Mit Flachbett-Scanner mit hoher Auflösung zeitversetzt Bilder von der Arabidopsis-Wurzel gravitropen Antwort sammeln
25. Januar 2014
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur raschen Sammlung von Bildern von Arabidopsis Keimlingen Reaktion auf einen Reiz der Schwerkraft unter Verwendung von handelsüblichen Flachbettscanner. Die Methode ermöglicht kostengünstige, High-Volume-Erfassung von hochauflösenden Bildern zugänglich für Downstream-Analyse-Algorithmen.
Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist es, eine scannerbasierte Methode zur hochauflösenden Bilderfassung der tropischen Wurzelreaktion in der Modellpflanzenopsis zu veranschaulichen. Zu Beginn dieses Protokolls werden Samen aus dem vorgesehenen Saatgut auf Petrischalen gepflanzt, die ein transparentes Medium enthalten. Nachdem die Samen für den angegebenen Zeitraum gekeimt sind, werden Petrischalen aus der Wachstumskammer entnommen, für das Scannen vorbereitet und dann in vertikal ausgerichtete Flachbettscanner gelegt. Die Platten werden dann um 90 Grad gedreht und für einen bestimmten Zeitraum gescannt.
Die Bilder werden entweder auf dem Computer oder einem Datenträger gespeichert und später für die Bildbearbeitung verwendet. Bereiten Sie vor der Bildaufnahme Aga-Platten vor, die die beiden B-gescannten Pflanzengewebe enthalten. Nehmen Sie zunächst das angesammelte Kondenswasser auf dem Deckel und den Seiten der AGA-Platte mit einem Kim-Tuch auf.
Tragen Sie anschließend eine großzügige Menge Triton X 100 auf, um zukünftige Kondensation zu verhindern. Beenden Sie diesen Vorgang, indem Sie die Platte mit Mikroporenband umwickeln, um den Deckel zu sichern und die Belüftung zu ermöglichen, damit die Bildaufnahme beginnen kann. Richten Sie Ordner ein, um die Bilder am gewünschten Ort zu speichern.
Jeder Ordnername besteht aus einer Zusammenstellung von Metadaten, die sich auf die zu scannenden Informationen beziehen. In diesem Beispiel waren die eindeutige ID Alter, Größe und Saatgutbestand Daten, die in den Ordnernamen enthalten waren. Diese Metadaten können dann kopiert und in einen Ordnernamen eingefügt werden.
Dieses Protokoll geht davon aus, dass mehr als ein Scanner zum Erfassen von Bildern verwendet wird, und gibt Anweisungen zum Verbinden mehrerer Scanner mit einem Computer. Aus diesem Grund sind drei Ordner für das Speichern von Bildern eingerichtet. Der nächste Schritt besteht darin, die Timer für eine festgelegte Erfassungszeit festzulegen.
Da zu diesem Zeitpunkt noch einiges an Vorbereitungen zu erledigen ist, sollten Sie die Timer auf etwas mehr Zeit stellen. Schalten Sie als Nächstes den ersten Scanner ein und öffnen Sie das View-Scan-Programm. Legen Sie auf der Registerkarte Eingabe die Quelle auf den richtigen Scanner und das Dropdown-Feld für die automatische Wiederholung auf keine unter der Registerkarte Zuschneiden fest.
Stellen Sie den Vorschaubereich auf "Maximum" und drücken Sie auf "Vorschau". Wählen Sie einen Zuschneiderahmen, der den Interessenbereich erfasst, und legen Sie den Vorschaubereich auf Zuschneiderahmen fest. Zeigen Sie dann erneut eine Vorschau des Bildes an.
Um die gesammelten Daten am gewünschten Ort zu speichern, drücken Sie auf die Registerkarte Ausgabe und suchen Sie die zuvor erstellten Ordnernamen, die jedem Scanner entsprechen. Schalten Sie den nächsten Scanner ein Und wiederholen Sie den Ansichtsscan. Richten Sie eine Wegbeschreibung für die beiden anderen Scanner ein und stellen Sie sicher, dass Sie die richtigen Ordner auswählen, in denen die Daten gespeichert werden sollen.
Es ist auch wichtig, jede Registerkarte zu durchlaufen und sicherzustellen, dass alle Scannereinstellungen wie gewünscht sind. Unser Labor hat festgestellt, dass die folgenden Einstellungen für die Art der Bildsammlung, die durchgeführt wird, am besten funktionieren. Für verschiedene Arten der Bildsammlung sind jedoch möglicherweise andere Einstellungen erforderlich.
Nachdem Sie alle Einstellungen überprüft haben, wählen Sie die Registerkarte Eingabe und legen Sie das Dropdown-Feld für die automatische Wiederholung auf allen drei Scannern auf fortlaufend fest. Legen Sie die vorbereiteten Platten mit den Sämlingen horizontal ausgerichtet in die Scanner und legen Sie die Filzseite des Hintergrunds vorübergehend gegen die Platten, um die Stabilität im Scanner zu gewährleisten. Wenn Sie dieses Protokoll mit einem Partner durchführen, lassen Sie eine Person die Platten um 90 Grad drehen und sofort den gesichteten Hintergrund filzen, die andere Person drückt dann die Scan-Taste und beide sichern den Hintergrund mit einem Bungee-Seil am Scanner.
Wiederholt diesen Vorgang für die Scanner zwei und drei. Es sollte etwa zwei bis drei Minuten dauern, bis jedes Bild vollständig gescannt ist. Die endgültigen Bilder werden wie abgebildet angezeigt. Es ist eine gute Idee, die Ordner zu überprüfen, in denen die Bilder gespeichert werden, um sicherzustellen, dass alle ordnungsgemäß gespeichert werden.
Es ist ideal, die Scanner in einem Bereich aufzustellen, der für den vorgesehenen Zeitscan frei von Störungen ist. Es ist auch ratsam, die Umgebungsbedingungen im Scanbereich zu berücksichtigen, um ideale phänotypische Reaktionen zu gewährleisten. Die folgenden Bilder sind Beispiele für Bilder, die mit der in diesem Video beschriebenen Methode erfasst wurden.
Die Panels A und B sowie C und D sind die ersten und letzten Bilder einer einzelnen Scanperiode. A und B zeigen den gesamten gescannten Bereich. Während C und D ein beschnittener Bereich des gescannten Bereichs sind, der eine einzelne Platte zeigt, können einige Inkonsistenzen beobachtet werden.
Abbildung A zeigt die Variation der Keimung und des Wachstumsverlaufs. Bild B zeigt, dass sich bei den Platten Kondenswasser ansammeln kann, während die Bilder C und D aufgrund des robusten Wachstums der Setzlinge und der Bildqualität während des gesamten Laufs als gute Ergebnisse angesehen werden. Das in diesem Artikel beschriebene Verfahren passt in eine eigene Nische in der Welt der Wurzelbildgebung, da es einen hohen Durchsatz und eine hohe Auflösung bietet und dennoch relativ erschwinglich ist.
Ein weiterer Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass er leicht an die Bildgebungsanforderungen einer bestimmten Forschungsgruppe angepasst werden kann. Die Methode wird auch für die Bildgebung anderer angepasst.
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Aufnahme von hochauflösenden Bildern von Arabidopsis-Keimlingen als Reaktion auf Schwerkraft mithilfe von Flachbettscannern. Der Ansatz ist kostengünstig und ermöglicht die Sammlung einer großen Menge an Bildern, die für weitere Analysen geeignet sind.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Pflanzenbiologie
- Bildanalyse
- Wurzel-Tropismus-Reaktion
Hintergrund
- Arabidopsis dient als Modellorganismus in der Pflanzenforschung.
- Das Verständnis der Wurzelreaktionen auf Schwerkraft ist entscheidend für Studien zur Pflanzenentwicklung.
- Hochauflösende Abbildungstechniken verbessern die Datenerfassung für die phänotypische Analyse.
- Flachbettscanner bieten eine kostengünstige Lösung für die Hochdurchsatz-Bildgebung.
Zweck der Studie
- Eine scannerbasierte Methode zur Erfassung von Wurzeltropismus-Reaktionen demonstrieren.
- Die Sammlung von Bildern für die nachfolgende Analyse erleichtern.
- Ein anpassbares Bildgebungsprotokoll für Forschungsgruppen bereitstellen.
Verwendete Methoden
- Samen werden auf transparentem Medium in Petrischalen keimfähig gemacht.
- Die Platten werden mit vertikal ausgerichteten Flachbettscannern gescannt.
- Mehrere Scanner können zur Effizienzsteigerung an einen einzigen Computer angeschlossen werden.
- Die Einstellungen für die Bildaufnahme werden für optimale Ergebnisse angepasst.
Hauptergebnisse
- Die aufgenommenen Bilder zeigen Variationen in Keimungs- und Wachstumsverläufen.
- Es wurden Kondensationsprobleme an den Platten festgestellt, die die Bildqualität beeinträchtigten.
- Es wurden hochwertige Bilder erhalten, die ein kräftiges Keimlingswachstum belegen.
- Die Methode ermöglicht eine hochdurchsatzfähige und anpassbare Bildaufnahme.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet ein wirksames Mittel zur Abbildung von Wurzelantworten.
- Es ist an verschiedene Anforderungen in der Bildgebung innerhalb von Forschungsumgebungen anpassbar.
- Der Ansatz gewährleistet ein ausgewogenes Verhältnis zwischen Kosten und Effizienz bei der Datenerfassung.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Mithilfe der hochauflösenden phänotypischen Bildgebung der gravitropen Wurzelreaktion lässt sich die mechanistische Entlastung bei der frühen Zielvalidierung für die Entdeckung pflanzlicher Therapeutika ermöglichen. Dieser kostengünstige, hochdurchsatzfähige Bildgebungsansatz unterstützt die Vorhersagesicherheit in Genfunktionsstudien, indem er quantitative, zeitlich aufgelöste Daten erzeugt, die für nachgeschaltete Bildanalyse-Pipelines geeignet sind. Die Methode begegnet Skalierbarkeitsproblemen in der Entdeckungsbiologie und bewahrt gleichzeitig die Datenintegrität für eine translationale Kontinuität.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch quantitative Messung von Wurzelwachstumsverläufen als phänotypische Messgröße für Genfunktion.
- Operationaler Wert: Bietet biologische Entlastung durch hochdurchsatzfähige Erfassung von 216 individuellen Reaktionen pro Tag mit einer Auflösung von 4.800 dpi.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem umfangreiche hochwertige Bilddaten für Bildanalyseanwendungen generiert werden, die Wachstumsverlaufsunterschiede aufklären.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme (Arabidopsis-Keimlinge auf transparentem Medium) für standardisierte, reproduzierbare Screening-Verfahren mit Wirkstoffen oder genetischen Modifikationen vor.
- Operationaler Wert: Gewährleistet die Einsatzbereitschaft von Assays durch automatisierte, zeitraffende Bildaufnahme im Abstand von wenigen Minuten mithilfe kostengünstiger Flachbettscanner.
- Skalierbarkeitswert: Ermöglicht die Wiederverwendung der Plattform und deren Anpassung durch verschiedene Arbeitsgruppen dank eines anpassbaren Protokolldesigns und der Möglichkeit, mehrere Scanner an einen einzelnen Computer anzuschließen.
Translationale und präklinische Forschung
- Übertragbarer Wert: Erhält die kontinuierliche Relevanz des Krankheitsmodells von der Entdeckung bis zur phänotypischen Quantifizierung der Wurzel-Tropismus-Reaktion, einem konservierten Mechanismus in Modellorganismen.
- Mechanistische Entlastung von Risiken: Verringert die Unsicherheit bei der Zielvalidierung, indem die unabhängige Variable (Verschiebung des Schwerkraftvektors) isoliert und die abhängige Variable (korrigierendes Wachstum) mit hoher zeitlicher Auflösung gemessen wird.
- Vorhersagegenauigkeit: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen zur Weiterentwicklung, indem quantitative Ergebnisse bereitgestellt werden, die eine statistische Analyse von Variationen in Keimung und Wachstumsverlauf ermöglichen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Hypothesenprüfung bis hin zur Identifizierung von Leitstrukturen, indem sie standardisierte, quantitative phänotypische Daten liefert, die über Go/No-Go-Entscheidungen bei der frühen Zielvalidierung informieren.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen, indem sie die Beobachtung korrigierenden Wachstums in Keimlingswurzeln ermöglicht, die aus der Ausrichtung zum Schwerkraftvektor verschoben wurden.
- Screening: Gewährleistet Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays durch kontrollierte Plattenpräparation (Verhinderung von Kondensation mittels Triton X-100 und Micropore-Band) sowie einheitliche Protokolle zur Bildspeicherung.
- Analytik: Erzeugt zeitraffende Bilddatensätze mit einer Auflösung von 4.800 dpi, die für quantitative Messungen von Wachstumsverläufen und Keimungskonsistenz geeignet sind.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Forschung, indem sie phänotypische Endpunkte bereitstellt, die für Krankheiten relevant sind, in einem Modellsystem, das genetischen und pharmakologischen Eingriffen zugänglich ist.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare Bildgebungsmethode statt als Einmaltechnik, bedingt durch geringe Kosten, hohe Durchsatzleistung und einfache Anpassbarkeit über verschiedene Forschungsgruppen hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit bei der Zielvalidierung durch Verringerung mechanistischer Mehrdeutigkeiten bei der Phänotypisierung der gravitropen Reaktion.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit, erreicht durch automatisierte Scanning-Protokolle und metadatenbasierte Ordnerbenennung zur Datenorganisation.
- Strategischer Wert: Bessere Go/No-Go-Entscheidungen, Kapital-Effizienz und reduziertes biologisches Risiko in späteren Phasen durch frühzeitige phänotypische Risikominderung mittels hochdurchsatzfähiger, hochauflösender Bildgebung.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierungs- und Weiterentwicklungsentscheidungen, ermöglicht durch umfangreiche, qualitativ hochwertige Bilddaten, die Bildanalyseanwendungen unterstützen.
Durchführungsaspekte
- Notwendige wissenschaftliche Fachkenntnisse in der Pflanzenbiologie und in Bildaufnahmeprotokollen für die Arabidopsis-Wurzelabbildung.
- Zu den instrumentellen Anforderungen gehören vertikal ausgerichtete Flachbettscanner mit einer Auflösung von 4.800 dpi und Anschlussfähigkeit an einen einzelnen Computer für den Betrieb mehrerer Scanner.
- Die Standardisierung über Teamgrenzen hinweg erfordert eine einheitliche Plattenpräparation (Kondensationskontrolle mittels Triton X-100 und Micropore-Band) sowie eine metadatenbasierte Ordnerbenennung zur reproduzierbaren Datenspeicherung.
- Anpassungsüberlegungen bei verschiedenen Modellsystemen beinhalten die Anpassung der Scannerausrichtung und der Plattenpräparation entsprechend unterschiedlicher Keimlingsgrößen und Wachstumsbedingungen.
- Zu den praktischen Einschränkungen zählen die Kontrolle von Kondensation auf den Platten und die Gewährleistung einer stabilen Keimlingsausrichtung während der 90-Grad-Drehung zur Induktion der Gravitropie.
