Methodenartikel

Aus Abwasser gewonnene elektroaktive mikrobielle Biofilme: Wachstum, Erhaltung und grundlegende Charakterisierung

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DOI:

10.3791/50800

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29. Dezember 2013

 , 
1Department of Environmental Microbiology, UFZ - Helmholtz-Centre for Environmental Research

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das chronoamperometrische Wachstum von anodischen elektroaktiven mikrobiellen Biofilmen in einem Fed-Batch-Reaktor unter Verwendung eines Drei-Elektroden-Aufbaus, gesteuert durch einen Potentiostaten, wird demonstriert. Der extrazelluläre Elektronentransfer wird mittels zyklischer Voltammetrie in Gegenwart des Elektronendonors und in Abwesenheit des Elektronendonors charakterisiert. Die fundamentale Datenanalyse wird demonstriert.

Zusammenfassung

Das Wachstum von anodischen elektroaktiven mikrobiellen Biofilmen aus Abwasserinokula in einem Fed-Batch-Reaktor wird mit einem Drei-Elektroden-Aufbau demonstriert, der von einem Potentiostaten gesteuert wird. Dabei ermöglicht der Einsatz von Potentiostaten eine exakte Einstellung des Elektrodenpotentials und sorgt für reproduzierbare mikrobielle Kultivierungsbedingungen. Während des Wachstums wird die aktuelle Produktion mit Hilfe der Chronoamperometrie (CA) überwacht. Basierend auf diesen Daten werden die maximale Stromdichte (jmax) und der coulombische Wirkungsgrad (CE) als Maße zur Charakterisierung der bioelektrokatalytischen Leistung diskutiert. Zyklische Voltammetrie (CV), eine zerstörungsfreie, d.h. Die nicht-invasive Methode wird verwendet, um den extrazellulären Elektronentransfer (EET) von elektroaktiven Bakterien zu untersuchen. CV-Messungen werden an anodischen Biofilmelektroden in Gegenwart des mikrobiellen Substrats durchgeführt, d.h. und in Abwesenheit des Substrats, d. h. bei Nicht-Umsatzbedingungen, mit unterschiedlichen Abtastraten. Anschließend wird die Datenanalyse veranschaulicht und grundlegende thermodynamische Parameter des mikrobiellen EET abgeleitet und erläutert: Peakpotential (Ep), Peakstromdichte (jp), formales Potential (Ef) und Peakabstand (ΔEp). Zusätzlich werden die Grenzen der Methode und der Stand der Datenanalyse thematisiert. Dabei soll dieser Video-Artikel eine Anleitung für die grundlegenden experimentellen Schritte und die grundlegende Datenanalyse geben.

Einleitung

Die Aufklärung der Grundlagen des mikrobiellen extrazellulären Elektronentransfers (EET) und seine Nutzung in technischen Systemen ist ein wichtiges und schnell wachsendes Forschungs- und Entwicklungsgebiet1-3. Die Untersuchung dieser elektroaktiven (oder bioelektrokatalytisch oder elektrochemisch aktiven) Mikroorganismen, einschließlich reiner Stämme sowie definierter Co-Kulturen und komplexer Konsortien, erfordert ein komplexes Arsenal an Techniken, Methoden und Protokollen4. Diese Methoden stammen aus verschiedenen wissenschaftlichen Disziplinen, z.B. Elektrochemie, Materialwissenschaften, Mikrobiologie, und liefern Erkenntnisse auf verschiedenen Hierarchieebenen, z.B. vom gesamten mikrobiellen Biofilm bis hin zu einzelnen Molekülen. Dabei stellen die Elektrochemie und elektrochemische Methoden die Grundlage aller Aktivitäten dar.

Traditionell wurden Brennstoffzellen-Setups oft für das Wachstum und die Pflege von elektroaktiven mikrobiellen Kulturen im Archetyp dieser technischen Systeme verwendet: mikrobielle Brennstoffzellen (MFCs)5. Leider erlaubten diese Arten von MFCs oft keine Überwachung oder gar Steuerung des Potentials einer einzelnen Elektrode und somit waren nur begrenzte Einblicke in die Elektrodenprozesse möglich - es wurde nur die Zellspannung angegeben. Mittlerweile wird mehr und mehr anerkannt, dass die individuelle Überwachung und Steuerung der Potentiale einzelner Elektroden in MFCs nicht nur für die Grundlagenforschung, sondern auch für das Engineering einen klaren Vorteil darstellt. Darüber hinaus ist mit der Diversifizierung der Anwendungen mikrobieller elektrochemischer Technologien, die heute z. B. die Sanierung, Entsalzung, Synthese und sogar das Biocomputing in sogenannten mikrobiellen bioelektrochemischen Systemen (BES)2,6,7 umfassen, eine externe Kontrolle der einzelnen Elektrodenpotentiale oft erheblich. Diese Steuerung wird in der Regel durch den Einsatz von externen Stromquellen oder Potentiostaten erreicht. Dabei ermöglicht der Einsatz von Potentiostaten - im Gegensatz zu anderen Aufbauten - eine exakte Einstellung des individuellen Elektrodenpotentials. Dies ist von großer Bedeutung, da die Elektrode den terminalen mikrobiellen Elektronenakzeptor (für Anoden) oder Elektronendonor (für Kathoden) des extrazellulären Elektronentransfers darstellt. Abbildung 1 zeigt den aktuellen Kenntnisstand zur mikrobiellen EET an Anoden - siehe für Details z.B. 2,4,6,8,9 Die EET an der Kathode ist noch weitgehend unerschlossen10.

Die Kontrolle des Elektrodenpotentials ermöglicht somit nicht nur die Verwendung reproduzierbarer mikrobieller Kultivierungsbedingungen, sondern auch deren Anpassung an die EET-Thermodynamik11. In diesem Artikel wird gezeigt, wie die charakteristischen Parameter elektroaktiver mikrobieller Biofilme aus Fed-Batch-Reaktorexperimenten mittels Chronoamperometrie (CA) und zyklischer Voltammetrie (CV) extrahiert werden können. Dazu gehören die Leistungsparameter maximale Stromdichte (jmax) und Coulomb-Wirkungsgrad (CE) sowie EET-Kennlinien. Hier wird die Identifizierung der formalen Potentiale (Ef) von möglichen und tatsächlichen Elektronentransferstellen im Vordergrund stehen. Die Extraktion dieser Parameter wird am Beispiel von aus Abwässern gewonnenen Mischkultur-Biofilmen gezeigt, die von Geobacter spec dominiert werden. 12 Diese aus dem Abwasser gewonnenen Biofilme werden durch ein einfaches elektrochemisches Auswahlverfahren gewonnen, wie zahlreiche Forschungsgruppen auf der ganzen Welt gezeigthaben 13-16.

Dynamische elektrochemische Techniken zur Untersuchung des mikrobiellen extrazellulären Elektronentransfers

Für eine thermodynamische Charakterisierung der EET von elektroaktiven mikrobiellen Kulturen werden dynamische elektrochemische Techniken benötigt. Im Allgemeinen umfassen diese Techniken potentialgesteuerte, d.h. voltammetrische, und stromgesteuerte, d.h. Galvanodynamik, Techniken17. Dabei sind die potentialgesteuerten Techniken weiter verbreitet und umfassen beispielsweise die Rechteck-Voltammetrie und die lineare Sweep-Voltammetrie18. Am beliebtesten ist jedoch die zyklische Voltammetrie (CV)19,20. CV ist in verschiedenen Bereichen der Elektrochemie bekannt und weit verbreitet, die von der Batterieforschung über die Materialwissenschaften bis hin zur Enzymbioelektrochemiereichen 21. Seine Anwendung auf lebende mikrobielle Zellen kann nur auf mehr als ein Jahrzehnt zurückdatiert werden22 und hat in den letzten Jahren deutlich zugenommen23,24. Insbesondere die Kombination von CV- und spektroskopischen Methoden hat beispiellose Einblicke in die EET-Mechanismen und ihre molekulare Natur ermöglicht, z.B.25,26 Parallel dazu wurde der theoretische Rahmen für die Extraktion thermodynamischer und theoretischer Eigenschaften der mikrobiellen EET erweitert und vertieft27-30. Im Gegensatz dazu behindern experimentelle Fehlhandhabungen oder unzureichende Datenanalysen häufig die adäquate Anwendung der CV im Bereich der mikrobiellen Bioelektrochemie. Daher soll dieser Video-Artikel neben Workshops (z.B. auf der EU-ISMET 2012) und Tutorials19 eine grundlegende Anleitung für die Durchführung von zyklischen voltammetrischen Experimenten an elektroaktiven Bakterien bieten. Dabei konzentriert es sich auf die grundlegenden experimentellen Schritte und die grundlegende Datenanalyse und ist nicht dazu gedacht, die neuesten Protokolle der kinetischen Analyse bereitzustellen. Die wichtigsten Termini für die folgende Diskussion sind in Kasten 1 zusammengefasst (adaptiert von Harnisch und Freguia19 und modifiziert).

Protokoll

Da das Auswahlverfahren im bioelektrochemischen Fed-Batch-Reaktor aufgrund der Wahl des Substrats und der anoxischen Bedingungen sehr spezifisch ist, ist das Arbeiten unter sterilen Bedingungen für das demonstrierte Beispiel nicht erforderlich.

1. Vorbereitung des Wachstumsmediums

  1. Bereiten Sie eine geeignete Menge des Wachstumsmediums vor, indem Sie einen Phosphatpuffer nach Kim et al. verwenden.13 (siehe Tabelle 1). Hierbei dient Natriumacetat (10 mM) als Substrat. Das in diesem Artikel verwendete Wachstumsmedium ist nur ein Beispiel und kann je nach experimentellem Zweck in seinen Komponenten variieren.
  2. 1 ml Primärabwasser pro 20 ml Nährmedium als Inokulum zugeben. Die Abwasserprobe wird nach der mechanischen Filtration aus einer kommunalen Kläranlage entnommen (siehe z.B. Abbildung 2) und kann bis zur Verwendung in einem geschlossenen Behälter bei 4 °C gelagert werden.
    (Hinweis: Je nach Zielsetzung des Experiments kann die genaue anfängliche Zellzahl wichtig sein und sollte dann bestimmt werden. Im gezeigten Beispiel ist die anfängliche Zellzahl nicht wichtig, da der Biofilm Steady-State-Bedingungen erreicht.)
  3. Spülen Sie das Medium einschließlich des Inokulums mindestens 30 Minuten lang mit Stickstoff, um es zu entlüften, indem Sie eine Nadel in das Medium einführen und den Stickstoffstrom einschalten. Der Strahl sollte stark genug sein, dass Sie eine vollständige Durchmischung des Mediums beobachten können.
    (Hinweis: Je nach Volumen des Mediums sollte sogar eine Verlängerung der Entgasungszeit in Betracht gezogen werden. Während der Entgasungseinrichtung wird der Fed-Batch-Reaktor (Schritte 2.1-2.2))

2. Aufbau des Fed-Batch-Reaktors

  1. Man nehme ein geeignetes Reaktorgefäß – hier kommt ein modifizierter 4-Hals-Rundkolben mit 250 ml zum Einsatz.
    (Hinweis: Im Allgemeinen sollte das Schiff mindestens vier Buchten haben. Diese sind für die drei Elektroden und für die Probenahme/den Medienaustausch notwendig. Produzierte Gasmengen können vernachlässigt werden, wenn der Reaktor aufgrund von Probenahmen oder Medienwechsel regelmäßig geöffnet wird, alternativ sollte ein Blasenzähler installiert werden. Um unerwünschtes phototropes Wachstum zu vermeiden, sollten die Reaktoren vor direkter Lichteinwirkung geschützt werden.)
  2. Für den Drei-Elektroden-Aufbau (siehe Abbildung 3 und Abschnitt 3 für Details) die Referenzelektrode (RE) (hier Ag/AgCl, sat. KCl, 0,197 V vs. SHE), die Arbeitselektrode (WE) und die Gegenelektrode (CE) durch einzelne Einlässe über Silikonstopfen in den Kolben legen – luftdicht verschließen.
    (Hinweis: Da WE und CE Graphitstäbe verwendet werden. Der Draht der Elektroden wird durch den Silikonstecker gezogen und von außen fixiert. Die Referenzelektrode wird über eine Bohrung durch den Silikonstecker geführt. Um Kurzschlüsse zu vermeiden, ist darauf zu achten, dass auch beim Rühren oder bei der Umwälzung des Mediums kein physischer Kontakt der Elektroden besteht. Platzieren Sie die Elektroden so, dass sie vollständig mit mittlerer Lösung bedeckt sind. Zum Abdichten den Silikonstopfen jedes Einlasses mit Parafilm umwickeln.)
  3. Gießen Sie das Wachstumsmedium einschließlich des Inokulums (hier 250 ml) durch die Probenahmeöffnung in den Reaktor und spülen Sie es mit Stickstoff.
  4. Verschließen Sie den letzten Einlass mit einem Silikonstopfen und verschließen Sie ihn luftdicht. Hinweis: Spuren von Sauerstoff können den Biofilmen der gemischten Spezies nichts anhaben. Sie sind in der Lage, einem geringen Sauerstoffgehalt standzuhalten und ihn sogar zu verbrauchen, was wiederum den CE-Wert senken kann.

3. Wachstum des chronoamperometrischen Biofilms

  1. Verbinden Sie die Elektroden mit den entsprechenden Kabeln des Potentiostaten. Stellen Sie das Gefäß in eine temperierte Kammer, hier wird 35 °C31 verwendet, um konstante Umgebungsbedingungen zu gewährleisten.
  2. Öffnen Sie die Software zur Steuerung des Potentiostaten und wählen Sie die Technik: Chronoamperometrie. Stellen Sie die Parameter z.B. wie folgt ein: Ein konstantes Potential EWE von 0,2 V (vs. Ag/AgCl) für eine Dauer von t von 500 h (≈ 20 Tage). Der Strom wird minütlich in Zeitschritten dti aufgezeichnet.
    Hinweis: Die Wahl des angewandten Potentials ist abhängig vom untersuchten System/Mikroorganismus. Im Allgemeinen werden Anodenprozesse bei positivem Potential und Kathodenprozesse bei negativen Potentialen untersucht. Man kann auch aus den Standardpotentialen des Elektronendonors/-akzeptors und dem formalen Potential der zu erwartenden mikrobiellen Elektronentransferstelle ein geeignetes Potential ableiten, hier als Ausgangspunkt verweisen wir auf die aktuelle Literatur.
  3. Starten Sie die Chronoamperometrie. Ein Diagramm des gemessenen Stroms über die Zeit wird von der Software grafisch dargestellt, der beobachtete maximale Strom (imax) ist ein wichtiger Online-Parameter, wie in den Abschnitten 4 und 5 beschrieben.

4. Pflege von Biofilmen

  1. Abhängig von den Umgebungsbedingungen, z.B. der Temperatur, beginnt ein oxidativer Strom zu fließen und erreicht ein Plateau (siehe Abbildung 4). Wenn Sie wieder Nullstrom erreicht haben, unterbrechen Sie die chronoamperometrische Messung und füllen Sie die mittlere Lösung auf. Für ein schnelleres Biofilmwachstum ersetzen Sie das Medium direkt nach Erreichen des Plateaus des maximalen Stroms. Öffnen Sie die Probenahmeöffnung und entladen Sie das Medium vorsichtig, ohne den dünnen Biofilm zu zerstören. Beim Nachfüllen des Mediums wieder mit Stickstoff spülen. Probenahmeöffnung verschließen und luftdicht verschließen.
  2. Das Verfahren in Schritt 4.1 wird wiederholt, bis der maximale oxidative Strom einen stationären Zustand erreicht (siehe Abbildung 4).
    (Hinweis: Es wird angenommen, dass eine Konstante imax auf eine stabile Steady-State-Biofilmbildung hinweist.)
  3. Entnehmen Sie 1 ml Proben der frischen und der ausgetauschten Mediumlösungen für die Substratanalyse, z.B. mittels HPLC. Die anfängliche Substratkonzentration (c0) sowie die Konzentration der restlichen Substratlösung (c1) werden anschließend für die Effizienzberechnung benötigt (siehe Abschnitt Datenanalyse).
    Hinweis: Um unverfälschte Ergebnisse zu erzielen, z.B. durch weiteren Substratverbrauch, analysieren Sie die Substratproben sofort. Wenn dies nicht möglich ist, lagern Sie die Proben nicht länger als einen Monat in einem Gefrierschrank bei mindestens -18 °C.)

5. Anwendung der zyklischen Voltammetrie zur Untersuchung der EET

  1. Führen Sie eine zyklische Voltammetrie bei den Maxima und Minima des Stromflusses durch, wie angegeben (Abbildung 4). Abhängig von der Fragestellung, die von Interesse ist, wird der CV in der Regel durchgeführt, wenn das System den stationären Zustand erreicht hat, um vergleichbare Ergebnisse zu erhalten. (Anmerkung: Die Stromerzeugung wird als Umsatzbedingungen bezeichnet und bezieht sich auf die mikrobielle Oxidation des Substrats und den anschließenden Elektronentransfer: mikrobielle Bioelektrokatalyse; während die CVs ohne Umsatz bei (nahezu) null Stromfluss in der CA durchgeführt werden.)
  2. Wählen Sie in der Potentiostatensteuerungssoftware die Technik: Zyklische Voltammetrie und stellen Sie die entsprechenden Parameter ein, hier zum Beispiel: Ein Anfangspotential des EWE bis Ei von -0,5 V vs. RE mit einer Abtastrate v=dE/dt von 1 mV/sec auf ein Vertexpotential E1 von 0,3 V vs. RE und zurück auf das Startpotential E2 = Ei von -0,5 V.
    Anmerkung: Bei Verwendung der zyklischen Voltammetrie wird die angelegte Spannung am WE durch den Potentiostaten linear mit der Zeit geändert (siehe Abbildung 5) - Kasten 2 enthält die wichtigsten Regeln für die Auswahl der Versuchsparameter und die Fehlersuche).
  3. Starten Sie die zyklische Voltammetrie und zeichnen Sie so viele Zyklen auf, wie für eine reproduzierbare CV erforderlich sind. In der Regel werden mindestens 3 Zyklen benötigt. Das resultierende Diagramm wird als zyklisches Voltammogramm bezeichnet (siehe auch Abbildung 7). Hinweis: Abhängig von den Messbedingungen können unterschiedliche Informationen gewonnen werden, wie im nächsten Abschnitt gezeigt.

6. Darstellen von Daten

Hier wird nur das Plotten der Daten besprochen. Eine ausführlichere Abhandlung folgt im nächsten Abschnitt.

  1. Verwenden Sie eine entsprechende Datenanalysesoftware, hier werden alle Daten als Text exportiert und als ASCII-Datei importiert.
  2. Berechnen und verwenden Sie bevorzugt die Stromdichten (j) und nicht die absoluten Ströme (i).
    (Hinweis: Da es jedoch verschiedene Protokolle zur Berechnung von j gibt, machen Sie deutlich, welches verwendet wurde. Hier wird die Stromdichte pro geometrischer, d.h. projiziert, wird die Oberfläche der Elektrode verwendet.)
  3. Chronoamperometrie: Plotten Sie die gemessene Stromdichte als Funktion der Zeit.
  4. Zyklische Voltammetrie: Plotten Sie die gemessene Stromdichte als Funktion des Potentials des WE E we.

Ergebnisse

1. Chronoamperometrie

Aus chronopotentiometrischen Messungen können zwei betriebliche Kenngrößen berechnet werden: die maximale Stromdichte (jmax), d. h. der maximale Elektronenfluss pro Sekunde, und die coulombsche Effizienz (CE), d. h. der gesamte Stromfluss im Verhältnis zum verbrauchten Substrat. Abbildung 4 zeigt eine typische chronopotentiometrische Biofilmbildungskurve über mehrere Wachstumszyklen hinweg unter Verwendung eines Batch-Reaktors mit Substratnachspeisung. Nach der anfänglichen Lag-Phase setzt ein erstes Maximum der Stromdichte ein. Anschließend sinkt der Strom aufgrund der Substratausschöpfung wieder ab. Bei (nahezu) null Stromfluss erfolgt, wie angegeben, ein Mediumwechsel. Nach dieser Substratnachfüllung steigt die Stromdichte erneut an, und das folgende maximale Stromdichtemaximum ist höher als das erste. Nach mehreren Wachstumszyklen bleibt jmax konstant – was auf die Bildung eines stationären Biofilms hindeutet14. Da der stationäre jmax-Wert von mehreren Parametern abhängt, z. B. Elektrodenmaterial, Reaktortemperatur und Biofilmbestandteilen, wird er oft als charakteristische Größe eines bestimmten elektroaktiven mikrobiellen Biofilm-Elektroden-Systems betrachtet. (Im Fall von Durchflussreaktoren wird nicht jmax, sondern die konstante stationäre Stromdichte verwendet.) Die zweite betriebliche Kenngröße ist die coulombsche Effizienz (CE) (Gleichung 1). Sie gibt die Anzahl der als elektrischer Stromfluss gemessenen Elektronen, Qp, pro Batch-Zyklus mit Substratnachspeisung im Verhältnis zur theoretisch maximalen Anzahl an Elektronen Qth an, die aus dem Substratverbrauch innerhalb dieses Zyklus berechnet wird.

Formel für das statische Gleichgewicht CE=QP/Qth×100; Effizienzberechnung im Prozessdiagramm.

(Gleichung 1)

Die insgesamt übertragene Ladung kann durch Integration der CA-Kurve ermittelt werden (siehe auch Abbildung 6):

Berechnung der elektrischen Ladung, Gleichung, \( Q_P = \int_0^t i \, dt \), Integrationsmethode.

(Gleichung 2)

Die theoretisch mögliche elektrische Ladung wird nach dem Faradayschen Gesetz berechnet:

Thermodynamische Gleichung Qth=ΔcVzF, Analyse des chemischen Potentials, für den Bildungseinsatz.

(Gleichung 3)

Dabei ist V das Volumen des Wachstumsmediums, F die Faraday-Konstante (F = 96.485,34 C/mol), z die Anzahl der freigesetzten Elektronen des oxidierten Substrats (im Fall von Acetat werden bei der Oxidation zu CO2 8 Elektronen freigesetzt) und Δc = c0-c1, was dem Substratverbrauch entspricht (wird durch chemische Analysemethoden bestimmt, z. B. mittels HPLC).

2. Zyklische Voltammetrie:

Zyklische Voltammogramme werden für Nicht-Umsatzbedingungen und für Umsatzbedingungen aufgezeichnet (wie in Abbildung 4 angegeben). In beiden Fällen können unterschiedliche Arten von Informationen gewonnen werden. Im Folgenden wird erörtert, wie mögliche und tatsächliche EET-Stellen identifiziert werden können.

2.1 Nicht-Umsatzbedingungen – Identifizierung möglicher EET-Stellen:

Abbildung 7 zeigt typische CVs unter Nicht-Umschaltbedingungen, d. h. in Abwesenheit von Substrat. Abbildung 7A zeigt die CV eines Biofilms bei hohen Scanraten (hier 50 mV/s), wobei nur ein Peak-Paar und somit ein formales Potential Ef identifiziert werden kann. Im Allgemeinen lässt sich das formale Potential eines Redoxpaares aus dem Peakpotential der Oxidationspeak EpA und dem Reduktionspeak der jeweiligen Spezies EpC durch Bildung des arithmetischen Mittels berechnen (siehe auch Abbildung 7C):

Elektrochemische Gleichung: Ej = (EpA + Epc)/2, zur Analyse des Redoxpotentials in Voltammetrie-Studien.

(Gleichung 4)

Wenn eine ausreichend niedrige Scanrate auf den identischen Biofilm angewendet wird (hier 1 mV/s), können bis zu vier Redoxpaare identifiziert werden (die jeweiligen formalen Potentiale sind in Abbildung 7B angegeben). Der Grund liegt darin, dass der kapazitive Untergrundstrom bei niedrigeren Scanraten abnimmt, siehe auch Kasten 1 und z. B.17,21 für weitere Einzelheiten. Die Nicht-Umsatz-CV zeigt jedoch lediglich alle redoxaktiven Verbindungen an der Elektrode und damit das Ef der möglichen EET-Standorte. Erst die Analyse der Umsatz-CV liefert das Ef der tatsächlichen EET-Übertragungsstellen (siehe Schritt 2.2).

Bei der weiteren Analyse der Nicht-Umsatz-CVs können verschiedene andere charakteristische Parameter wie die Peak-Trennung ΔEp (Gleichung 5) oder der maximale Peakstrom ipA und der minimale Peakstrom ipC analysiert werden (siehe Abbildung 7C).

Gleichgewichtsgleichung ΔEP=EpA-EpC; Formeldiagramm zu Lehrzwecken.

(Gleichung 5)

Diese Parameter, insbesondere wenn sie für verschiedene Scanraten aufgezeichnet werden, können zur mechanistischen und kinetischen Analyse von Elektronentransferprozessen an Elektroden verwendet werden. Eine solche kinetische Analyse, die für chemische Systeme gut etabliert ist, ist jedoch für elektroaktive mikrobielle Biofilme nicht einfach, siehe z. B.19,30

  1. Umsatzbedingungen – Identifizierung tatsächlicher EET-Standorte:

Bei der Durchführung der CV-Messung in Gegenwart eines Substrats erhält man eine Turnover-CV (siehe Abbildung 8A). Nach dem Auftragen der Daten ist die typische s-förmige, sogenannte bioelektrokatalytische Kurve erkennbar17–19. Bei weiterer Analyse der Daten liefert das Maximum der ersten Ableitung, d. h. der Wendepunkt der CV-Kurve, das formale Potential Ef der tatsächlichen EET-Stelle(n) (siehe Abbildung 8B). Bei einem jungen, d. h. dünnen, von Geobacteraceae dominierten Biofilm, hier 168 h nach Beginn der CA, können zwei Wendepunkte beobachtet werden. Entsprechend zeigt die Ableitung zwei Maxima, die den formalen Potentialen der bioelektrokatalytisch aktiven EET-Stellen entsprechen: −0,376 V und −0,295 V gegen Ag/AgCl (ges. KCl, 0,197 V gegen SHE). In Abbildung 7B werden diese Stellen als Ef,2 bzw. Ef,3 bezeichnet. Dies zeigt ebenfalls, dass die mit den formalen Potentialen Ef,1 und Ef,4 (in der Nonturnover-CV) assoziierten Redoxprozesse nicht mit der Bioelektrokatalyse verknüpft sind. Mit zunehmendem Wachstum und Dicke des Biofilms zeigt die CV nur noch einen Wendepunkt, d. h. ein einziges Maximum in der Ableitungskurve. Dieses formale Potential Ef, hier −0,32 V gegen Ag/AgCl (ges. KCl), entspricht (annähernd) dem arithmetischen Mittel der beiden formalen Potentiale, die der EET des dünnen Biofilms zugeordnet sind (z. B. hier Ef,2 und Ef,3) – siehe Abbildung 9. Dies verdeutlicht, dass diese grundlegende CV-Analyse schnelle und nichtinvasive Einblicke in die Thermodynamik des EET ermöglicht, jedoch keine weiteren mechanistischen oder kinetischen Schlussfolgerungen zulässt.

Bemerkenswerterweise werden durch die spezifischen Bedingungen in diesem Protokoll Biofilme erzeugt, die stark von Geobacter-Arten dominiert sind (hier nicht gezeigt)12,15. Die Änderung ausgewählter Parameter, z. B. Substrat, Temperatur, usw., beeinflusst ebenfalls die mikrobielle Zusammensetzung und damit die elektrochemischen Eigenschaften.

Tabelle 1. Wachstumsmedium gemäß Kim et al.32

Komponente(mg/L) / (ml/L)   
NaH2PO4•H2O2,690.00
Na2HPO44,330.00
NH4Cl310.00
KCl130.00
Natriumacetat820.00
Metalllösung12.50
Vitaminlösung12.50
Tabelle 2. Bestandteile der Metall- und Vitamintlösung33.
Spurenelementlösung:Vitamintlösung:
Bestandteilmg/L   Bestandteilmg/L   
Nitriloessigsäure1,500.0Biotin2.0
MgSO4•7H2O         3,000.0Folsäure2.0
MnSO4•2H2O         500.0Pyridoxinhydrochlorid10.0
NaCl  1,000.0Thiaminhydrochlorid5.0
FeSO4•7H2O          100.0Riboflavin5.0
CoSO4 oder CoCl2     100.0Nicotinsäure5.0
CaCl2•2H2O            100.0DL-Calciumpantothenat5.0
ZnSO4   130.0Vitamin B120.1
CuSO4•H2O10.0p-Aminobenzoesäure5.0
AlK(SO4)2               10.0Liponsäure5.0
H3BO3 10.0
Na2MoO4•2H2O     10.0
Hinweis: Nitriloessigsäure mit KOH auf pH 6,5 auflösen und anschließend Mineralstoffe hinzufügen.


Diagramm bioelektrochemischer Fachbegriffe; enthält Gleichungen und Formeln der Elektrochemie.
Einstellungen der zyklischen Voltammetrie und Fehlerbehebungsanleitung, mit Fokus auf die Anpassung des Potentialbereichs und der Scan-Geschwindigkeit für optimale CV-Experimente.

Schema mikrobieller extrazellulärer Elektronentransfermechanismen; MET-, DET-, MIET-, DIET-Wege; Analyse des Elektronentransports.
Abbildung 1. Schema möglicher mikrobieller extrazellulärer Elektronentransfermechanismen. Klicken Sie hier, um die Abbildung in größerer Auflösung anzusehen.

Wasserprobenahme; Eimerprobenahmegerät entnimmt Proben aus dem Abwasserbehandlungsstrom.
Abbildung 2. Probenahme im Abwasserbehandlungsanlage nach dem Rechenabscheider (Abwasserbehandlungsanlage Deutschland). Klicken Sie hier, um die Abbildung in größerer Auflösung anzusehen.

Schema und Foto der elektrochemischen Zelle mit Potentiostat und Elektrodenanordnung; CE, RE, WE beschriftet.
Abbildung 3. Drei-Elektroden-Anordnung. (A) Schema, (B) realer Reaktor; CE = Gegenelektrode, RE = Referenzelektrode, WE = Arbeitselektrode mit elektroaktiver mikrobieller Biofilm, SP = Probenahmestelle. Hier klicken, um die Abbildung in größerer Auflösung anzuzeigen.

Elektrochemisches Diagramm; CV-Analyse; Strom über Zeit; stationärer Zustand; Daten in Mikroampere und Stunden.
Abbildung 4. Chronoamperometrische Auftragung des biofilmbasierten Wachstums eines Abwasserinokulums im Beschickungsbetrieb. Der oxidativen Strom erreicht nach drei Medienwechseln einen stationären Zustand. Markiert sind die Lag-Phase sowie die Zeitpunkte der Mediumserneuerung und Durchführung der Turnover-Cyclic-Voltammetrie (CV) und der Non-Turnover-CV unter stationären Biofilmbedingungen (Rohdaten aus Liu14). Hier klicken, um die Abbildung in größerer Auflösung anzuzeigen.

Elektrochemische Analyse, E-t-Diagramm, zyklische Voltammetrie, Potential über der Zeit, analytische Chemie
Abbildung 5. Prinzipieller Potential-Zeit-Verlauf während eines Zyklus der zyklischen Voltammetrie. Die CV beginnt beim Anfangspotential Ei. Die angelegte Spannung wird dann linear mit der Zeit mit einer Scanrate von v verändert. Bei einem gewählten Scheitelpotential E1 kehrt die Spannung zu einem Endpotential E2 zurück, hier ist E2 = Ei. Klicken Sie hier, um die Abbildung vergrößert anzuzeigen.

Elektrochemische Analysegrafik mit Stromdichte j über der Zeit t, die das maximale jmax veranschaulicht.
Abbildung 6. Typisches Chronoamperogramm eines aus Abwasser stammenden Biofilms über einen Wachstumszyklus; hier sind die maximale Stromdichte jmax, die geflossene (praktische) elektrische Ladung Qp, die Probennahme der anfänglichen Substratkonzentration c0 und der Substratkonzentration nach einem Wachstumszyklus c1 markiert. Klicken Sie hier, um die Abbildung in größerer Auflösung anzusehen.

Elektrochemische Analysegraphik; Diagramme der zyklischen Voltammetrie mit Darstellung der Strom-Spannungs-Ergebnisse.
Abbildung 7. Nichtumsetzende zyklische Voltammogramme eines G. sulfurreducens-Biofilms. Scanrate: (A) 50 mV/s, (B) 1 mV/s 23; (C) Ausschnitt aus B, der die Spitzenstromdichte (jpA) und das entsprechende Spitzenpotential (EpA) der Anode an den Maxima veranschaulicht. Entsprechend werden an den Minima die Spitzenstromdichte (jpC) und das entsprechende Spitzenpotential (EpC) der Kathode gezeigt. Das formale Potential Ef und die Peakseparation ΔEp ergeben sich aus Gleichung 4 bzw. Gleichung 5 (für Einzelheiten siehe Text unten). Hier klicken, um die Abbildung in größerer Auflösung anzusehen.

Elektrochemische Analyse; Voltammetrie-Diagramm; Strom gegen Potential; Peak-Erkennung; Datenanalyse
Abbildung 8. (A) Umsatz-Cyclic-Voltammogramm eines metabolisierenden G. sulfurreducens-Biofilms. Die Scanrate betrug 5 mV/s. (B) Erste Ableitungen der voltammetrischen Kurve23. Angegeben sind die formalen Potentiale der eigentlichen EET-Stellen: Ef,2 und Ef,3. Hier klicken, um die Abbildung vergrößert anzuzeigen.

Cyclic voltammetry graph; current vs. potential; electrochemical analysis; data results.
Abbildung 9. (A) Umsatz-Cyclic Voltammogramm und (B) erste Ableitungen eines dickeren, metabolisierenden G. sulfurreducens Biofilm. Die Scan-Geschwindigkeit betrug 5 mV/s (vergleiche Abbildung 8). Klicken Sie hier, um die Abbildung in voller Größe anzuzeigen.

Diskussion

Das vorgestellte Protokoll zeigt einen einfachen und unkomplizierten Weg zur Züchtung elektroaktiver mikrobieller Biofilme aus Abwasser, die mit Hilfe eines Drei-Elektroden-Aufbaus in einem Fed-Batch-Reaktor geimpft werden. Die Chronoamperometrie ermöglicht das Wachstum und die Selektion von elektroaktiven mikrobiellen Biofilmen aus verschiedenen Inokula sowie die grundlegende Charakterisierung der Biofilme in Bezug auf maximale Stromdichte und coulombische Effizienz. Die zyklische Voltammetrie ist eine nicht-invasive Technik, die es ermöglicht, grundlegende Studien zur EET-Thermodynamik des mikrobiellen Biofilms durchzuführen und somit mögliche und tatsächliche EET-Transferstellen zu identifizieren. Zusammen ermöglichen diese Parameter i) die Charakterisierung und den Vergleich verschiedener mikrobieller Biofilme unter identischen Bedingungen sowie ii) die Untersuchung des Einflusses verschiedener Betriebsbedingungen auf identische elektroaktive mikrobielle Biofilme. Diese Experimente können jedoch nur ein Ausgangspunkt sein. Einerseits erfordert das facettenreiche Feld der mikrobiellen Bioelektrochemie eine weitere und tiefgreifende Nutzung elektrochemischer Methoden und Protokolle. Dazu gehören beispielsweise Modelle zur Extraktion kinetischer und mechanistischer Daten sowie weitere Methoden wie die elektrochemische Impedanzspektroskopie34,35. Auf der anderen Seite können elektrochemische Methoden keine Informationen über die molekulare Beschaffenheit, die mikrobielle Zusammensetzung, die räumliche mikrobielle Organisation usw. liefern. Hier sind weitere Techniken erforderlich, die entweder nicht-invasiv und an die Elektrochemie gekoppelt oder invasiv sind4. Kasten 2 enthält eine kurze Diskussion über die kritischen Schritte bei der Durchführung der Experimente sowie über die erste Fehlerbehebung.

Aus ingenieurtechnischer Sicht ist zu berücksichtigen, dass die elektroaktive Biofilmanode nur eine Komponente der aktuellen mikrobiellen bioelektrochemischen Systeme ist und eine Vielzahl anderer Faktoren für vollständige Systeme analysiert werden muss36. Wir hoffen jedoch, dass dieser Video-Artikel dazu beitragen wird, die Kernelemente von BES, d.h. die mikrobiellen Elektroden, in Zukunft zu verstehen und anzupassen.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

F.H. bedankt sich für die Unterstützung durch das BMBF (Forschungspreis "Next generation biotechnological processes - Biotechnology 2020+") und die Helmholtz-Gemeinschaft (Nachwuchsgruppe).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Primäres AbwasserKläranlagemechanischer Filtration
entnommen 250 ml Rundkolben mit drei zusätzlichen EinläufenTh.Geyer Berlin GmbH, Deutschland9.011 845Zusätzliche Einlässe wurden durch unseren hauseigenen Glasbläser angebracht
Ag/AgCl Referenzelektrode (sat. KCl, 0,195 V vs. SHE) mit KeramikmembranSensortechnik Meinsberg, DeutschlandSE 11
Graphitstäbe (Ø=1 cm, l=3 und 5 cm)CP-Handels-GmbH, Wachtberg, DeutschlandAls Elektrodenmaterial verwendet
Edelstahl, Nr. 1.4301, Draht Fe/Cr18/Ni10Goodfellow GmbH, Bad Nauheim, Deutschland155-923-05
SilikonsteckerTh.Geyer Berlin GmbH, Deutschland9.230 512 und
ParafilmneoLab, Heidelberg, Deutschland3-1011Zur Abdichtung zur Aufrechterhaltung anaerober Bedingungen
Potentiostat/ Galvanostat Modell MPG2BioLogic Science Instruments, Frankreich
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Referenzen

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