Drei Assays, einschließlich des zytopathischen Effekts (CPE)-basierte Assays, Dosis-Wirkungs-Assay und Time-of-Addition (TOA)-Assay entwickelt, optimiert, validiert und genutzt, um neue antivirale Mittel gegen Blauzungenvirus (BTV) zu identifizieren, sowie um den möglichen Mechanismus-of-Aktion (MoA) für neu identifizierten antiviralen Medikamenten zu bestimmen.
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Methodenartikel
Tests für die Identifizierung neuer Antivirale gegen Blauzungenvirus
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Um mögliche Virostatika gegen BTV zu identifizieren, haben wir entwickelt, optimiert und validiert drei Assays hier vorgestellt. Die CPE-basierte Test war der erste Test entwickelt, um zu beurteilen, ob eine Verbindung zeigte keine antivirale Wirksamkeit und wurden verwendet, um Bildschirm großen Substanzbibliothek. Inzwischen konnte die Zytotoxizität von Virostatika auch mit dem CPE-basierte Assays ausgewertet werden. Die Dosis-Wirkungs-Assay wurde entwickelt, um den Bereich der Wirksamkeit für die ausgewählte antivirale bestimmen, dh 50% inhibitorische Konzentration (IC 50) oder effektive Konzentration (EC 50), sowie dessen Bereich der Zytotoxizität (CC 50). Die Toa-Assay wurde für die erste Studie MoA den zugrundeliegenden Mechanismus der neuen antiviralen Medikamenten während der BTV viralen Lebenszyklus oder der möglichen Auswirkungen auf die Wirtszellmaschinerie bestimmen, beschäftigt. Diese Assays sind entscheidend für die Bewertung der antiviralen Wirksamkeit in Zellkultursystem, und sind für unsere jüngsten Forschungen führen verwendetten zur Identifizierung einer Reihe von neuen antiviralen Medikamenten gegen BTV.
Einleitung
BTV ist ein Prototyp Doppelstrang-RNA-Virus aus der Gattung Orbivirus, Familie Reoviridae. BTV ist eine der wichtigsten Krankheiten von Haustieren, darunter Schafe, Ziegen, Rinder und andere Haustiere, 3 Milliarden $ / Jahr weltweit 1,2 Verlust. Die exotische BTV-Serotyp ist ein in den aufgeführten wichtig Tierpathogen "USDA Hohe Consequence Tierkrankheitserreger." Vor kurzem hat die wieder auftauchende der BTV hat einen großen Ausbruch der Krankheit bei Rindern und Schafen in mehreren Ländern in Nordeuropa 3,4 verursacht. Als Ergebnis ihrer wirtschaftlichen Bedeutung und als Modellsystem hat BTV Gegenstand von umfangreichen Mo....
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Protokoll
1. Zellen, Virus und die antivirale Verbindungen
- Aufrechterhaltung BSR Zellen, ein Derivat von Babyhamsternieren (BHK)-Zellen 10, in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), enthaltend 5% fötales Kälberserum (FCS), 100U/ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin.
- Bei allen drei Assays Platte Zellen in DMEM mit 1% FCS, 100U/ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin, wie zuvor optimierten 5. Dieses Medium wird als Testmedium für alle drei Assays bezeichnet.
- Alle Zellen im Brutschrank inkubieren bei 37 ° C mit 5% CO &sub2; und 80-95% Luftfeuchtigkeit.
- Plaque-Reinigung und propagieren den Typ ....
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Ergebnisse
1. Antivirale Wirksamkeit von Verbindung
Die Zell-basierten CPE-Assay wurde entwickelt, optimiert und in vitro unter Verwendung des Leuchtbasis CTG Kit neuartige antivirale gegen BTV identifizieren, wie zuvor beschrieben, 2,5 validiert. Die zehn Dosis-Wirkungs-Assay wurde verwendet, um die antivirale Wirksamkeit und Zytotoxizität einer identifizierten Leitstruktur durch Messen der Anzahl von metabolisch lebensfähigen Zellen in Kultur, die auf die Quantifizierung der zellulär.......
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Diskussion
Für die erstmalige Identifizierung von antiviralen Hits, ist einer der wichtigsten Schritte für die antivirale Wirkstoffforschung und Entwicklung, um robuste Tests zu entwickeln, die die Auswahl eines quantifizierbaren Marker, die Entwicklung einer einfachen Protokoll, ausreichende Signale und weniger als 10% CV enthält. Die meisten biochemischen und zellbasierte Bildschirme sind für eine chemische Ausgangspunkt auf der Grundlage der robustesten, einfache und kostengünstige Assay aufgrund der erforderlichen Reproduzierb.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Danksagungen
Dieses Projekt wurde durch Gewährung 1R03MH08127-01 und-02 7R03MH08127 von NIH Q. Li unterstützt und von den Mitteln aus IMPACT Abteilung für Medizin an der UAB Q. Li. Unterstützung aus der Molette Fonds und der Auburn University wird geschätzt. Wir danken auch die technischen Hilfestellungen von Frau Pulin Che und Herr Volodymyr Musiienko im Laufe der Arbeit.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| DMEM-Medium | Gibco | 1134218 | Für Zellkulturen |
| FBS | Gibco | 16000044 | Für Zellkulturen |
| 0,05 % Trypsin-EDTA | Gibco | 1000185 | Für Zellkulturen |
| DPBS | Gbico | 1049769 | Für Zellkulturen |
| CellTiter-Glo (CTG) Kit | Promega | TB288 | Für die Messung der Zellviabilität |
| 70 % Ethanol | Fisher | S25309B | Verdünnt aus 95% |
| Antiviralen Huashilverbindungen | NIH MLSMR und de novo Synthese | ||
| BTV-10 | ATCC | VR-187 | |
| BSR-Zelle | Eigens | ||
| Synergy-II Multi-Mode-Mikroplatten-Reader | BioTek | Zum Lesen von Leuchtsignalen | |
| MicroFlo select Dispenser | BioTek | Hinzufügen von Zellen, Viren und Reagenzien | |
| 384-Well-Mikrotiterplatten mit flachem Boden | CORNING | 28908031 | Für Zellkulturen |
| Gen. 5 | Software BioTek | Für die Analyse der Messergebnisse des Synergy-II Multimode-Mikroplatten-Readers | |
| GraphPad Prism 5 GraphPad | Version 5 | Für biostatische Analysen und Plotten |
Referenzen
- Hemati, B., et al. Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph. J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).
- Gu, L., et al. Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus. PLoS ONE. 7, e43341(2012).
- Meiswinkel, R., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
