Es werden Verfahren beschrieben, um gleichzeitige Aufzeichnungen des Membranpotentials oder -stroms und Änderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration durchzuführen. Neuronen des suprachiasmatischen Kerns werden mit dem Kalziumindikator Bis-Fura-2 unter Verwendung einer Patch-Clamp-Elektrode in der Ganzzell-Patch-Clamp-Konfiguration gefüllt.
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Methodenartikel
Gleichzeitige elektrophysiologische Aufzeichnung und Calcium-Bildgebung von Neuronen des suprachiasmatischen Kerns
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Gleichzeitige elektrophysiologische und fluoreszierende bildgebende Aufzeichnungsmethoden wurden verwendet, um die Rolle von Änderungen des Membranpotentials oder des Membranstroms bei der Regulierung der intrazellulären Kalziumkonzentration zu untersuchen. Veränderte Umweltbedingungen, wie z. B. der Hell-Dunkel-Zyklus, können die Aktivität neuronaler und neuronaler Netzwerke und die Expression einer Familie von Genen für die zirkadiane Uhr im suprachiasmatischen Kern (SCN) verändern, dem Ort der zirkadianen Uhr im Gehirn von Säugetieren. Die exzitatorische synaptische Übertragung führt zu einem Anstieg der postsynaptischen Ca2+-Konzentration, von der angenommen wird, dass sie die Signalwege aktiviert, die die rhythmische Expression von Genen der zirkadianen Uhr verschieben. Hypothalamusschnitte, die das SCN enthielten, wurden mit Mikroelektroden gepflastert, die mit einer internen Lösung gefüllt waren, die den Calciumindikator Bis-Fura-2 enthielt. Nachdem eine Versiegelung zwischen der Mikroelektrode und der neuronalen Membran des SCN gebildet worden war, wurde die Membran durch sanftes Saugen aufgerissen und die Kalziumsonde in das Neuron diffundiert, wodurch sowohl das Soma als auch die Dendriten gefüllt wurden. Quantitative ratiometrische Messungen der intrazellulären Calciumkonzentration wurden gleichzeitig mit dem Membranpotential bzw. -strom aufgezeichnet. Mit diesen Methoden ist es möglich, die Rolle von Änderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration zu untersuchen, die durch synaptische Aktivität und das Feuern des Aktionspotentials einzelner Neuronen hervorgerufen werden. In dieser Präsentation demonstrieren wir die Methoden zur gleichzeitigen Aufzeichnung der elektrophysiologischen Aktivität zusammen mit intrazellulärem Kalzium von einzelnen SCN-Neuronen, die in Hirnschnitten gehalten werden.
Einleitung
Es ist bekannt, dass Veränderungen in der Genexpression in Neuronen als Folge der synaptischen Signalübertragung auftreten. Die Signalübertragung durch den exzitatorischen Neurotransmitter Glutamat kann das neuronale Membranpotential depolarisieren, was schließlich zur Gentranskription und -translation führt1,2. Die Aktivierung ionotroper Rezeptoren durch Glutamat ermöglicht es extrazellulären Kalziumionen, in die Zelle einzudringen, von der angenommen wird, dass sie als zweiter Botenstoff eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung der Gentranskription spielt. Die Bewertung der Beziehung zwischen der elektrischen Aktivität der Membran, wie z. B. der Auslö....
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Protokoll
1. Vorbereitung von Hypothalamus-Hirnschnitten
- Im Voraus die Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) für jedes Verfahren mit Tieren einholen. Die hier beschriebenen tierexperimentellen Verfahren stehen im Einklang mit den AVMA-Richtlinien für die Euthanasie von Tieren 2013 und wurden im Voraus von der Oregon Health & Science University IACUC genehmigt.
- Bereiten Sie 500 ml des Schneidepuffers ohne MgCl2 und CaCl2 vor (Tabelle 1). Die Lösung wird bei Raumtemperatur mit 95 % O2 und 5 % CO2 gefüllt, dann MgCl2 und CaCl2
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Ergebnisse
Unter Verwendung von hypothalamischen Gehirnschnitten haben wir gleichzeitig Änderungen des intrazellulären Kalziums im Ganzzellmodus sowohl im Spannungs- als auch im Strom-Klemm-Modus aufgezeichnet. Die in Abbildung 1A gezeigte Mikroelektrode wird unter hoher Vergrößerung (40X oder 63X UV-Objektive) mit leichtem positivem Druck in Position gebracht. Nach Kontakt mit dem Neuron wird durch sanftes Absaugen ein Gigaohm-Siegel gebildet. Im Spannungsklemm-Modus wird nach Einstellung des Zellmembranpotentials.......
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Diskussion
Die oben beschriebenen Methoden bieten ein leistungsfähiges Werkzeug, um gleichzeitig den Zusammenhang zwischen der elektrischen Aktivität der Neuronenmembran und der intrazellulären Kalziumkonzentration aufzuzeichnen. Die Methode hat eine Reihe von Stärken, da sie zwei sehr gut charakterisierte Methoden kombiniert - die Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung und die Messung von intrazellulärem Kalzium mit Fluoreszenzfarbstoffen. Unser Ansatz ähnelt dem, der von anderen Forschern beschrieben wurde6,23.
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Die Arbeit wurde durch ein Stipendium des National Institute of General Medical Sciences (GM096972) finanziert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| NaCl | Fisher Scientific Co. | S271-3 | |
| KCl | Fisher Scientific Co. | P217-500 | |
| NaH2PO4• H2O | Sigma Chemical Co. | S-9638 | |
| MgCl2• 6H2O | Fisher Scientific Co. | M33-500 | |
| CaCl2• 2H2O | Fisher Scientific Co. | C79-500 | |
| D-Glukose | Fisher Scientific Co. | D16-500 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific Co. | S233-500 | |
| Saccharose | Fisher Scientific Co. | S5-500 | |
| Kalium-D-gluconat | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Adenosin 5′-triphosphat dikaliumsalz | Dihydrat Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Guanosin 5′-triphosphat tris salz | Sigma-Aldrich | G9002 | |
| Agarose (ultrarein) | Leben Technologien | 15510-027 | Gel in steriler Petrischale poriert 6 mm dicke Schicht |
| KOH | Sigma-Aldrich | P-6310 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S-5881 | |
| Bis-fura-2, hexakaliumsalz | Invitrogen | B6810 | Zellundurchlässig |
| Name des Gerätes | Firma | Katalognummer | Bemerkungen |
| Mikrotom | Leica | VT1000S | Tissue Slicing |
| Cyanoacryl Kleber (Roti-Coll1) | Carl Roth GmbH+Co | Art-Nr. 0258.1 | |
| Mikroelektrodenabzieher | Narshige International USA | PP-83 | |
| Mikroelektrode Kapillarrohre | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
| Microfil 34 g | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Spritzenvorsatzfilter | Corning | #431212 | |
| Mikroskop | Leica | DM LFS | Mit 4X, 40X UV und 63X UV-Objektiven und Epifluoreszenz |
| CCD Kamera | Hamamatsu | ORCA ER | 12 Bit CCD |
| Fura-2 Filter Cube | Chroma | 71500A | Set mit UG11 Filter |
| Polychrome | IV Till Photonics GmBH | Monochronometer | |
| Ultraviolett blockierende Schutzbrille | Ultraviolett Produkte | ||
| EPC-9 Verstärker | HEKA Eletronik | ||
| Metafluor | Molekulare Bauelemente | Imaging Software | |
| Patchmaster | HEKA Eletronik | Datenerfassungssoftware | |
| Igor Version 6 | Wavemetrics | Elektrophysiologie & Ca2+ Datenanalyse | |
| VAPRO 5520 | Westcor | Dampfdruckosmometer |
Referenzen
- Bading, H., Ginty, D. D., Greenberg, M. E. Regulation of gene expression in hippocampal neurons by distinct calcium signaling pathways. Science. 260, 181-186 (1993).
- Ghosh, A., Ginty, D. D., Bading, H., Greenberg, M. E. Calcium regulation of gene expression in neuronal cells.....
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Nachdrucke und Genehmigungen
