Mit Flachbett-Scanner mit hoher Auflösung zeitversetzt Bilder von der Arabidopsis-Wurzel gravitropen Antwort sammeln

Sammlung von hochauflösenden phänotypischen Daten sind nützlich in Studien, die das Zusammenspiel von Genetik und Umwelt in der Vermittlung organismal Funktion ^1,2 verstehen wollen. Studien dieser Art sind auch von Natur aus in großen Maßstab, so dass es zusätzlich erforderlich, dass für die Messung Phänotypen in diesem Zusammenhang angewandten Methoden in Hochdurchsatz ^3,4 sein. In die Methoden zur Phenomics angelegte Forschung, Kompromisse zwischen Durchsatz und Auflösung ins Spiel kommen. Methoden, die in höheren Durchsatz sind, neigen auch zu niedrigeren Auflösung sein, so dass es schwierig ist, geringe Auswirkungen der Genetik oder der Umgebung ⁵ zu erfassen. Alternativ Methoden, die genauer messen einen gewünschten Phänotyp neigen auch zu niedrigeren Durchsatz, so dass es schwierig ist, genetische und Umwelteinflüsse weitgehend überblicken. Zusätzlich können manuelle Methoden zur Quantifizierung von Phänotypen, einschließlich visueller Inspektion, Veränderungen unterliegen aufgrund der Unterschiede in der menschlichen Pro⁶ Wahrnehmung.

Imaging-Technologien können eine nützliche Brücke zwischen Durchsatz und Auflösung bei der Beschaffung von phänotypischen Beobachtungen ^9.7 bieten. Im allgemeinen ist ein Bild relativ leicht zu erfassen, zu erleichtern Durchsatz, und wenn bei ausreichender Auflösung eingenommen wird, kann feine Phänotypen erkannt werden ^1,2,7. Imaging-Technologien neigen modifizierbar, um ein System oder Verfahren von Interesse fit zu sein und sind in der Regel ^10-12 skalierbar. Aus diesem Grund sind ideal Imaging-Technologien für die Entwicklung von großen Studien der organismischen Funktion.

Die Reaktion der primären Wurzel zu einem Schwerkraft Stimulus ist ein kompliziertes physiologischer Prozess, der innerhalb eines morphologisch einfaches Organ auftritt. Die Antwort beinhaltet die Aktivierung der Signalwege, die durch die Wurzel Organ ausbreiten und ihr Fortschreiten durch Umwelt-und genetischen Faktoren, wie genetische Faktoren, die durch die Umwelt beeinflusst wird ^12-14 12,14,15. Der Erwerb von einem detaillierten Verständnis der Dynamik dieser Antwort ist bei der Suche nach Möglichkeiten, um die Fähigkeit der Keimlinge, um erfolgreich in einer bestimmten Umgebung ¹⁶ etabliert verbessern wichtig. Darüber hinaus ist die Form des Wurzel macht es zugänglich für Bildverarbeitungsanwendungen ^8,12,17. Zusammengenommen ist die Wurzel gravitropen Antwort ein ideales System für die Entwicklung von Hochdurchsatz-Imaging-Technologie für die Zwecke der Durchführung der Genomik-Level-Studien der organismischen Funktion.

In diesem Bericht wird ein Hochdurchsatz-und hochauflösende Methode zur Bildaufnahme des Wurzel gravitropen Reaktion unter Verwendung kostengünstiger, handelsüblichen Flachbettscanner vorgestellt. Die Übersicht über dieProtokoll ist in Fig. 1 gezeigt. Sämlinge gepflanzt auf Agar-Platten wurden auf vertikal ausgerichteten Flachbettscanner mit benutzerdefinierten Plexiglasplatte angebracht Halter positioniert. Die Bilder wurden alle paar Minuten bei 4.800 dpi gesammelt und auf einem lokalen Laufwerk oder Daten-Server gespeichert. Metadaten, die mit jeder Bildreihe zugeordnet ist, in einer Datenbank gespeichert, und die gespeicherten Bilder verarbeitet werden. Der Ansatz nutzt die Software VueScan für die Bilderfassung. VueScan kann verwendet werden, um mehr als 2.100 verschiedene Scanner auf Windows-, Mac-oder Linux-Betriebssystemen laufen (siehe Materialien Table) werden. Ein Scanner-Auflösung von 4.800 dpi wurde in dieser Anwendung verwendet, um die in früheren Studien mit festen CCD-Kameras ^1,8,12 erreichte Auflösung entsprechen. Die Flexibilität der VueScan-Software zusammen mit der gemeinsamen Schnittstelle verwendet es für jeden Scanner läuft es ermöglicht Benutzern, ohne weiteres auf die in diesem Papier Protokoll verabschieden praktisch jede Scanner-Hardware mit ausreichender Auflösung. Stromdurchsatz ermöglicht die Sammlung von216 Einzelantworten pro Tag. Die Technologie ist anpassungsfähig und skalierbar für den Einsatz in Einrichtungen, die von Hochschulen zu Universitäten erforschen. Darüber hinaus sind die gesammelten Bilder von ausreichender Qualität für die Bildanalyse.

1. Image Acquisition-Protokoll

Überlegungen:

Dieses Protokoll wird am effektivsten mit zwei Personen durchgeführt, obwohl es möglich ist, eine allein arbeiten. Die Anordnung arbeitet am besten in diesem Labor war für eine Person, um Platten für das Scannen vorzubereiten, während andere Werke auf Scanner-Setup, dann beide zusammen arbeiten, um Platten in Scanner platzieren und den Scanvorgang.

Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Scanner in diesem Projekt sind vertikal die Scanner-Deckel auf der Rückseite des Scanners ruhen ausgerichtet. Eine benutzerdefinierte Unterstützung wurde gemacht, um Gerichte in dieser vertikalen Position zu halten und wurde auf dem Flachbettfläche mit 3M Befehlsleisten (Abbildung 2) befestigt. Der abnehmbare Dokumentenabdeckung, die mit dem Scanner in diesem Protokoll (ein Epson V700) verwendet wird, stammt wurde auf einer Seite mit schwarzem Filz ausgekleidet. Die Vorlagenabdeckung wurde gegen den Flachbett mit einem Bungee-Seil positionierthalten die Platten an Ort und um den Bildkontrast (Abbildung 3) zu liefern.

Alle Scanner von ausreichender Auflösung könnte für die Bilderfassung verwendet werden. Der Epson Perfection V700 wurde wegen seiner Vierkantprofil (macht es einfach, vertikal positionieren), seine hohe Auflösung, und die zusätzlichen Möglichkeiten, aus der sowohl das Bett und Deckel zu scannen und die Infrarot-Kanal verwenden gewählt. Diese zusätzlichen Optionen wurden nicht in diesem Protokoll verwendet.

Sobald die Platten aus der Wachstumskammer entfernt worden ist, ist es unerlässlich, dass das Protokoll bis zum Ende.

Plattenvorbereitung

Standard-Petrischalen, die 10 ml Medium transparent und 9 Samen in der Mitte jeder Platte gepflanzt wurden verwendet. : Verfahren zur Kennzeichnung Platte, Medien-und Pflanzvorbereitung finden Sie unter http://www.doane.edu/doane-phytomorph

1. Nehmen Triton X-100 (ein Reinigungsmittel), um den Deckel mit einem Kimwipe - großzügig sein.
   (Beachten Sie, dass Triton X-100 verhindert die Ansammlung von Kondenswasser am Deckel, wenn die Platte gescannt. Eine großzügige Anwendung (genug, um einen Film auf der Deckeloberfläche erstellen) wird dazu beitragen, sicherzustellen, dass der Deckel bleibt während der gesamten Lauf Scanner transparent .)
2. Wickeln Sie die Platte mit Mikroporen-Band, um den Deckel zu sichern und für die Belüftung.

Scanner-Setup-und Bildsammlung

Dieses Protokoll geht davon aus, dass mehr als ein Scanner verwendet wird, und gibt Anweisungen an mehrere Scanner von einem einzigen Computer zu starten.

4. Erstellen Sie Ordner zum Speichern von Bildern von jedem Scanner. Jeder Scanner wird zwei Platten zu halten, so bedenken Sie dies bei der Erstellung von Ordnern. Einkönnen wählen, um die Metadaten als Bestandteil der Dateinamen wie eindeutige IDs für jede Platte, Sämling Alter, Größe der Samen, und IDs der Bestände gepflanzt verwenden. Ein Beispiel für einen Ordnernamen in der Datenerhebung verwendet diese Metadaten enthält, ist "1652-2-sm-9-92-17-1653-2-lg-88-79 bis 161".
5. Stellen Steckdose Timer für bestimmte Sammelzeit (9 Stunden wurde in diesem Labor verwendet wird). Achten Sie darauf, mehr Zeit (eine Stunde oder so) für die Vorbereitung gesetzt.
   (Beachten Sie, dass Scanner sollte in die Steckdose Timer, um die Aufnahmezeit eingestellt gesteckt werden. Während die VueScan Software ermöglicht einem Benutzer, Bilder immer wieder zu sammeln, ist es nicht erlauben dem Benutzer, um anzuzeigen, wie viele Bilder zu sammeln oder wie lange die Bilder für sammeln .)
6. Schalten Sie die ersten Scanner und warten Sie etwa 10 Sekunden für den Scanner, um durch seine Anfangs warm-ups zu gehen.
7. Öffnen Sie das Programm VueScan einmal. VueScan 9.0.20-Version wurde in diesem Protokoll verwendet (siehe Materialien Tabelle), können aber neueren Versionen mit wenig modific verwendet werdenation. Stellen Sie sicher, dass das "Mehr"-Taste ist auf der Unterseite der Benutzerschnittstelle, um die Menüoptionen unten beschrieben angezeigt gedrückt.
8. Stellen Sie die automatische Wiederholung: Dropdown-Feld zu keiner unter der Registerkarte Eingabe und unter der Registerkarte Crop gesetzt Vorschaubereich: bis Maximale (Abbildung 4). Drücken Sie 'Vorschau'.
9. Erstellen Sie ein Erntefeld, das die Region von Interesse mit der Maus klicken und ziehen Sie in der gesamten Region von Interesse auf der Vorschau-Bild zu erfassen wäre. Die Einstellungen können für die Region von Interesse in der Registerkarte Crop verändert werden. Die typischen Einstellungen für die Crop-Box verwendet wurden, waren: x-Offset 0,675; y-Offset in 1.924, obwohl dies wurde angepasst, um den Keimling Bereich für jeden Scanner zu erfassen. Die Ernte Kastengröße verwendet wurde, war 7,246 in der Breite und 1,1 cm (Abbildung 5).
10. Um die Erntefeld zu verschieben, halten Sie die Shift-Taste gedrückt, während Sie mit der Maus. Stellen Sie sicher, dass der Crop-Box enthält alle Sämlinge gescannt werden und beliebige Metadaten, die auf einem Etikett (Abbildung 5) enthalten sein können.
11. Unter der Registerkarte Crop, stellen Sie die Vorschau-Bereich: In den Crop-Box und drücken Sie 'Vorschau'.
12. Gehen Sie auf die Registerkarte Ausgabe, und wählen Sie die richtige Datei für den Scanner (Abbildung 5).
13. Wiederholen Sie die Schritte 1,7-1,12 auf allen Scannern für einen Computer. Wählen Sie die "Ja"-Option, wenn Sie gefragt, ob mehr als eine Instanz von VueScan zu öffnen.
14. Gehen Sie durch jede Registerkarte und überprüfen, ob die Einstellungen korrekt sind. (Beachten Sie, dass alle Spezifikationen können geändert werden, um die Bedürfnisse eines einzelnen Labor einschließlich Bild-Farbe, Auflösung, etc. angepasst werden. Allerdings können die Einstellungen in diesem Protokoll direkt an den pa angewendet werdenrticular Scannen Hardware eines bestimmten Labor aufgrund der gemeinsamen Schnittstelle der Software VueScan. Finden Sie in der Liste im Anhang Spezifikationen, die in diesem Projekt verwendeten Parameter mit VueScan 9.0.20 Version) anzuzeigen.
15. Unter der Registerkarte Eingabe wählen Dauer im Auto-repeat: Feld, oder wählen Sie ein längeres Zeitintervall zwischen den Bildern, wenn gewünscht. Das Zeitintervall ist die Zeit der Scanner Pausen nach dem Speichern das letzte Bild und beginnt Sammlung des nächsten Bildes. Im Dauerbetrieb kann 3-4 min bei 4.800 dpi Auflösung erhalten werden.
16. Wiederholen Sie die Schritte von 1,14 bis 1,15 für den Rest der an einen Computer angeschlossen Scanner.
17. Zeigen vorbereitet Platten in den richtigen Scanner mit Sämlinge horizontal ausgerichtet (nicht gravistimulate).
18. Vorübergehend legen schwarz, fühlte Hintergrund gegen die Platten, damit sie nicht aus Plexiglas Vorlage fallen. Wiederholen Sie für alle Scan-Partner.
    (Anmerkung: In diesem Projekt wurden schwarze Stücke aus Filz, um das Dokument deckt mit der Ausrüstung zur Verfügung gestellt, um die Blendung zu verhindern und Kontrast gegen Wurzelgewebe liefern befestigt Die spezifische Hintergrundfarbe verwendet wird auf die Farbe des Gewebes, das abgebildet abhängen.).
19. Lassen Sie eine Person drehen die Platten 90 ° (gegen den Uhrzeigersinn Platten wurden in diesem Protokoll eingeschaltet ist) und sofort zu ersetzen, den Filz Hintergrund.
20. Die andere Person sollte auf dem Computer zu stehen, so dass sie sofort drücken Sie die "Scan"-Taste.
21. Sichern Sie den Hintergrund der Scanner mit einem Bungee-Seil (Abbildung 3). Lassen Sie eine Person halten, die Hintergrund an Ort und Stelle, während ein anderer Positionen der Bungee-Seil.
    (Anmerkung: Unmittelbar nach Gravistimulation (Rotation der Platten von 90 °) und die Platzierung des Filzes Hintergrund, "Scan" gedrückt werden sollte).
22. Wiederholen Sie die Schritte von 1,17 bis 1,21 für den Rest der Scanner auf einem einzelnen Computernäh.
23. Wiederholen Sie die Schritte 1,6-1,22 für den nächsten Satz von Scannern falls zutreffend.
24. Lassen Sie die Scanner erst mehrere Bilder wurden gesammelt, um sicherzustellen, dass sie richtig sparen.
25. Es ist ideal, um die Scanner in einem Bereich, der frei von Störungen für die Scan-Zeit bezeichnet sein wird halten. Es ist auch ratsam, die Umweltbedingungen in der Scan-Bereich betrachten, um ideal phänotypische Reaktionen zu gewährleisten.
26. Wenn die Datenerfassung abgeschlossen ist, drücken Sie die grüne Taste abbrechen VueScan auf jedem Fenster, die mit jedem Scanner zusammenfällt.
27. Schließen aller Programme auf dem Computer.
28. Starten Sie den Computer und schaltete alle Scanner, bevor eine weitere Runde der Bildsammlung.

Repräsentative Bilder

Dieser Ansatz ermöglicht eine schnelle Produktion von hochauflösenden Zeitreihen von Arabidopsis Sämling Wachstum. Erste und letzte Bilder von einem Scanner Laufs sind in den 7A und 7B gezeigt. Figuren 7C und 7D optimale Ergebnisse von der Hälfte einer Vollbildscanner. Einige Fragen, die die Bildqualität beeinflussen können, sind in den Figuren 7A und 7B gezeigt. Diese Fragen gehören Variation in Keimung, Variation in Sämling Wachstumskurs zu Beginn der Flucht, und Aufbau von Kondensation beim Scannen. Kondensation kann weitgehend durch eine Erhöhung der Menge an Triton X-100 auf der Innenseite der Deckelplatte aufgebracht gelöst werden. Andere Faktoren, die genaue Bildsammlung hemmen könnten, sind falsche Konfiguration des Erntefeld in Bezug auf die Plattenposition und Positionierungsplatten, so dass sie in Bezug auf das Erntefeld verzerrt.

Bildanalyse-Anwendung: Bildkomprimierung
Sobald eine Zeitsequenz von Scannerbildern erhalten worden ist, muss es sicher in einem Netzwerk zugänglichen Weise gespeichert ist, um die Bildanalyse zu erleichtern. Die Bilddateien mit einer individuellen Lauf Scanner verbunden belegen eine erhebliche Menge an Festplattenspeicher. Eine bei 4.800 dpi gesammelt einzelne TIFF-Datei ist ca. 220 MB und eine typische Scanner Lauf erzeugt 200 Bilddateien. Daher ist etwa 44 GB Festplattenspeicher pro Lauf erforderlich. Den Speicher-und Netzwerkübertragungskosten mit Bildanalyse zu verringern, ist es wünschenswert, die Menge an Platz benötigt wird, um Bilddaten zu speichern, während gleichzeitig die Minimierung der Datenverlust zu reduzieren. Downstream-Analyse Identifizierung jeder Sämling beinhalten in nachfolgenden Bilddateien mit einer experimentellen Lauf verbunden. Daher Segmentierung aus einzelnen Sämlinge aus dem Scanner Bild kann nachgelagerten Analyse erleichtern. Da die Segmentierung des Keimlings weg vom Rest der thBild E kann auch erheblich reduzieren Lagerung von unnötigen Hintergrundpixel führt dieser Ansatz auch deutliche Reduzierung der Datengröße. Außerdem, wenn stromabwärts Analyse auf Wurzelgewebe fokussiert es nicht notwendig sein, um die Farbinformation zu halten, da die Wurzel Pixel sind relativ schmal in ihrer Farbraum. Ein Computer-Bildverarbeitungsprotokoll und Code, um Daten Größe durch die Segmentierung sowohl einzelne Sämlinge und Umwandlung von Bildern in Graustufen zu reduzieren, entwickelt. Der Ansatz führt zu einer Reduktion von 60% in der Speicherplatzbedarf.

Die zur Durchführung dieses Datenkompression zu erreichen Workflow wird in den folgenden Schritten beschrieben:

1. Beginnen Sie mit einer Zeitreihe von Scanner-Bild-Dateien in einem einzigen Ordner.
2. Für jedes Bild, konvertieren von einem RGB in Graustufen (Abbildung 8, oben).
3. Teilen Sie das Bild in linken und rechten Seite.
4. Extrahieren Sie jede Keimling aus dem Bild in eine eigene Datei (Abbildung 8).Dies wird durch Anlegen einer Schwelle, um Pixel, die schwarz oder weiß, und dann Berechnen der Gesamtpixelintensität jeder Bildzeile umzuwandeln geführt. Die Zeile mit der höchsten Intensität identifiziert wird und jedes Pixel wird als "Pflanzen" oder "nicht-pflanzlichen 'basierend auf der Intensität der Nachbar klassifiziert. Das Zentrum jeder 'Pflanze' innerhalb dieser Zeile gefunden und von diesem Punkt eine Ernte Feld von einer bestimmten Größe gezeichnet wird (Abbildung 8, unten).
5. Erstellen Sie einen separaten Ordner für jede Seite des Bildes (links und rechts) mit separaten Unterordner für die einzelnen Keimling für die Lagerung der einzelnen Zeitbildserie-Dateien.
6. Archivieren Sie die resultierende Ordner in eine komprimierte ZIP-Datei.

Ein Code, der diese Schritte vollendet wurde mit der Programmiersprache Python 20 entwickelt. Der Algorithmus ermöglicht eine Reduktion etwa 60% der Datenmenge und ist erfolgreich bei der Identifizierung aller einzelnen Sämlinge in 90% der Scanner imagE-Dateien analysiert, so weit. Die Codes stehen zum Download unter der GNU General Public License Version 3 frei verfügbar (siehe Materialien Tabelle).

Fig. 1 ist. Der Scanvorgang beginnt mit der Aussaat (bis zu neun Arabidopsis Samen pro Platte) und endet mit Datenspeicherung und Bildverarbeitung. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Abbildung 2. Emplate T für den Bau der Petrischale Unterstützung. Ple xiglas wurde geschnitten, so dass die Breite des Flachbett passen (in diesem Fall 227 mm) und die Länge betrug 128 mm. Zwei Kreise mit einem Durchmesser von 88 mm wurden aus dem verbleibenden Teil, so daß sie gleichmäßig über die Breite und Länge des Trägers verteilt geschnitten. Der Träger wurde auf dem Flachbett mit 3M Befehlsleisten befestigt. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Abbildung 3. Scanner-Konfiguration nach der Sämlinge wurden gravistimulated und das Dokument Abdeckung positioniert. Dies ist die Konfiguration des Scanners bei Schritt 1.21 von Scanner-Setup-und Bildsammlung."_blank"> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Abbildung 4. Screenshot der Einstellungen für Schritt 1.8 des Scanner-Setup-und Bildsammlung ausgewählt. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Abbildung 5. Screenshot der Software VueScan während der Schritte 1.9 und 1.10 der Scanner-Setup-und Bildsammlung. Die rote Box unterstreicht die Pflanzengröße, während der blaue Kasten werden spezifische Einstellungen fo r x-und y-Offset um Sämlinge und Label-Informationen zu erfassen eingesetzt. Der Bereich der Flachbett gescannt werden als gepunktete Linie im Vorschaubereich angezeigt. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Abbildung 6. Auswahl der Zielordner für Schritt 1.12 des Scanner-Setup-und Bildsammlung. @ Drücken der Taste neben dem Dialogfeld Default Folder (roter Pfeil) kann der Benutzer den entsprechenden Zielordner auswählen. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

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Abbildung 7 (AD). Die obigen Bilder sind Beispiele für die gesammelt unter Verwendung der in diesem Dokument beschriebenen Verfahren. Panels A, B und C, D sind die ersten und letzten Bilder jeweils von einem einzigen Scan Zeitraum. A, B zeigen die Voll gescannten Bereich, während C, D eine beschnittene Bereich des gescannten Bereichs, zeigt eine einzige Platte. Mehrere Inkonsistenzen beobachtet werden. Panel A zeigt die Variation in Keimung und Wachstum Weise. Feld B (die gleichen Sämlinge als Bild A; 9 Stunden später) zeigt, dass die Platten kann sich Kondenswasser ansammeln. Platten C und D gelten als gute Ergebnisse durch robuste Wachstum o seinf Sämlinge und Bildqualität über die gesamte Auflage. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Abbildung 8. Das entwickelte Bild-Kompressions-Algorithmus wandelt ein Bild, um Scanner-Skala (oben) grau. Das Bild wird in rechte und linke Hälften geteilt und Bildgrenzen werden entfernt (nicht gezeigt). Die Positionen der einzelnen Sämlinge auf jeder Hälfte werden von der Suche nach der Zeile mit dem größten Gesamtpixelintensität identifiziert. Diese Positionen werden verwendet, um eine neue Anbaufläche, auf alle Sämlinge auf der Platte (unten) angewendet definieren. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.