Visualisierung des zytoplasmatischen Flusses während der Einzelzell-Wundheilung bei Stentor coeruleus

Zusammenfassung

Der Riesenciliaten Stentor coeruleus ist ein klassisches System zur Untersuchung der Regeneration und Wundheilung in Einzelzellen. Durch die gleichzeitige Abbildung von Stentorzellen bei niedriger und hoher Vergrößerung ist es möglich, zytoplasmatische Flüsse vor, während und nach der Verwundung zu messen.

Zusammenfassung

Obwohl die Wundheilung oft auf der Ebene ganzer Gewebe behandelt wird, sind in vielen Fällen einzelne Zellen in der Lage, Wunden in sich selbst zu heilen und die zerbrochene Zellmembran zu reparieren, bevor der Zellinhalt austritt. Der riesige Einzeller Stentor coeruleus, bei dem Zellen mehr als einen Millimeter groß sein können, war bisher ein klassischer Modellorganismus für die Erforschung der Wundheilung in einzelnen Zellen. Stentorzellen können ohne Verlust der Lebensfähigkeit in zwei Hälften geschnitten und sogar zusammen geschnitten und transplantiert werden. Doch diese hohe Schnitttoleranz wirft die Frage auf, warum das Zytoplasma nicht einfach aus der Größe des Schnitts herausfließt. In dieser Arbeit stellen wir eine Methode vor, mit der Stentorzellen geschnitten werden können und gleichzeitig die Bewegung des Zytoplasmas in der Nähe des Schnitts mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung abgebildet werden kann. Der Schlüssel zu unserer Methode liegt in der Verwendung einer "Doppeldecker"-Mikroskopkonfiguration, bei der die Operation unter einem Präpariermikroskop durchgeführt wird, das auf eine Kammer fokussiert ist, die gleichzeitig von unten mit hoher Auflösung mit einem inversen Mikroskop mit einer hohen NA-Linse betrachtet wird. Dieser Aufbau ermöglicht ein hohes Maß an Kontrolle über den chirurgischen Eingriff und ermöglicht gleichzeitig eine hochauflösende Verfolgung des Zytoplasmas.

Einleitung

Regeneration und Wundheilung sind wichtige biologische Prozesse, deren Mechanismen nach wie vor aktiv erforscht werden. Tatsächlich ist die Fähigkeit, Wunden zu heilen und beschädigte Teile zu regenerieren, eines der Merkmale, die Lebewesen von unbelebten Objekten unterscheiden. Normalerweise geht man davon aus, dass die Regeneration durch die Differenzierung von Stammzellen in verschiedene Zelltypen vermittelt wird, die für den Wiederaufbau eines beschädigten oder abgetrennten tierischen Teils benötigt werden, während die Wundheilung als neue Zellen betrachtet wird, die in eine Wunde eindringen, um ein intaktes Epithel wieder aufzubauen. Beide Prozesse scheinen also durch Kollektive einzelner Zellen vermittelt zu werden, und scheinen daher durch und durch multizelluläre Prozesse zu sein. Es ist daher möglicherweise überraschend, dass einzelne Zellen in einigen Fällen in der Lage sind, Wunden zu reparieren und verlorene Bestandteile zu regenerieren¹. Die Wundheilung innerhalb einzelner Zellen kann mehrere Wege umfassen, einschließlich der Kontraktion des Aktin-Myosin-Geldbeutels um die Wunde und des Membranflickens durch schnelle Fusion der exozytotischen Vesikel^1-3. Obwohl viele Zelltypen zu einem gewissen Grad der Wundheilung fähig sind^4-6, ist das vielleicht dramatischste Beispiel der Riesenciliaten Stentor coeruelus⁷, der in Abbildung 1 dargestellt ist. Einzelne Stentorzellen sind 1 mm lang und mit Reihen von Flimmerhärchen bedeckt. Stentorzellen sind kegelförmig mit einem Mundapparat, der an einem Ende aus Tausenden von Zilien und am anderen Ende aus einer schmalen Haltestruktur besteht. Stentor war ein klassischer Modellorganismus für die Erforschung der Regeneration, denn wenn ein Teil der Zelle abgeschnitten wurde, konnte sie sich regenerieren⁷. Zum Beispiel zeigte Thomas Hunt Morgan⁸ in einer klassischen Versuchsreihe, dass eine Stentorzelle in zwei Hälften geschnitten werden kann und jede Hälfte eine normal proportionierte Zelle innerhalb weniger Stunden regeneriert⁸. Die molekularen Signalwege, die für die Regeneration bei Stentor verantwortlich sind, sind noch völlig unbekannt.

Die Fähigkeit von Stentorzellen, als Regenerationsmodellsystem zu dienen, beruht auf der erstaunlichen Fähigkeit dieser Zellen, sich selbst zu heilen, nachdem sie geschnitten wurden. Warum tritt das Zytoplasma einer Stentorzelle nicht aus, wenn die Zelle geschnitten wird? Die Wundheilung ist nicht auf eine unmittelbare Kontraktion der Zellrinde zurückzuführen, da es möglich ist, zwei Stentorzellen zu nehmen, sie zu schneiden und dann die beiden geschnittenen Zellen in verschiedenen Konfigurationen miteinander zu verbinden⁷. Bei solchen Transplantationsexperimenten muss das Zytoplasma der beiden Zellen freigelegt bleiben, da es beim Zusammenschieben der Zellen verschmilzt. Irgendwie ist das Zytoplasma dem umgebenden Medium ausreichend ausgesetzt, um eine Transplantation zu ermöglichen, aber es fließt dennoch nicht aus der Zelle. Ist das Zytoplasma von Stentor so elastisch, dass es einfach nicht herausfließen kann, selbst wenn ein großes Loch in die Plasmamembran gemacht wird? Erhöhen Zellen die Viskosität des Zytoplasmas lokal um eine Wunde, um zu verhindern, dass das Zytoplasma herausfließt? Zytoplasma ist ein hochkomplexes aktives Material^9-11, und die Stentor-Wundheilungsreaktion stellt eine einzigartige Gelegenheit dar, die zytoplasmatischen Strömungen und die Mechanik während der Einzelzell-Wundheilung zu untersuchen. Der Einsatz chirurgischer Methoden zur Induktion einer Verwundung im Stentor stellt jedoch eine technische Herausforderung dar. Um eine 1 mm lange Zelle mit Glasnadeln zu schneiden, dem konventionellen chirurgischen Paradigma, ist es notwendig, mit geringer Vergrößerung und großem Arbeitsabstand zu arbeiten. Unter diesen bildgebenden Bedingungen ist es nicht möglich, den Fluss des Zytoplasmas zu verfolgen, und man kann nur feststellen, ob das Zytoplasma in der Zelle verbleibt oder nicht. Die eigentliche Frage, die wir stellen möchten, ist, wie sich die Bewegung und Viskosität des Zytoplasmas während des Schneidens und der Heilung ändern kann. Dies erfordert eine hochauflösende Bildgebung. Hier präsentieren wir eine Adaption des Tartar-Protokolls für das Schneiden von Stentor⁷, die es ermöglicht, das Schneiden unter einer Optik mit geringerer Vergrößerung durchzuführen, um die gesamte Zelle zu sehen und gleichzeitig den Zytoplasmafluss mit hoher Auflösung zu beobachten, so dass dieses System als Plattform für die Erforschung der Mechanismen der Einzelzell-Wundheilung verwendet werden kann.

Protokoll

1. Zellkultur und -sammlung

1. Beziehen Sie Stentor coeruleus-Zellen entweder aus natürlichen Teichen, wie in Tartar⁷ beschrieben, oder von einem kommerziellen Anbieter (siehe Reagenzien).
2. Pflegen Sie Kulturen, indem Sie im Dunkeln bei 20 ºC in modifiziertem Stentor Medium (MSM) züchten, das an die von Tartar⁷ und De Terra¹² beschriebenen Rezepte angepasst ist und 0,75 mM Na₂CO₃, 0,15 mM KHCO₃, 0,15 mM NaNO₃, 0,15 mM KH₂PO₄, 0,15 mM MgSO₄, 0,5 mM CaCl₂ enthält, und 1,47 mM NaCl.
3. Ergänzen Sie das MSM-Medium mit einer Kohlenstoffquelle, indem Sie dem Medium lebende Beute hinzufügen. Züchten Sie Kulturen mit Chlamydomonas reinhardtii TAP-Medium unter Verwendung von Standardkulturmethoden¹³. Waschen Sie Chlamydomonas-Zellen vor der Fütterung in MSM. Füttern Sie 300 ml Stentorkulturen ~3 x 10⁷ Chlamydomonas Zellen 2-3x pro Woche.
4. Sammeln Sie Stentorzellen für die Operation mit einer Pipette. Stentor neigen dazu, sich am Boden und an den Seiten der Kulturschale zu verankern, und um Zellen zu sammeln, bewegen Sie die Kultur, indem Sie Luft durch eine Pipettenspitze blasen, bis sich die Zellen zu lösen beginnen und frei zu schwimmen.
5. Fangen Sie schwimmende Zellen mit einer Pipette auf, die mit einer Spitze mit breiter Öffnung ausgestattet ist, um ein Scheren der Zellen zu vermeiden.
6. Waschen Sie die gesammelten Zellen in frischem MSM.

2. Vorbereitung von Werkzeugen für die Mikrochirurgie

1. Halten Sie zwei Glasrührstäbe über einen Bunsenbrenner oder eine andere Flamme, bis die Enden zu schmelzen beginnen.
2. Berühren Sie die Enden der beiden Stäbe miteinander, so dass das geschmolzene Glas verschmilzt.
3. Nachdem Sie ein kleines Tröpfchen geschmolzenes Glas zwischen den beiden Stäben gebildet haben, nehmen Sie sie von der Flamme, lassen Sie sie 1-2 Sekunden abkühlen und ziehen Sie sie dann auseinander, um einen sauberen Bruch zu machen. Im Idealfall zieht sich das Glas in dünne Fäden heraus und bricht glatt, wenn das Glas abkühlt, was zu einer etwa 1-2 cm langen Nadel mit einer feinen Spitze am Ende führt (Abbildung 2).
4. Wenn die resultierende Nadel suboptimal ist, können die Spitzen zu Glasabfällen gebrochen und die Stäbe wiederverwendet werden.

3. Einbetten von Zellen für die Mikrochirurgie und Beobachtung (normale Chirurgie)

1. Bereiten Sie eine quadratische Vaseline-Wandkammer vor, indem Sie einen quadratischen Gummistempel verwenden, der mit Vaseline beschichtet und auf ein Glasdeckglas gedrückt wird.
2. Füge MSM mit 2% Methylcellulose zum Vaseline-Quadrat hinzu.
3. Legen Sie das Deckglas in einen Kunststoffadapter, mit dem das Deckglas mit einem Standard-Objektträgerhalter auf ein Mikroskop aufgesetzt werden kann (Abbildung 3).
4. Fügen Sie dem MSM gewaschene Zellen aus Schritt 1.6 plus Methylcellulose hinzu, um die Beweglichkeit der Stentorzellen zu behindern, damit sie während der Operation an Ort und Stelle bleiben.
5. Ordnen Sie die Zellen in der Methylcellulose so an, dass sie gleichmäßig verteilt sind und nahe genug an die Oberfläche des Deckglases geschoben werden, um während der Bildgebung scharf zu sein.

4. Hochauflösende Bildgebung der Wundheilung in lebenden Stentoren

Um eine Stentorzelle gleichzeitig mit hoher Auflösung abzubilden, während sie chirurgisch unter geringer Vergrößerung geschnitten wird, konstruieren Sie ein "Doppeldecker"-Mikroskop mit einem Präparierfernrohr, das am Okularkopf des inversen Zielfernrohrs befestigt ist, so dass es auf die Oberseite des Objektträgers fokussiert wird, während das inverse Zielfernrohr von unten auf den Objektträger fokussiert wird.

1. Setzen Sie einen Objektträger auf das umgekehrte Zielfernrohr (verwenden Sie entweder eine Zeiss Axiovert 200M oder eine Olympus IX80).
2. Nehmen Sie den Präpariermikroskopkörper von seinem Stativ und bestimmen Sie die ungefähre Position über dem inversen Mikroskopokular, um das Präparierfernrohr zu platzieren, damit der Objektträger bei geringer Vergrößerung sichtbar gemacht werden kann.
3. Modifizieren Sie einen Karton so, dass er die gleiche Dicke wie der gewünschte Abstand zwischen dem Okularkopf des invertierten Oszilloskops und dem Präparierfernrohr hat, und kleben Sie dann mit Laborklebeband in das invertierte Zielfernrohr ein, das nach Abschluss des Experiments leicht entfernt werden kann. Passen Sie die Dicke des Kastens an die genaue Konfiguration des Okularkopfes des inversen Mikroskops und an die Größe des Präpariermikroskops an, so dass sich die Probe im Sichtfeld befindet, ohne dass das Präparierfernrohr nach dem Anbringen bewegt werden muss.
4. Halten Sie das Präparierzielfernrohr gegen die Box, bewegen Sie es, bis der Objektträger scharf ist, und kleben Sie es dann wieder mit Laborklebeband auf die Box. Die endgültige Konfiguration ist in Abbildung 4 dargestellt.
5. Bildzellen durch invertiertes Oszilloskop mit DIC-Optik und einer 20-fachen Luftobjektivlinse. Verwenden Sie einen DIC-Kondensor mit großem Arbeitsabstand, um genügend Platz für die Durchführung der Mikrochirurgie von oben zu schaffen.
6. Erfassen Sie Bilder mit einer Bildrate von 2 Bildern/s mit einer CCD-Kamera mit 512 x 512 Pixeln.
7. Beginnen Sie mit der Akquise, bevor Sie mit dem Schneiden der Zellen beginnen, um das anfängliche zytoplasmatische Flussmuster zu erfassen und alle Stadien der Wunde und des Wundheilungsprozesses zu beobachten.
8. Beenden Sie die Erfassung, wenn die Zelle wieder normal aussieht und/oder aktiv beweglich ist, um zytoplasmatische Bewegungen während des gesamten Regenerationsprozesses zu visualisieren und zu messen.

5. Analyse des zytoplasmatischen Flusses während der Wundheilung

Messen Sie den zytoplasmatischen Fluss mit Hilfe der Particle Image Velocimetry (PIV). Diese Technik ist bei der Untersuchung der Fluiddynamik Routine und kann Strömungsfelder erzeugen, wenn keine individuell verfolgbaren Partikel in der Flüssigkeit vorhanden sind. PIV wurde verwendet, um Zytoplasmaflüsse auf der Grundlage der Bildgebung subzellulärer Vesikel und anderer im Zytoplasma sichtbarer Merkmale durch Durchlichtmikroskopie^{zu messen 14}.

1. Laden Sie PIVLab, ein MATLAB-Paket für PIV, von der Website http://pivlab.blogspot.com/ herunter.
2. Laden Sie den TIFF-Bildstapel für jede Videosequenz in das PIV-Programm in MATLAB.
3. Generieren Sie manuell eine Maske für jeden Bildstapel, um Bereiche der Rohdaten außerhalb des Körpers von Stentor zu maskieren.
4. Legen Sie PIVLab so fest, dass die Einstellung für die schnelle Fourier-Transformation und eine Bin-Größe von 64 x 64 Pixeln verwendet werden, wodurch die Pixel in jedem Frame in größere quadratische Pixel unterteilt werden.
5. Führen Sie PIVLab aus, um Kreuzkorrelationen zwischen den Pixeln in jedem Frame mit benachbarten Pixeln im nächsten Frame zu berechnen, um einen zeitabhängigen Flussvektor zu erhalten, der auf jedem binnierten Pixel zentriert ist und die gleiche Zeitauflösung wie unsere Rohdaten hat.
6. Berechnen Sie Zeitdurchschnitte der resultierenden Vektorfeldausgabe, um Stromlinien für den Vergleich zwischen Daten zu erzeugen, die mit dem Stentor vor dem Schneiden und während der Wundheilung aufgenommen wurden, und berechnen Sie Histogramme der Strömungsgeschwindigkeiten (zur Untersuchung der Strömungsstärke) und der Geschwindigkeitsänderung an einem bestimmten Pixel im Laufe der Zeit (zur Untersuchung von Strömungsschwankungen).
7. Für Bildsequenzen, bei denen Stentor in zwei Hälften gespalten ist und Zytoplasma sichtbar in den umgebenden Puffer austritt, berechnen Sie den Gesamtfluss des Zytoplasmas zurück in den eigentlichen Zellkörper, indem Sie die durchschnittliche Strömungsgeschwindigkeit mit der Querschnittsfläche der Basis der extrazellulären Zytoplasmablase multiplizieren.

Ergebnisse

Unter Verwendung der oben beschriebenen Protokolle wurde festgestellt, dass das Zytoplasma von Stentor bemerkenswert dynamisch ist, sowohl vor als auch nach dem Schneiden. Video 1 zeigt den ausgedehnten Fluss von Zytoplasma, das in ungeschnittenen Zellen vorhanden ist. Entgegen unserer ursprünglichen Erwartung, dass die Fähigkeit von Stentor, das Schneiden zu überleben, eine Versteifung oder Gelierung des Zytoplasmas mit sich bringen würde, bleibt das Zytoplasma hochdynamisch, wenn Stentorzellen mit genügend Gewalt geschnitten werden, um das Zytoplasma aus der Zelle zu ziehen, und schafft es, auf hochgerichtete Weise in die Zelle zurückzufließen (Video 2).

Neben dem Nachweis eines bisher unerwarteten Grades an zytoplasmatischer Bewegung während der Wundheilung kann die hohe Auflösung der Bildgebung im Assay zur Quantifizierung der Flussraten mittels Particle Image Velocimetry verwendet werden. Die Möglichkeit, solche Messungen durchzuführen, wird es ermöglichen, die Wirkung chemischer Inhibitoren rigoros zu testen.

Abbildung 1. Morphologie einer lebenden Stentorzelle. Dunkelfeldbild einer lebenden Stentorzelle, die mit Chlamydomonas gefüttert wurde, wie in Verfahren 1.3 beschrieben, sichtbar als grünes Material in Nahrungsvakuolen. Der Mundapparat, durch den die Zelle frisst, ist am oberen Bildrand als Rand aus Flimmerhärchen zu sehen. Klicken Sie hier, um das Bild zu vergrößern.

Abbildung 2. Vorbereitung der Glasnadel für die Operation. (A) Die Nadel wird aus dem Ende eines massiven Glasstabes gezogen. (B) Ansicht der Nadelspitze mit hoher Vergrößerung, die die für die Operation erforderliche Länge und Schärfe anzeigt. Klicken Sie hier, um das Bild zu vergrößern.

Abbildung 3. Kundenspezifischer Deckglashalter für die Mikrochirurgie. Um einen freien Zugang für die Operation zu ermöglichen und gleichzeitig optimale Bildgebungsbedingungen zu ermöglichen, werden die Zellen auf einem Deckglas und nicht auf einem dicken Objektträger montiert. Damit das Deckglas auf den Mikroskoptisch passt, kann mit einem 3D-Drucker ein Kunststoffhalter hergestellt werden. Der Halter hat die gleichen Abmessungen wie ein Standard-Objektträger, während die Vertiefung in der Mitte den Abmessungen des Deckglases entspricht. Durch ein Loch in einer Ecke kann das Deckglas aus der Halterung herausgenommen werden. Klicken Sie hier, um das Bild zu vergrößern.

Abbildung 4. Konfiguration eines Doppeldecker-Mikroskops. Ein Präpariermikroskopkopf wird auf den Okularkopf eines inversen Mikroskops aufgesetzt. Mit dem Laborband kann das Gerät nach Abschluss des Experiments schnell auf- und abgebaut werden. Klicken Sie hier, um das Bild zu vergrößern.

Video 1. Beispiel für einen zytoplasmatischen Fluss, der in lebenden Stentorzellen beobachtet wurde. Die Zelle wurde mit einem 10-fach-Objektiv mit Dunkelfeldoptik mit einer Rate von 2 Bildern/Sek. abgebildet.

Video 2. Ich zeige eine Stentorzelle, wie sie mit einer Glasnadel geschnitten und aufgebrochen wird. Nach dem Schneiden wurde eine beträchtliche Menge Zytoplasma aus dem Hauptzellkörper entnommen, aber es fließt schnell wieder in die Zelle zurück.

Diskussion

Die wichtigste Anwendung dieser Methode wird darin bestehen, sie zur Bestimmung der molekularen Signalwege zu verwenden, die den zytoplasmatischen Fluss während der Wundheilung im Stentor regulieren. Es steht eine breite Palette chemischer Inhibitoren zur Verfügung, die sowohl auf Motorproteine als auch auf Komponenten des Zytoskeletts abzielen. Inhibitoren der Kalzium-Signalübertragung wären ebenfalls wahrscheinliche Kandidaten. Es wäre auch von Interesse, die Pigmentkörner (Extrusomen), die das blaue Pigment Stentorin enthalten, dessen Freisetzung aus der Zelle unter Stress ausgelöst wird, zu entfernen oder zu reduzieren und zu fragen, wie die exozytotische Freisetzung von Stentorin den Fluss des benachbarten Zytoplasmas beeinflussen kann. Das Pigment kann mit einer einfachen Bleichbehandlung¹⁵ aufgebraucht werden, die unmittelbar vor dem Schneiden durchgeführt werden kann. Es scheint keine einfache Möglichkeit zu geben, den Wundheilungstest parallel durchzuführen, da die Zellen einzeln geschnitten und abgebildet werden müssen. Mit einem einzigen Mikroskop wäre es also möglich, Zellen mit einer Rate von etwa 1 pro 0,5 Stunden zu operieren und zu messen, so dass es an einem einzigen Arbeitstag möglich sein sollte, genügend Datenpunkte für eine einzige Verbindung zu erhalten, um festzustellen, ob sie einen statistisch signifikanten Einfluss auf den Prozess hat. Obwohl die Methode somit in keiner Weise einen hohen Durchsatz bietet, wird es durchaus machbar sein, eine ausgewählte Gruppe von Kandidatenverbindungen zu screenen, die für einige sorgfältig ausgewählte Zielwege spezifisch sind.

Eine wesentliche Einschränkung des derzeitigen Ansatzes ist die relativ grobe Methode zum Zusammenbau des Doppeldeckermikroskops. Unter der Annahme, dass das für die Bildgebung verwendete inverse Mikroskop ein allgemeines Instrument ist, das andere Arbeiter für andere Zwecke verwenden müssen, ist eine wichtige Überlegung die Leichtigkeit, mit der die Vorrichtung zerlegt und wieder zusammengebaut werden kann. Während die derzeitige Methode mit Laborklebeband in der Tat schnell und einfach zu demontieren ist, erfordert sie jedes Mal eine sorgfältige Ausrichtung durch den Benutzer während der Montage. Eine wichtige Modifikation wäre daher die Konstruktion einer kundenspezifischen abnehmbaren Halterung mit Schlitzen für den Okularkopf des umgekehrten Zielfernrohrs und den Körper des Präparierfernrohrs. Diese soll mit moderner 3D-Druckertechnik einfach herzustellen sein.

Eine zweite Einschränkung des Ansatzes ist die Abhängigkeit von DIC-Bildgebung von intrazellulären Organellen als Marker für die Strömung. Da die Identität dieser am Mikroskop beobachteten Organellen derzeit nicht bekannt ist, ist es nicht möglich, ihre Größe oder mögliche Wechselwirkungen mit anderen zellulären Komponenten zu kennen. Es kann daher von Vorteil sein, extrinsische Tracer wie fluoreszierende Kügelchen zu injizieren und diese zur Verfolgung der Strömung zu verwenden. Dies würde jedoch einen zusätzlichen Schritt - die Mikroinjektion - erfordern, bevor das Experiment durchgeführt werden könnte, was den Assay weiter verlangsamen würde.

Die letzte wichtige Einschränkung ist die Abhängigkeit von einer einzigen Bildebene für die Datenerfassung. Die Hauptbedeutung dieses Assays besteht darin, dass er über die einfache Frage, ob eine Wunde heilt oder nicht, hinausgeht und eine detaillierte Analyse des Flussmusters ermöglicht. In diesem Zusammenhang wird es äußerst wichtig sein, die Bildgebung auf die dreidimensionale Bildgebung auszuweiten. Die aktuelle Methode bildet eine einzelne Fokusebene ab, und wenn die PIV-Analyse durchgeführt wird, ist das Ergebnis ein Schnitt durch das gesamte dreidimensionale Strömungsfeld. Das ist informativ, aber unvollständig. Durch die Aufnahme von 3D-Bildern in jedem Zeitschritt sollte es möglich sein, ein vollständig dreidimensionales Strömungsfeld zu erhalten. Dies ist besonders wichtig, um genau zu beobachten, wie sich das Zytoplasma in unmittelbarer Nähe der Wundstelle bewegt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Stentor coeruleus Lebendkultur	Carolina Biological 131598
Methylcellulose, 1.500 cP	Sigma	M0387<
Materialname	Firma	Katalognummer
5 Zoll lang	Fisher Scientific	11-380A
Kulturschale 4,5 in 250 ml  Glas	Carolina Biological 741004
IX81 inverses	Mikroskop Olympus
Axiovert 200M inverses Mikroskop	Zeiss
Stemi 2000 Stereomikroskop	Zeiss
Evolve 512 x 512 EMCCD Kamera	Photometrics
Plan Apo 20X Objektiv	Olympus	UPLSAPO