnis der Mechanismen, durch die Veränderungen in der miRNA-Expression Einfluss Zell-und Gewebe Phänotypen. Während Methoden wie miRNA-Sequenzierung, qPCR und Northern Blot zur Det....
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Protokoll
1. Nierengewebeschnitten
- Formalin-fixierte (10%) und in Paraffin eingebetteten Nierenschnitte auf Objektträger mit 5 mm Dicke mit einem Microm HM 355 S. Die Folien können mehrere Monate vor der Analyse gelagert werden geschnitten.
2. Herstellung der Lösung
- Bereiten 1 l 1x PBS in ddH 2 O in einer autoklavierbar Schraubverschluss der Flasche. Füllen Sie eine Flasche mit 1 l ddH 2 O. 1 ml DEPC zu jeder Flasche, Deckel und kräftig schütteln. Lassen Sie die Lösungen sitzen über Nacht bei Raumtemperatur auf RNAsen zu zerstören und dann im Autoklaven. 400 ml Tween-20 zu 1 l 1x PBS auf PBS-T zu ma....
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Ergebnisse
Die Bereiche von einem Gewebeschnitt, die während der Hybridisierungen, Inkubationen getrocknet werden oder Waschschritte der Regel am Ende dunkler Färbung während der NBT / BCIP Entwicklung. Abbildung 1 zeigt einen Teil einer Niere Abschnitt, in dem die HybriSlip rutschte der Kante das Gewebe, so dass sie teilweise dehydriert. Trotz Rehydrierung und Abdeckung in den verbleibenden Schritten wird das Signal in dem entwässerten Teil künstlich hoch.
Die Bedeutung der Steuerung .......
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Diskussion
Das Ziel dieses Artikels war es, ein Protokoll für die miRNA-in-situ-Hybridisierung, die gut funktioniert in Formalin fixiert Nierengewebe zu beschreiben. Während der Erarbeitung dieses Protokoll mehrere wichtige Quellen der Färbung Artefakt identifiziert worden. Besondere Aufmerksamkeit auf diese Punkte können zur Vermeidung Färbung Artefakt und erhöhen die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen ISH Sicht.
Eines der am meisten vermeidbaren Ursachen der Färbung Artefakt kann auftret.......
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Offenlegungen
Es gibt nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde vom US-amerikanischen National Institutes of Health und gewährt HL082798 HL111580.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Paraformaldehyd | Sigma | P6148 | |
| PBS | Gibco | 70011044 | |
| Diethyl Pyrocarbonat | Sigma | D5758 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Xylole | Sigma | 534056 | |
| Ethanol | Ultra Pure | 200CSPTP | |
| Tris-HCl | Lebensdauer Technologies | 15506-017 | |
| CaCl2 | Sigma | C2536 | |
| Glycin | J.T. Baker | 4059-00 | |
| Zitronensäure | Sigma | C2404 | |
| Formamid | Sigma | F9037 | |
| 20x SSC Puffer | Life Technologies | 15557-044 | |
| Heparin | SAGENT | 25021-400-30 | |
| Hefe-RNA | Life Technologies | AM7118 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-1004 | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| 3' DIG-miRNA-Sonde | Exiqon | miR abhängig-05 | |
| 3' DIG- Verschlüsselte miR-Sonde | Exiqon | 99004-05 | |
| 3' DIG-U6 miR Sonde | Exiqon | 99002-05 | |
| Anti-Digoxigenin-Ab Fab | Roche | 11093274910 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Deckgläser | Fisher | Fit an Gewebegröße | |
| Microtom HM 355 S | Thermo Scientific | 23-900-672 | |
| In-Slide-Out-Hybridisierungsofen | Boekel | 241000 | |
| Aluminium-Tablettbaugruppe | Boekel | C2403973 | |
| Edelstahl-Rack-Einsatz | Boekel | C2403754 |
Referenzen
- Nagalakshmi, V. K., Ren, Q., Pugh, M. M., Valerius, M. T., McMahon, A. P., Yu, J. Dicer regulates thedevelopment of nephrogenic and ureteric compartments in the mammalian kidney. Kidney Int. 79 (3), 317-330 (2011).
- Ho, J., Pandey, P., Schatton, T., Sims-Lucas, S., Khalid, M., Frank, M. H., Hartwig, S., Kreidberg, J. A.
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Nachdrucke und Genehmigungen
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