Gleichzeitige elektrophysiologische Aufzeichnung und Calcium-Bildgebung von Neuronen des suprachiasmatischen Kerns

Zusammenfassung

Es werden Verfahren beschrieben, um gleichzeitige Aufzeichnungen des Membranpotentials oder -stroms und Änderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration durchzuführen. Neuronen des suprachiasmatischen Kerns werden mit dem Kalziumindikator Bis-Fura-2 unter Verwendung einer Patch-Clamp-Elektrode in der Ganzzell-Patch-Clamp-Konfiguration gefüllt.

Zusammenfassung

Gleichzeitige elektrophysiologische und fluoreszierende bildgebende Aufzeichnungsmethoden wurden verwendet, um die Rolle von Änderungen des Membranpotentials oder des Membranstroms bei der Regulierung der intrazellulären Kalziumkonzentration zu untersuchen. Veränderte Umweltbedingungen, wie z. B. der Hell-Dunkel-Zyklus, können die Aktivität neuronaler und neuronaler Netzwerke und die Expression einer Familie von Genen für die zirkadiane Uhr im suprachiasmatischen Kern (SCN) verändern, dem Ort der zirkadianen Uhr im Gehirn von Säugetieren. Die exzitatorische synaptische Übertragung führt zu einem Anstieg der postsynaptischen Ca2⁺-Konzentration, von der angenommen wird, dass sie die Signalwege aktiviert, die die rhythmische Expression von Genen der zirkadianen Uhr verschieben. Hypothalamusschnitte, die das SCN enthielten, wurden mit Mikroelektroden gepflastert, die mit einer internen Lösung gefüllt waren, die den Calciumindikator Bis-Fura-2 enthielt. Nachdem eine Versiegelung zwischen der Mikroelektrode und der neuronalen Membran des SCN gebildet worden war, wurde die Membran durch sanftes Saugen aufgerissen und die Kalziumsonde in das Neuron diffundiert, wodurch sowohl das Soma als auch die Dendriten gefüllt wurden. Quantitative ratiometrische Messungen der intrazellulären Calciumkonzentration wurden gleichzeitig mit dem Membranpotential bzw. -strom aufgezeichnet. Mit diesen Methoden ist es möglich, die Rolle von Änderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration zu untersuchen, die durch synaptische Aktivität und das Feuern des Aktionspotentials einzelner Neuronen hervorgerufen werden. In dieser Präsentation demonstrieren wir die Methoden zur gleichzeitigen Aufzeichnung der elektrophysiologischen Aktivität zusammen mit intrazellulärem Kalzium von einzelnen SCN-Neuronen, die in Hirnschnitten gehalten werden.

Einleitung

Es ist bekannt, dass Veränderungen in der Genexpression in Neuronen als Folge der synaptischen Signalübertragung auftreten. Die Signalübertragung durch den exzitatorischen Neurotransmitter Glutamat kann das neuronale Membranpotential depolarisieren, was schließlich zur Gentranskription und -translation führt^1,2. Die Aktivierung ionotroper Rezeptoren durch Glutamat ermöglicht es extrazellulären Kalziumionen, in die Zelle einzudringen, von der angenommen wird, dass sie als zweiter Botenstoff eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung der Gentranskription spielt. Die Bewertung der Beziehung zwischen der elektrischen Aktivität der Membran, wie z. B. der Auslösefrequenz des Aktionspotentials, und Änderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration erfordert die Kombination von zwei Methoden - Ganzzell-Patch-Klemmung und quantitative Bildgebung von fluoreszierenden Kalziumsonden^3-5, wodurch die Beziehung in einzelnen Neuronen untersucht werden kann. Die Einzelzellaufzeichnungstechnik ermöglicht die Aufzeichnung der Aktivität einzelner Neuronen in identifizierbaren Teilen des Gehirns. Die Ganzzellenaufzeichnungstechnik ermöglicht die Steuerung der Membranspannung oder des Membranstroms und ermöglicht die experimentelle Manipulation spezifischer Ionenkanalströme. Die Verwendung von Mikropipetten, die mit fluoreszierenden Kalziumsonden gefüllt sind, stellt auch sicher, dass das Neuron gut mit Kalziumsonde gefüllt ist. Diese Technik hat einen klaren Vorteil bei der Arbeit mit Hirnschnittpräparaten aus Schnittpräparaten für Erwachsene, da diese Neuronen mit den gebräuchlicheren zellpermediären Sonden besonders schwer zu laden sind und potenzielle Hintergrundfluoreszenzprobleme^{reduziert 6-8}.

Licht ist die wichtigste Art und Weise, wie Säugetiere ihre zirkadiane Uhr einstellen, die sich im hypothalamischen suprachiasmatischen Kern (SCN) befindet. Die in der Netzhaut übertragene Lichtinformation wird ^9-11 über den Retinohypothalamustrakt (RHT) übertragen, wo Glutamat im SCN freigesetzt wird^12,13. Glutamat öffnet ionotrope NMDA- und AMPA-Rezeptoren, die sich auf SCN-Neuronen befinden, produziert einen Einstrom von Kalzium und Natrium und initiiert eine intrazelluläre Signalkaskade, die letztendlich zu einer Veränderung der Expression einer Familie von Uhrengenen^14-17 und Phasenverschiebungen der zirkadianen Uhr^18-20 führt. Kalzium kann jedoch entweder direkt über ionotrope Glutamatrezeptoren oder durch Membrandepolarisation und Aktivierung spannungsabhängiger Kalziumkanäle (VDCC) in Neuronen ^eindringen21. Wir haben daher ein experimentelles Protokoll entwickelt, um die Beziehung zwischen der intrazellulären Kalziumkonzentration und der elektrischen Aktivität der Membran in SCN-Neuronen zu untersuchen, wie sie beispielsweise beim Feuern des Aktionspotentials und beim synaptischen Input²² auftritt.

Protokoll

1. Vorbereitung von Hypothalamus-Hirnschnitten

1. Im Voraus die Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) für jedes Verfahren mit Tieren einholen. Die hier beschriebenen tierexperimentellen Verfahren stehen im Einklang mit den AVMA-Richtlinien für die Euthanasie von Tieren 2013 und wurden im Voraus von der Oregon Health & Science University IACUC genehmigt.
2. Bereiten Sie 500 ml des Schneidepuffers ohne MgCl₂ und CaCl₂ vor (Tabelle 1). Die Lösung wird bei Raumtemperatur mit 95 % O₂ und 5 % CO₂ gefüllt, dann MgCl₂ und CaCl₂ hinzugefügt, während die Belüftung fortgesetzt wird. Stellen Sie die Osmolarität mit Saccharose auf 300 mOsm ein. Die Osmolarität wird mit einem Dampfdruckosmometer gemessen.
3. Bereiten Sie 1 l des Aufzeichnungsmediums ohne MgCl₂ und CaCl₂ vor (Tabelle 2). Blasen Sie die Lösung mit 95 %_O2 und 5 % CO₂ und fügen Sie dann MgCl₂ und CaCl₂ hinzu, während Sie weiter belüften. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH (10 N) auf 7,2-7,4 und die Osmolarität mit Saccharose auf 300 mOsm ein. Die Zugabe von HEPES-Puffer ist optional und wurde verwendet, um den pH-Wert weiter zu stabilisieren.
4. Die Schneid- und Aufzeichnungslösungen können vor der Verwendung mehrere Tage im Kühlschrank aufbewahrt werden.
5. 3% Agarose zubereiten und in eine sterile Petrischale (6 mm tief) geben und kühl stellen.
6. Schneiden Sie drei Würfel Agarose ca. 6 mm x 6 mm x 6 mm ab.
7. Betäubt eine vier bis acht Wochen alte Sprague-Dawley-Ratte tief mit Isofluran. Testen Sie die Tiefe der Anästhesie. Die Narkosetiefe wird als angemessen erachtet, wenn nach dem Einklemmen des Fußballens kein Rückzugsreflex der hinteren Extremität auftritt. Sobald die Ratte angemessen betäubt ist, wird sie durch schnelle Enthauptung eingeschläfert.
8. Entfernen Sie schnell das Gehirn, achten Sie darauf, zuerst die Sehnerven zu durchtrennen, und legen Sie es in eine eiskalte Schnittlösung, die mit 5% CO₂ und 95% O₂ gesättigt ist, und lassen Sie es 2-3 Minuten abkühlen.
9. Trimmen Sie das Gehirn. Legen Sie das Gehirn mit einer Pinzette auf ein angefeuchtetes (mit Schnittlösung) kreisförmiges Filterpapier, das auf eine auf Eis stehende Petrischale aus Glas gelegt ist.
10. Schneiden Sie das Gehirn koronal, um das verbleibende Kleinhirn und den Hirnstamm zu entfernen, dann die rostrale Rinde und die Seiten, um einen Gehirnblock zu hinterlassen, der den Hypothalamus enthält, wobei die Seite mit SCN, Sehnerven und Optikuschiasma sorgfältig erhalten bleibt.
11. Verteilen Sie eine dünne Schicht Cyanoacrylkleber, groß genug, um das Gehirn und die Agaroseblöcke in einer eiskalten, aber trockenen Mikrotom-Schneidekammer zu befestigen.
12. Übertragen Sie den eiskalten Hirnblock mit der kaudalen Seite nach unten auf den Kleber, wobei die Seite mit dem SCN zuerst zum Schneiden positioniert ist, wobei die Sehnerven ein "V" bilden, das nach oben zeigt.
13. Legen Sie die Agaroseblöcke auf die anderen 3 Seiten. Füllen Sie die Kammer mit eiskaltem Schneidepuffer, der kontinuierlich mit 5 % CO₂ und 95 % O₂ gefüllt ist. Der Cyanoacrylatkleber verfestigt sich mit Feuchtigkeit und hält das Gehirn und die Agaroseblöcke an Ort und Stelle.
14. Schneiden Sie koronale hypothalamische Scheiben (220-250 μm dick), die das SCN enthalten, mit dem vibrierenden Klingenmikrotom. Typischerweise wird ein Schnitt gewählt, bei dem das Chiasma opticus einen Durchmesser von etwa 2-4 mm hat und wie ein weißes Band erscheint, wobei SCN nur dorsal erscheint und als zwei kleine "Vertiefungen" im Chiasma opticus auf beiden Seiten des 3^. Ventrikels erscheint (Abbildung 1A).
15. Legen Sie die Scheiben in die Aufnahmekammer (36 °C), die auf dem Tisch eines Leica DMLFS-Mikroskops montiert ist. Die Kammer wird mit kontinuierlich fließender Aufzeichnungslösung (2 ml/min) gefüllt, mit 95 % O₂ und 5 % CO₂ belüftet und mit einem Inline-Heizer vorgewärmt.
16. Führen Sie Ganzzell-Patch-Clamp- und Calcium-Imaging-Aufzeichnungen in SCN-Neuronen 0,5 bis 8 Stunden nach der Schnittvorbereitung durch.

2. Patch Clamp Aufnahme

1. Bereiten Sie die Elektrodenlösung (intrazelluläre) Lösung in der Hälfte des gesamten Endvolumens Wasser vor.
2. Stellen Sie die Lösung mit KOH (1 N) auf pH 7,3 ein.
3. Das restliche Wasser hinzufügen. Die endgültige Osmolarität der Lösung sollte im Bereich von 280-290 mOsm liegen.
4. Die Elektrodenlösung durch einen 0,2-μm-Filter leiten, aliquot (0,5 ml) in Mikrofuge-Röhrchen geben und bei -20 °C lagern.
5. Bereiten Sie die Bis-Fura-2-Hexakaliumsalz-Stammlösung (10 mM) der Calciumsonde vor, indem Sie 1 mg Bis-Fura-2-Hexakaliumsalz mit 99,29 μl 0,2 μm gefiltertem Wasser mischen.
6. In separate Röhrchen (je 2-5 μl) aliquotieren und einfrieren (-20 °C).
Tauen Sie
7. kurz vor Gebrauch ein Aliquot der internen Lösung und die Ca²⁺-Sonde auf. 2 μl der Bis-Fura-2-Stammlösung zu 400 μl der internen Lösung hinzufügen, um eine abschließende Calciumsondenkonzentration von 50 μM zu erhalten. Kurz verreiben, um die Lösungen zu mischen. Die Konzentration der Kalziumsonde (10-250 μM) variiert je nach Versuchsdesign und Bildgebungssystem. Beachten Sie, dass Bis-Fura-2 aus zwei miteinander verknüpften Fura-2-Molekülen besteht.
8. Ziehen Sie Ganzzell-Patch-Elektroden in zwei Stufen auf einen äußeren Spitzendurchmesser von ca. 1 μm und Widerstände von 7-10 MΩ, wenn sie mit der intrazellulären Lösung gefüllt sind.
9. Füllen Sie die Elektrode mit einigen μl der internen Lösung auf, die die Kalziumsonde enthält, die mit einem 4-mm-Spritzenvorsatzfilter (0,2 μm) für Proben mit geringem Volumen über ein Microfil-Röhrchen filtriert wurde.
10. Üben Sie einen kleinen Überdruck auf die Elektrode aus, während sie unter Rotlichtbeleuchtung in die Aufnahmekammer geführt wird, während sie auf einem Videomonitor betrachtet wird.
11. Platzieren Sie die Mikroelektrode mit einem Objektiv mit geringer Leistung (4X) über dem SCN. Der SCN wird als die beiden durchscheinenden Bereiche auf beiden Seiten des dritten Ventrikels und dorsal des Chiasmas opticus identifiziert (Abbildung 1A).
12. Schalten Sie das Mikroskop auf eine hohe Vergrößerung (40x oder 63x) um. Subregionen des SCN und einzelne SCN-Neuronen können für die Aufzeichnung bei höherer Vergrößerung anvisiert werden.
13. Üben Sie einen sanften positiven Druck auf die Mikroelektrode aus, während sie auf die Oberfläche eines Neurons vorgeschoben wird.
14. Üben Sie einen sanften Unterdruck auf die Mikroelektrode aus, um eine Dichtung mit Widerständen von 3-10 GΩ zu bilden.
15. Stellen Sie die Membranspannung auf -60 mV ein, wobei der Verstärker mit der Erfassungssoftware gesteuert wird.
16. Üben Sie zusätzlichen Unterdruck auf die Elektrode aus, um die Zellmembran in den Ganzzellmodus zu brechen.
17. Beim Übergang in den Ganzzellmodus füllen sich das SCN-Neuron, das Soma und die Dendriten mit einer Fluoreszenzsonde.
18. Die Membranspannung wird im Strom-Clamp-Modus oder der Strom im Voltage-Clamp-Modus gemessen, während die Bilddaten der Kalziumsonde überwacht und gespeichert werden (siehe unten). Sehen Sie sich die aufgenommenen Bilder zusammen mit einem Diagramm der Fluoreszenzdaten im Verhältnis 340 nm/380 nm während des Experiments an.

3. Messung von intrazellulärem Ca²⁺

1. Quantitative Ca2⁺-Messungen werden durch die Aufnahme eines Bildpaares erhalten, indem das Gewebe über ein Monochronometer mit einer Bandbreite von 10 nm schnell mit UV-Licht bei 340 nm und 380 nm angeregt und durch einen optischen UG11-Filter geleitet wird, um harmonische Wellenlängen über 400 nm zu begrenzen, ein dichroitisches DCLP-Licht von 400 nm und emittiertes Licht durch einen Emissionsfilter von 510±40 nm.
2. Die Bilder werden mit einer gekühlten CCD-Kamera aufgenommen, wobei die Aufnahmezeit und das Binning angepasst wurden, um Photobleaching zu minimieren und die Aufnahmegeschwindigkeit zu maximieren.
3. Zur Erfassung und Anzeige der Bilder wird eine quantitative Bildgebungssoftware verwendet.
4. Wählen Sie aus dem Ausgangsbild die interessierenden Bereiche aus, die in Daten der relativen Fluoreszenzintensitätseinheit konvertiert werden sollen (z. B. Soma, Dendrit usw.). Wählen Sie auch einen Bereich für die Messung der Hintergrundfluoreszenz aus (Abbildung 1B).
5. Rohbilder und quantifizierte optische Daten werden während des Experiments kontinuierlich gespeichert. Nach dem Experiment werden die gespeicherten Bilder in der Regel erneut analysiert, wenn mehr Zeit für die genauere Auswahl der zu quantifizierenden Regionen von Interesse aufgewendet werden kann.
6. Die Daten können als geschätzte intrazelluläre Calciumkonzentration (Est[Ca²⁺]i) dargestellt werden. Zur Berechnung der Calciumkonzentration^wird das Verhältnis (R) des emittierten Lichts nach Anregung und Hintergrundsubtraktion bei 340 nm dividiert durch 380 nm zusammen mit der maximalen und minimalen Fluoreszenz bei 340 nm und 380 nm verwendet. Die Subtraktion im Hintergrund und andere Berechnungen werden mit Hilfe von Datenanalysesoftware durchgeführt.
7. Eine in vitro Bestimmung der maximalen und minimalen Bis-Fura-2-Fluoreszenz kann unter Verwendung von 10 mM CaCl₂ für^Ca2+-gebundene und 10 mM EGTA für^Ca2+-freie Bedingungen durchgeführt werden. Die Ca2⁺-Dissoziationskonstante Kd der Sonde wird für Bis-Fura-2 (Invitrogen) mit 370 nM angenommen.

Ergebnisse

Mit Hilfe von hypothalamischen Hirnschnitten haben wir gleichzeitig Veränderungen des intrazellulären Kalziums im Ganzzellmodus sowohl unter Spannungs- als auch unter Stromklemmenbedingungen aufgezeichnet. Die in Abbildung 1A gezeigte Mikroelektrode wird unter hoher Vergrößerung (40-fache oder 63-fache UV-Objektive) mit einem geringen positiven Druck in ihre Position abgesenkt. Nach der Berührung des Neurons bildet sich mit sanftem Sog eine Gigaohm-Dichtung. Im Voltage-Clamp-Modus nach dem Einstellen des...

Diskussion

Die oben beschriebenen Methoden bieten ein leistungsfähiges Werkzeug, um gleichzeitig den Zusammenhang zwischen der elektrischen Aktivität der Neuronenmembran und der intrazellulären Kalziumkonzentration aufzuzeichnen. Die Methode hat eine Reihe von Stärken, da sie zwei sehr gut charakterisierte Methoden kombiniert - die Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung und die Messung von intrazellulärem Kalzium mit Fluoreszenzfarbstoffen. Unser Ansatz ähnelt dem, der von anderen Forschern beschrieben wurde^_6,23.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
NaCl	Fisher Scientific Co.	S271-3
KCl	Fisher Scientific Co.	P217-500
NaH2PO4• H2O	Sigma Chemical Co.	S-9638
MgCl2• 6H2O	Fisher Scientific Co.	M33-500
CaCl2• 2H2O	Fisher Scientific Co.	C79-500
D-Glukose	Fisher Scientific Co.	D16-500
NaHCO3	Fisher Scientific Co.	S233-500
Saccharose	Fisher Scientific Co.	S5-500
Kalium-D-gluconat	Sigma-Aldrich	G4500
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Adenosin 5′-triphosphat dikaliumsalz	Dihydrat Sigma-Aldrich	A8937
Guanosin 5′-triphosphat tris salz	Sigma-Aldrich	G9002
Agarose (ultrarein)	Leben Technologien	15510-027	Gel in steriler Petrischale poriert 6 mm dicke Schicht
KOH	Sigma-Aldrich	P-6310
NaOH	Sigma-Aldrich	S-5881
Bis-fura-2, hexakaliumsalz	Invitrogen	B6810	Zellundurchlässig
Name des Gerätes	Firma	Katalognummer	Bemerkungen
Mikrotom	Leica	VT1000S	Tissue Slicing
Cyanoacryl Kleber (Roti-Coll1)	Carl Roth GmbH+Co	Art-Nr. 0258.1
Mikroelektrodenabzieher	Narshige International USA	PP-83
Mikroelektrode Kapillarrohre	World Precision Instruments	1B150F-4
Microfil 34 g	World Precision Instruments	MF34G-5
Spritzenvorsatzfilter	Corning	#431212
Mikroskop	Leica	DM LFS	Mit 4X, 40X UV und 63X UV-Objektiven und Epifluoreszenz
CCD Kamera	Hamamatsu	ORCA ER	12 Bit CCD
Fura-2 Filter Cube	Chroma	71500A	Set mit UG11 Filter
Polychrome	IV Till Photonics GmBH		Monochronometer
Ultraviolett blockierende Schutzbrille	Ultraviolett Produkte
EPC-9 Verstärker	HEKA Eletronik
Metafluor	Molekulare Bauelemente		Imaging Software
Patchmaster	HEKA Eletronik		Datenerfassungssoftware
Igor Version 6	Wavemetrics		Elektrophysiologie & Ca2+ Datenanalyse
VAPRO 5520	Westcor		Dampfdruckosmometer